Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Генетическая инженерия 16.09.14

.pdf
Скачиваний:
71
Добавлен:
24.03.2015
Размер:
5.12 Mб
Скачать

Введение в генетическую инженерию: молекулярные механизмы, методы и практика.

Профессор, д.б.н., А.К.Гапоненко, Главный научный сотрудник Института Биологии Развития им. Н.К.Кольцова РАН.

В кратком курсе лекции невозможно изложить многие аспекты современное положение и перспективы генетической инженерии растений. Мы рассмотрим следующие, на мой взгляд, наиболее интересные вопросы.

1.Смена парадигмы современной генетики. В 2006 г. Эндрю Файер и Крейг Мелло за изучение РНК-интерференции у нематоды получили Нобелевская премию .

2.иРНК интерференция как способ «замолкания» генов

3.Эволюцию определения гена

4.Что такое рестрикционные ферменты

5.Понятие о плазмидах и векторах

6.Основные этапы генных манипуляций

7.Клонирование генов

8.Трансгенные животные 9.Начало эры генетической инженерии растений, ее основатели. 10.Маркерные и селективные гены

11.Агробактериальная и биобаллистическая генетическая трансформация растений 12.Некоторые научные результаты.

13.Наиболее впечатляющие практические свершения.

14.Синтетическая живая клетка КРЕЙГА ВЕНТЕРА

МОЛЕКУЛЯРНО-

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

ОСНОВЫ

ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ИНЖЕНЕРИИ

История определения понятия ген с 1860 года до программы ENCODE

Определение 1860 – 1900х: «Ген – это дискретная единица наследственности»

Первоначальные понятия гена основывались на выделении отличительного признака организма и его наследуемости. Слово ген впервые использовал Вильгельм Иоганнсен (Wilhelm Johannsen) в 1909 году, основываясь на концепции Грегора Менделя (Mendel 1866). Слово ген – производное от пангена, которое использовал Гуго де Фриз (Hugo De Vries) для сущностей, вовлеченных в пангенез – гипотетическую теорию наследственности Дарвина.

Определение 1910х: «Ген – это отдельный локус»

Следующее важное открытие сделал американский генетик Томас Хант Морган (Thomas Hunt Morgan) со своими студентами, изучая расщепление мутаций у плодовых мушек Drosophila melanogaster. Они предложили модель, в которой гены расположены линейно и их способность к обмену (кроссоверу)

пропорциональна расстоянию между ними.

Определение 1940х: «Ген – это чертеж белка»

Изучая метаболизм у гриба Neurospora, Бидл и Тейтем (Beadle and Tatum 1941) обнаружили, что мутации в генах могли вызывать дефекты в звеньях метаболических путей. Это привело к определению «один ген – один фермент», которое впоследствии преобразовалось в «один ген – один полипептид».

Определение 1950х: «Ген – это физическая молекула»

Тот факт, что рентгеновские лучи могут вызывать мутации, показал, что наследственность имеет физическую молекулярную основу (Muller 1927). Следующим доказательством была демонстрация Гриффитом (Griffith 1928) того, что живые невирулентные штаммы бактерии Pneumococcus могут извлекать нечто из вирулентных, но мертвых штаммов и превращаться в вирулентные. Позднее выяснилось, что это вещество может разрушаться под действием фермента ДНКазы (Avery et al. 1944). В 1955 году Херши и Чейз установили, что веществом, которое передается бактериофагом своему потомку, является ДНК, а не белок (Hershey and Chase 1955).

Определение 1960х: «Ген – это транскрибируемый код»

Трехмерная структура ДНК, открытая Уотсоном и Криком (Watson and Crick 1953), позволила объяснить механизм, обеспечивающий ее функции в качестве молекулы наследственности. Спаривание оснований показало, как генетическая информация может копироваться, а существование двух нитей ДНК – как случайные ошибки репликации могут приводить к мутациям в одной из дочерних копий ДНК. Начиная с 1960 года молекулярная биология развивалась в ускоренном темпе. В 1965 году обнаружили, что молекулы РНК – копии (транскрипты) последовательностей ДНК, кодирующих белки – преобразуются (транслируются) в аминокислотные последовательности

(Nirenberg et al. 1965, Söll et al. 1965).

Определение 1990х-2000х: «Аннотированная структурная единица генома, зарегистрированная в одной из баз данных» (современный взгляд, до ENCODE)

По определению Human Genome Nomenclature Organization, «Ген – это «сегмент ДНК, влияющий на

фенотип или функцию. В отсутствие проявленной функции ген может быть охарактеризован последовательностью, транскрипцией или гомологией» (Wain et al. 2002).

Согласно определению Sequence Ontology Consortium, «Ген – это «локализуемый участок последова-

тельности генома, соответствующий единице наследственности, которая ассоциирована с регуляторными, транскрипционными и другими функциональными участками последовательности» (Pearson 2006).

В 2003 ГОДУ ОПУБЛИКОВАЛИ ЧИСЛО КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ ГЕНОВ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА, И СТАЛО ЯСНО, ЧТО МЫ ОЧЕНЬ МАЛО ЗНАЕМ О ГЕНАХ, КОДИРУЮЩИХ РНК.

Современная компьютерная аналогия: «Ген – это подпрограмма в операционной системе генома»

Перевод: Дарья Червякова, Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» http://www.cbio.ru/

Эволюция понятия ген

Недавно завершилась описание 1% генома человека в рамках программы ENCODE [The ENCODE (the ENCyclopedia of DNA Elements)Project Consortium 2007]. Задачей этой программы является характеристика функциональных элементов генома. В ходе проекта ENCODE, направленного на выявление функциональных элементов в геноме, обнаружились сложные элементы регуляции и транскрипции, рассыпанные по геному, а также масса генов, кодирующих РНК. Новые данные поставили под вопрос корректность Современное определение гена:

ГЕН — СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЕДИНИЦА НАСЛЕДСТВЕННОСТИ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ. «ГЕН ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ УЧАСТОК ДНК, ЗАДАЮЩИЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ОПРЕДЕЛЁННОГО ПОЛИПЕПТИДА ЛИБО ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РНК»

Новое определение гена формулируется так:

«Ген – это совокупность геномных последовательностей, кодирующих сцепленный набор потенциально перекрывающихся функциональных продуктов».

В этом определении не упоминаются сложные аспекты регуляции и транскрипции и утверждается, что с одним геном могут быть ассоциированы группы функциональных продуктов гена (а не промежуточные транскрипты).

Gerstein MB, Bruce C, Rozowsky JS, Zheng D, Du J, Korbel JO, Emanuelsson O, Zhang ZD, Weissman S, Snyder M. What is a gene, postENCODE? History and updated definition, Genome Research 17:669-681, 2007. PMID: 17567988

Молекула ДНК – полимер, состоящий из двух цепочек нуклеотидов

Каждый нуклеотид состоит из

азотистого

основания

моносахарида

рибозы или дезоксиорибозы

остатка

фосфорной

кислоты

Азотистые основания в ДНК бывают четырёх типов

аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) и цитозин (Ц).

Вдоль нити ДНК азотистые основания прочно связаны между собой через моносахарид и остаток фосфорной кислоты фосфодиэфирной связью, между цепочками – через водородные связи

аденин комплементарен тимину,

гуанин – цитозину

Количественное соотношение нуклеотидов в молекуле ДНК известны в виде правил Чаргаффа

ΣА = ΣТ или ΣА / ΣТ = 1

ΣГ = ΣЦ или ΣГ / ΣЦ = 1

Σ(А + Г) = Σ(Т + Ц) или Σ(А + Г) / Σ(Т + Ц) = 1

Количество комплементарных оснований А + Т и Г + Ц у разных видов живых организмов различно

Отношение Σ(Г + Ц) / Σ(А+ Т) является важнейшей характеристикой ДНК, как показатель специфичности её нуклеотидного состава

Информационная РНК (иРНК)

Информационная РНК – полимер, состоящий из одной цепочки нуклеотидов. В состав нуклеотидов также входят азотистые основания, моносахарид рибоза и остаток фосфорной кислоты

Азотистых оснований в РНК также четыре: аденин, урацил, гуанин, цитозин