Практикум по генетике

Клеточный фермент, который осуществляет полимеризацию нуклеотидов на одноцепочечной ДНК-матрице называют – ДНК-

полимераза. Так, бактерия кишечной палочки (прокариотический организм) имеет три фермента, которые осуществляют полимеризацию нуклеотидов с образованием новой цепи ДНК. Это ДНК-полимераза I,

ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III.

ДНК-полимераза I способна реплицировать небольшие участки ДНК и кроме полимеризации ДНК обладает еще двумя активностями.

Одна из них, это способность удалять неспаренный нуклеотид на 3’-конце ДНК (3’ - 5’ – экзонуклеаза), так называемая корректирующая способность, а вторая состоит в отщеплении нуклеотидов в двойной спирали ДНК с 5’-конца (5’-3’-экзонуклеаза). Эти две реакции имеет важное биологическое значение.

ДНК-полимераза I участвует в реакциях репликации и репарации.

ДНК-полимераза II способна реплицировать ДНК в условиях, в которых матрица может быть повреждена.

ДНК-полимераза III это основной фермент, который ответственен за репликацию хромосомной ДНК кишечной палочки. В каждой клетке содержится всего 10-20 копий этого фермента.

Все известные ДНК-полимеразы обеспечивают строительство новой цепи на матрице в направлении 5’→3’. Это связано с корректирующей способностью ДНК-полимеразы. Такой рост цепи называется «от головы к хвосту». Если бы цепь строилась в направлении 3’→5’, то фермент не был бы способен к коррекции своих ошибок (рис. 5-7).

Особый регион молекулы ДНК, где происходит инициация репликации ДНК, называется ориджин (ori) репликации. Ориджин репликации имеет нуклеотидную последовательность, узнаваемую специальными инициаторными белками. Участок ДНК с ориджином репликации формирует репликон. Кольцевая молекула кишечной палочки,

с одним ориджином репликации составляет один репликон. У эукариот

191

молекула ДНК (хромосома) имеет множество сайтов инициации репликации. Однажды инициировавшись, репликация ДНК может происходить неограниченно долго. ДНК-полимераза III обладает высокой процессивностью, т.е. прикрепившись к ДНК-матрице она синтезирует всю цепь ДНК.

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

Рис. 5.7. Все известные ДНК-полимеразы полимеризуют нуклеотиды в направлении 5’→3’.

В 1960 г. на реплицирующихся хромосомах импульсная метка Н – тимидин выявила особую четко ограниченную область репликации,

перемещающей вдоль родительской спирали. Это активная область из-за своей V- образной формы была названа репликационной вилкой. Именно в этой области синтезируются дочерние молекулы ДНК.

Как происходит синтез с участием ДНК-полимеразы? Установлено,

что синтез одной цепи, называемой лидирующей, протекает в направлении роста репликативной вилки от 5’→3’ непрерывно, а синтез второй,

отстающей, в направлении, противоположном движению вилки,

192

небольшими отрезками ДНК, которые синтезируются также от 5’→3’ (рис. 5.8). Образующиеся фрагменты называют фрагментами Оказаки. Они имеют размер у прокариот 1000-2000 нуклеотидов, а у эукариот 100-200

нуклеотидов. По мере движения репликативной вилки концы соседних фрагментов Оказаки соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи.

Рис. 5.8. Цепь, которая синтезируется в направлении расплетения ДНК называется ведущей.

Для того, чтобы матричная цепь стала доступной для ДНК – полимеразы, необходимы особые белки. Они бывают двух типов:

ДНК-геликазы – фермент, который соединяется с одной из цепей ДНК,

катализирует гидролиз АТР. Гидролиз АТР изменяет форму белка,

вследствие чего белок производит механическую работу, разрушая двойную спираль. С образовавшейся одноцепочечной ДНК соединяются

SSB-белки. Комплекс ДНК и SSB-белков способствует нормальной работе ДНК-полимеразы.

Все известные ДНК-полимеразы начинают синтез путем присоединения дезоксирибонуклеозидтрифофатов к уже имеющемуся 3’

концу полинуклеотидной цепи. Т.е. для работы ДНК-полимеразы

193

необходима затравка или праймер – короткий участок двухцепочечной молекулы. Один из важных механизмов – коррекция ошибок при репликации зависит от этих особых свойств ДНКполимеразы. ДНК-

полимераза не способна синтезировать праймер, эту реакцию осуществляют специальный фермент, называемый праймаза, который синтезируют затравку. Этот фермент синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов короткие РНК-затравки (праймеры) (у

эукариот от 2-10 н.). На ведущей цепи для работы ДНКполимеразы затравка создаѐтся один раз. На отстающей цепи эти затравки синтезируются с определенным интервалом, по мере расплетения двойной спирали. Праймаза функционирует в комплексе с геликазой, формируя комплекс называемый праймосома, который прикрепляется к отстающей цепи. После синтеза праймеров они достраиваются ДНК–полимеразой III.

Затем в дело вступает ДНК-полимераза I, которая быстро удаляет РНК-

затравку. Завершает этот процесс ДНК – лигаза. Фермент, который катализирует образование фосфодиэфирных связей (рис. 5.9).

Рис. 5.9. Репликативная вилка с ферментами репликации (J. Watson et.al., 1998).

Предполагается, что две копии ДНК-полимеразы III, праймосома и геликаза формируют так называемую реплисому. Это мультиферментный

194

комплекс, который может обеспечивать удлинение лидирующей цепи и одновременно инициацию праймерной РНК, а также достраивание ДНК при синтезе отстающей цепи.

Поскольку молекулы ДНК состоят из двух цепей, которые закручены друг вокруг друга, определенные операции, например,

репликация ДНК, встречают определенные трудности. На каждые 10 пар нуклеотидов приходится виток спирали – 3600. По мере расплетения двойной спирали, сегменты ДНК, находящиеся перед репликационной вилкой, становятся более плотно скручены. Дальнейшее перемещение вилки становится невозможным. Следовательно, чтобы репликационная вилка двигалась вперед, хромосома должна очень быстро вращаться.

Однако вращение очень длинных цепей ДНК вокруг длинных же осей механически затруднено в ядре. При репликации ДНК эта проблема решается с помощью специального класса белков – топоизомераз.

В кольцевых геномах непрерывный рост лидирующей и отстающей цепей вдоль кольцевой матрицы неизбежно приводит к совмещению 3’-гидрокси и 5’- фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала, либо – при двунаправленной репликации в середине кольца.

В линейных ДНК после инициации синтеза новой цепи и последующего удаления РНК-праймера новосинтезированная цепь содержит пробел на 5’-конце. Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что концевые области эукариотических хромосом

– теломеры – реплицируются с помощью особого механизма. У человека в репликации теломер участвует особый фермент – теломераза.

В эукариотических клетках идентифицировано множество ДНК-

полимераз, но их физические и функциональные свойства изучены менее детально, чем у прокариот:

ДНК-полимераза α – участвует в репликации ДНК, возможно необходима для синтеза отстающей цепи.

195

ДНК-полимераза β – участвует в репарации хромосомной ДНК.

ДНК-полимераза γ – отвественна за репликацию митохондриальных геномов.

ДНК-полимераза δ – вероятно является основной полимеразой,

реплицирующей хромосомную ДНК.

Поскольку ДНК-полимеразы млекопитающих лишены экзонуклеазных активностей эту функцию выполняют вспомогательные белки. Например,

в удалении праймеров у млекопитающих участвуют РНКаза Н1 и

белковый комплекс FEN1/RTH1.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Что такое репликация ДНК? Ферменты репликации.

2.Укажите направление синтеза ДНК. Ведущая и отстающая цепи.

3.Как происходит терминация репликации?

4.Опишите процесс репликации у эукариот.

5.Обозначьте направление репликации, лидирующую и отстающую

цепи.

3’

5’

3’

5’

196

6. Обозначьте ферменты в репликационной вилке.

5.4 Транскрипция

Все живые организмы синтезируют белки, которые закодированы в их последовательности ДНК. Виды белков, которые синтезируются в клетке, определяют вид самих клеток. Следовательно, генетический материал определяет вид и количество протеинов, которые синтезирует клетка. Посредником между участком ДНК, который кодирует какой-то белок и самим белком служит молекула РНК, называемая матричной.

Такая РНК определяет какие аминокислоты и в какой последовательности будут включены в белок. РНК служит посредником между ДНК и белком.

Синтез молекулы РНК на молекуле ДНК называется транскрипцией.

Молекулы РНК короче ДНК, т.к. являются копиями участков ДНК,

ограниченных длиной достаточной для кодирования одного белка. У

прокариот транскрипция РНК контролируется особым ферментом РНК-

полимеразой. Так, клетка кишечной палочки имеет около 3000 молекул РНК-полимеразы. Использую ДНК как матрицу, этот фермент полимеризует на ней рибонуклеотиды, копируя таким образом последовательность нуклеотидов ДНК в последовательность нуклеотидов РНК.

Из особенностей процесса транскрипции можно отметить следующие:

• Транскрипцию осуществляет РНК-полимераза

197

•РНК-полимераза синтезирует РНК в направлении 5’→3’

•РНК синтезируется по правилу комплементарности

•РНК-полимераза не требует для начала синтеза праймер

•РНК-полимераза не корректирует ошибки (у прокариот)

Процесс транскрипции состоит из трех этапов:

1.Инициация – начало синтеза РНК, сборка транскрипционного комплекса на точке начала транскрипции – промотор.

2.Элонгация – синтез молекулы РНК.

3.Терминация транскрипции, транскрипция заканчивается в области, называемой терминатор.

РНК-полимераза состоит из двух частей: кора и сигма-фактора. Кор выполняет функцию полимеризации нуклеотидов, а сигма фактор включен в процесс определения точки начала репликации. Выполнив функцию инициации сигма-фактор диссоциирует от кора.

198

Регион ДНК, с которым связывается РНК-полимераза перед началом транскрипции называется промотор. При изучении промоторов у прокариот было найдено два консервативных участка, играющих ключевую роль:

Прибнов –бокс: последовательность, расположенная на расстоянии примерно 10 нуклеотидов до точки начала транскрипции.

–35- последовательность: расположена на расстоянии примерно 35

нуклеотидов до начала транскрипции (рис. 5.10).

Рис. 5.10. Промотор рибосомального гена rrB кишечной палочки

Инициаторный комплекс, который образуется на промоторе до начала синтеза, называется закрытым. После транскрипции примерно 5-10

нуклеотидов сигма-фактор диссоциирует. Связывание РНК-полимеразы с промотором вызывает расплетение двойной спирали ДНК и образование

«открытого промоторного комплекса» (рис. 5.11).

Рис. 5.11. Структура открытого промоторного комплекса (из

http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/c7.17.7b.transcription.jpg модификациями)

199

Эукариоты, в отличие от прокариот имеют 3 РНК-полимеразы.

РНК-полимераза I осуществляет транскрипцию только рибосомной РНК.

РНК-полимераза II осуществляет транскрипцию большинства генов РНК-полимераза III осуществляет синтез 5S-рибосомального гена, тРНК и малых ядерных РНК.

В 1977 г. молекулярные биологи были изумлены обнаружив, что у большинства эукариотических генов кодирующая последовательность

(экзон), чередуется с некодирующими (интрон). В результате транскрипции эукариотических генов образуется первичный транскрипт,

называемый гетероядерная РНК (рис. 5.12).

	Кодирующая область
	Экзоны
промотор	терминатор

1

2

3

4

5

Интрон А

Интрон В

Интрон С Интрон D

Транскрипция

G

ААААААА

Первичный транскрипт

Процессинг

G

Функциональная мРНК

ААААА

Трансляция

Белок

Рис. 5.12. Схема работы эукариотического гена

Три главных изменения происходят с первичным транскриптом

(процессинг) прежде чем он будет перенесен в цитоплазму, где осуществляется трансляция:

-удаление из него интронов (сплайсинг)

-добавление к 5’-концу – 7- метилгуанозина – структура, называемая КЭП

-добавление к 3’-концу – поли А.

200