Серологические реакции

Наименование реакции

Реакция агглютинации

РНГА

Реакция преципитации

Реакция нейтрализации токсина анатоксином

Наименование и характеристика ингредиентов реакции:

1. антиген

2. антитело

3. дополнительный (неспецифический) компонент

1. АГ (агглютиноген) – микробы, другие клетки или частицы, носители антигена

2. АТ агглютинины класса IgM и IgG

3. Электролит

1. Растворимые АГ, токсины, гаптены

2. Эритроцитарный диагностикум - эритроциты (0-1 группы человека или барана) после обработки танином или формальдегидом

3. Электролит

1. Растворимые АГ(преципитиногены)

2. Специфические АТ сыворотки

3. Электролит

1. Белковые токсины бактерий

2. Антитоксины

Механизм реакции

В основе реакции лежит механизм образования «решетки»: в 1-ой фазе реакции поливалентные антигены и двухвалентные антитела образуют комплексы по типу решетки; во 2-ой фазе в присутствии электролита снижается заряд комплексов {Аг-Ат}, уменьшается растворимость и образуются видимые аггломераты (хлопья), выпадающие в осадок.

Комплексы АГ-АТ связываются между собой по типу «решетки». В присутствии электро­лита, вследствие снижения заряда и уменьшения растворимости, про­исходит агглютинация комплексов, образуются хлопья, позволяющие визуально учесть результат реакции.

Полидетерминантные АГ, представляющие собой прозрачный коллоидный раствор, и двухвалентные АТ (преципитирующие АТ принадлежат к классу IgG) образуют комплексы по типу решетки, в присутствии электро­лита, снижается заряд и уменьшается растворимость, преципитат выпадает в осадок.

Взаимодействии между экзотоксином (антигеном) и специфиче­ской антитоксической сывороткой (антитеаом — антитоксином), в результате чего образуется комплекс «антиген + антитело», и экзотоксин теряет свои токсические свойства.

Методы постановки

Реакция агглютинации на предметном стекле.

На предметное стекло наносят каплю диагностической сыворотки (разведена физиологическим раствором 1:10-1:20) и каплю физиоло­гического раствора. Испытуемую культуру вносят сначала в контрольную каплю физиологического раствора, а затем в каплю диагностической сыворотки.

Развернутая реакция агглютинации в пробирках.

В штативе устанавливают 7 про­бирок, первые 5 -опытные, 6-я и 7-я - контрольные. В опытных пробирках готовят серийные 2-кратные разведения испы­туемой сыворотки в объеме 1,0 мл. В каждую опытную пробирку вносят по 3 капли диагностикума.

Контроли: контроль антигена, контроль сыворотки

Штатив с пробирками помещают на 2 часа в термостат при 37°С, Окончательный учет проводят на следующий день, после выдерживания пробирок при комнатной температуре.

Реакцию ставят на 96-луночных полистероловых планшетках. Исследуемую сыворотку предварительно инактивируют при 56°С в течение 30 минут для уничтожения компле­мента, готовят двукратные разведения (от 1:20 до 1:12000 и более) и разливают в лунки по 0,1 мл. К каждому разведению добавляют по 0,1 мл эритроцитарного диагностикума.

Контроли РНГА - сенсибилизированные эритроциты (диагности-кум) с физиологическим раствором; несенсибилизированные эри­троциты с физиологическим раствором ; несенсибилизированные эритроциты с исследуемой сывороткой .

После 2 часов инкубации в термостате при 37°С или при комнат­ной температуре учитывают реакцию и определяют титр исследуемой сыворотки.

Реакция кольцепреципитации

В узкие пробирки (диаметром не более 0,5 см, иначе результат «расплывается») наливают 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 затем наслаивают 0,1 -0,2 мл исследуемого преципитиногена (если необходимо определить титр преципитиногена, то его берут в разных разведениях). Учет реакции проводят через 1-5 минут.

При положительной реакции на границе появляется непрозрачный преципитат в виде мутного кольца.

Реакция в геле

Расплавленный и немного остуженный 3% агар смешивают в соотношении 1:1 со специфической иммунной сыворот­кой. Полученную смесь наливают тонким слоем на обезжиренную стеклянную пластину. В застывшем геле пробойником вырезают лунки , в которые вносят исследуемый антиген. Пластины инкубируют в течение 24-48 часов при комнатной температуре.

Реакция нейтрализации in vivo. Исследуемый материал, в котором предполагают присутствие экзотоксина (определяемый антиген) смешивают со специфической антитоксической сывороткой (известные антитела), выдерживают смесь в термостате и затем вводят лабораторным животным (чаще используют мышей или морских свинок). Если произошла реакция нейтрализации , то животные остаются живыми.

Реакция in vitro.

В пять пробирок наливают по 2,0 мл токсина и возрас­тающие количества испытуемой антитоксической сыворотки . После инкубации при 45°С в течение 30 мин отмечают пробирку, где раньше всего наступила флоккуляция и имеется соответствие количества токсина количеству международных единиц сыворотки. В про­бирках справа находятся смеси ингредиентов с преобладанием антитоксина, а в пробирках слева -смеси в с превышением антигена

Внешнее проявление реакции

Образование видимых глазу аггломератов – хлопьев.

«Зонтик» или «пуговка»

Образование кольца или дуги преципитации.

Флокуляция

Титр реакции

Титром сыворотки считается наибольшее (последнее) раз­ведение сыворотки, в котором еще наблюдается четкая реакция агглютинации.

За титр РНГА принимают максимальное разведение сыворотки, дающее положительную реакцию в виде зонтика.

Титром реакции кольцепреципитации называется то наибольшее разведение преципитиногена, в котором еще образуется кольцо пре­ципитата.

Титром антитоксической сыворотки считается количество ME в 1 мп сыворотки.

Цели постановки

Применяют в серодиагно­стике инфекционных заболеваний, при которых формируются анти­бактериальный иммунитет гуморального типа,

РНГА применяется для серодиагностики многих инфекционных заболеваний а также в диагностике неинфекционной патологии.

Для выявления антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с ис­пользованием известных антигенов-диагностикумов.

Для выявления в исследуемом материа­ле экзотоксина с помощью известной стандартной диагностической антитоксической сыворотки.

Наименование реакции

Бактериолиз

Имунный гемолиз

РСК

ИФА

МИФ

Наименование и характеристика ингредиентов реакции:

1. антиген

2. антитело

3. дополнительный (неспецифический) компонент

1.Корпускулярный АГ от живых бактерий

2.АТ – бактериолизины

3. Система комплемента

1.Корпускулярный АГ эритроцитов барана

2. АТ - гемолизины

3. Система комплемента

1. корпускулярный или растворимый АГ

Эритроциты барана

2.Комплементовсязывающие АТ

АТ-гемолизины

3. Система комплемента

1. АГ, меченые ферментами

2. АТ меченые ферментами

3. Субстрат и хромоген

1. м/о, АГ, отпечаток или срез с зараженной ткани

2. Спец. АТ, конъюгированные с флюорохромными кр.

3. Флюорохромные красители

Механизм реакции

Растворение бактерий в присутствии специфических АТ-бактериолизинов и комплемента. Многие виды бактерий не способны к лизису поэтому р-я применяется редко

Растворение эритроцитов в присутствии специфических АТ-гемолизинов и комплемента

Сложная серологическая реакция в которой участвуют 2 системы АГ-АТ, основная, индикаторная, а также комплемент

Используют 2 метода – прямой и непрямой

Методы постановки

Реакция бактериолиза in vitro. Ингре­диент: живые бактерии, специфические к ним антитела (иммунная сыворотка), комплемент.

В опытную пробирку вносят взвесь живых бактерий, специфиче­скую иммунную сыворотку и комплемент, в контрольную пробирку-те же бактерии, нормальную сыворотку (без специфических антител) и комплемент. После инкубации в течение 2 часов при 37°С из каждой пробирки делают высевы по 0,1 мл на чашки Петри с мясо-пептонным агаром. Опыт учитывают после суточной инкубации. На чашке с высе­вом из опытной пробирки колоний должно быть значительно меньше, чем в контроле (или они отсутствуют).

Определив титр и рабочую дозу участвующих в опыте ингредиентов, ставят основной опыт РСК (таблица 11). После внесения в пробирку всех ингредиентов проводят первую фазу инкубации при температуре 37°С в течение 30 минут (или на холоде при 0-4°С в течение 18-20 часов, что повышает чувствительность реакции).

Вторую фазу ставят, добавляя в пробирки с первой системой сенсибилизированную гемолитическую систему (эритроциты барана и гемолитическую сыворотку), пробирки встряхивают и инкубируют при 37°С 20-30 минут.

Положительная реакция проявляется в виде задержки гемолиза.

Прямой метод ИФА для обнаружения антигена

В плоскодонных лунках полистероловых пластин сорбируют специфические антитела к определяемому анти­гену. В эти же лунки вносят исследуемый антиген. При инкубации на твердой фазе образуется комплекс {Ат-Аг}. После инкубации лунки несколько раз промывают буферным раствором . Затем в лунки вносят мечен­ные ферментом антитела, называемые конъюгатом, против искомого антигена. Полистероловые пластины вновь инкубируют и затем тща­тельно промывают лунки. Образуется комплекс {AT-Ar-AT фермент}. Далее в лунки вносят смесь субстрата с хромогеном.

Непрямой метод ИФА для выявления антител в исследуемой сыворотке В лунках планшета сорбируют известный (специфический) анти- ' ген и добавляют испытуемую сыворотку больного. Далее добавляют конъюгат - меченные фер-ментом пероксидазой антитела против глобулинов человека, которые присоединяются к антителам испытуемой сыворотки Образовавшийся комплекс {Аг-Ат-Ат^{фермент}} выявляется после инкубации / с субстратом - пероксидом водорода и хромогеном

Прямой МИФ. Готовят препарат, который, возможно, содержит исследуемые антигены Препарат фиксируют жидким фиксатором, обрабатывают специфической люминесци­рующеи антимикробной сывороткой 15-30 минут во влажной камере. Тщательно отмывают препарат и высушивают. Готовый микропрепарат рассматривают в люминесцентном микроскопе. Светящиеся ярко-зеленые изобра­жения микроорганизмов свидетельствуют об образовании иммунных комплексов, что позволяет их идентифицировать

Непрямой МИФ. Микропрепарат, приготовленный и фиксиро­ванный как в прямом методе, сначала обрабатывают обычной специфи­ческой, не меченой диагностической сывороткой, полученной путем иммунизации кролика. После инкубации мазок отмывают буферным раствором от не связавшихся антител, окрашивают люминесцирующеи антиглобулиновой сывороткой против глобулинов кролика, инкуби­руют во влажной камере и снова промывают. При люминесцентной микроскопии будут видны светящиеся изображения антигенов

Внешнее проявление реакции

Сокращение количества колоний

Жидкость в пробирке становится ярко-розового цвета и прозрачная «лаковая кровь»

Жидкость прозрачная, выпадает осадок.

Окрашивание

Свечение в УФ-лучах

Титр реакции

Максимальное разведение специфической иммунной сыворотки при котором наблюдается лизис данного вида м/о в присутствии комплемента

Содержимое пробирки с наименьшим количеством комплемента, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.

Цели постановки

Определение активности комплемента или гемолитической сыворотки

В РСК в качестве второй индикаторной системы

Серодиагностика инфекционных заболеваний

Выявление искомых АГ и АТ в минимальной концентрации

Выявление АТ в исследуемых сыворотках