Биотехнология. Векторные молекулы / лекция 7
.rtfЛЕКЦИЯ 7.
Векторные системы.
Плазмиды.
Вектором (лат. – переносчик, носитель) в ГИ называют молекулу ДНК, способную самостоятельно реплицироваться, включать чужеродную ДНК, переносить ее в реципиентные клетки и стабильно там поддерживать. Векторы используют для создания in vitro молекул рекДНК и для последующего введения их в клетки, в составе, которых они клонируют (умножают) число чужеродных генов.
Требования к вектору.
1. Вектор должен длительное время существовать в популяции клеток-
хозяев, т.е. реплицироваться автономно или вместе с хромосомами клеток.
2. В любом векторе должны быть биохимические или генетические маркеры,
которые позволяли бы обнаруживать его присутствие в клетках.
3. Структура вектора должна допускать встраивание в нее чужеродной
последовательностей нуклеотидов без нарушения ее функциональной
целостности. Это значит, что вектор должен содержать хотя бы один
единичный сайт рестрикции.
Классификация векторов.
По области использования:
1. Векторы общего назначения (клонирование генов, кДНК или любых
фрагментов ДНК). кДНК (одноцепочные ДНК, полученные с помощью
ревертаз);
2. Векторы для экспрессии клонированных генов (синтез мРНК и белков).
3. Специализированные векторы (секвенирование и мутирование генов и
т.д.).
По происхождению:
1. Плазмидные
2. Фаговые
3. Гибридные (сочетают свойства плазмид и фагов.
По структуре ДНК:
1. Кольцевые
2. Линейные
По способу поддержания в клетке:
1. Автономные (реплицирующиеся самостоятельно)
2. Интегративные (реплицирующие в составе клеточной хромосомы
По числу молекул в клетке:
1. Малокопийные (несколько копий)
2. Мультикопийные (десятки копий)
По числу репликаторов, имеющихся в векторном геноме:
1. Моно-
2. Бирепликонные, их также называют челночными, если они могут
реплицироваться в клетках различных видов
ПЛАЗМИДЫ.
Наиболее пригодны на роль векторов – естественные репликоны небольших размеров: ДНК плазмид и вирусов (в т.ч. фагов), а также фрагменты хромосом эукариотических клеток, но непосредственно в этом качестве их используют редко. Обычно их модифицируют или комбинируют их части для того, чтобы они отвечали определенным требованиям. Самые распространенные плазмидные векторы клеток E. coli – плазмида pBR322 и ее производные. Буквы B и R указывают на авторов Ф. Боливара и Р. Родригеса. Длина плазмиды 4361 п.н., Этот вектор полностью секвенирован, содержит репликатор от плазмиды pMB1 и сохраняет от нее свойство мультикопийности (15-20 копий на клетку) и способность к амплификации в присутствии хлорамфеникола левомицетина).
Репликатор – участок ДНК, ответственный за инициацию репликации.
Репликон – молекула ДНК или ее участок, находящиеся под контролем репликатора.
Из двух других плазмид в pBR322 переданы два гена устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрациклину, это позволяет вести отбор трансформантов по их устойчивости к одному антибиотику, а клоны с рекДНК выявлять после перепечатки трансформантов на соответствующие чашки по их чувствительности к другому антибиотику. Гены устойчивости к антибиотикам содержат несколько единственных сайтов рестрикции. В совокупности этот вектор обладает большими возможностями для клонирования генов.
Плазмида pFH7 является примером интегративной челночной плазмиды, полученной путем объединения двух репликонов один из которых берет начало от плазмиды pC194 из B. subtilis, а другой - от плазмиды pBr322 E. coli, что дает возможность вектору существовать и стабильно реплицироваься как в клетках E. coli, так и B. subtilis. Созданы челночные векторы, способные реплицироваться в клетках животных и растений и в низших организмах. Необходимость использования челночных векторов в ГИ связана с тем, что наработку векторной ДНК для проведения генно-инженерных манипуляций удобнее проводить в бактериях, а получение биологически активных продуктов клонированных генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в природных условиях.
Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке в условиях отсутствия селективного давления, то считается, что они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке, независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов обнаружено до 8-10 разных плазмид, при этом каждая из них выполняла свои функции, была представлена характерным для нее числом копий и относилась к собственной группе несовместимости. Одни плазмиды несут специфический сайт инициации репликации и могут реплицироваться только в клетках одного вида. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они реплицируются в самых разных бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и с широким кругом хозяев. Несовместимость плазмид обусловливается подавлением репликации одной из них или блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам перед их делением. Оба механизма действуют независимо друг от друга.
Различают плазмиды со строгим и ослабленным контролем репликации. Минимальный размер плазмид со строгим контролем репликации 20-30 тпн, а максимальный – на порядок больше. Плазмиды с ослабленным контролем репликации обычно невелики – не более 15-30 тпн. Строгость контроля репликации плазмид заключается в наличии у них механизма ограничения числа копий до 1-3 молекул на клетку. При переходе в стационарную фазу роста плазмиды со строгим контролем перестают реплицироваться, в то время как плазмиды с ослабленным контролем продолжают дупликацию, и их масса в клетке может достигать массы бактериальной ДНК.
Плазмиды со строгим контролем репликации способны к интеграции в бактериальную хромосому. При этом они подчиняются репликационному аппарату бактериальной хромосомы и могут неопределенно долго существовать в ее составе. Такие плазмиды получили название эписом (Пример - плазмида F)
Контроль числа копий осуществляет базовый репликон плазмиды (его размер около 2-3 т.п.н.), в который входят сайт начала репликации ori, сайты контроля за копийностью cop (лат) и несовместимостью inc (incompatibility), а также гены, чьи продукты функционируют на этих сайтах.
Фенотипические признаки. Плазмиды передают клеткам различные признаки: устойчивость к антибиотикам (более 20), тяжелым металлам: висмуту, кадмию, кобальту, ртути, свинцу; соединениям мышьяка, УФ-свету и т.д. Клетки с плазмидами способны вызывать биодеградацию различных углеводородов, синтезировать антибиотики, пигменты, токсины, конъюгировать с реципиентными штаммами бактерий, инициировать опухоли у растений, осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК. Плазмиды, которые не выявляются по фенотипическим признакам, называются криптическими.
В природе плазмиды играют роль посредников, способствуя межклеточному обмену генами. Такой обмен приводит к быстрой адаптации клеток к изменяющимся факторам среды. Частота таких явлений в природе низка. Однако в последнее время она возросла, в результате чрезмерного использования в медицине антибактериальных веществ и загрязнения окружающей среды промышленными отходами. В клиниках вместо естественных чувствительных штаммов стали выделять их варианты, устойчивые к лекарственным веществам, а в местах скопления отходов и ядов были выявлены микроорганизмы, активно утилизирующие эти вещества. Плазмиды также могут вызывать изменения в составе белков внешней мебраны, что приводит к их антигенной вариации и способствует повышению устойчивости бактерий против иммунной системы животных.
Плазмида F (или фактор фертильности) представляет собой малокопийную конъюгативную эписому клеток E. coli К12, относящуюся к IncF1-группе несовместимости и обладающую строгим контролем репликации. Размер ее кольцевой ДНК составляет около 100 тпн, у нее идентифицированы около 60 генов. Попадая в клетку, эта плазмида изменяет ее свойства. Клетки приобретают пили и чувствительность к некоторым фагам (для них пили являются рецепторами), а также становятся донорами ДНК и блокируют конъюгационный перенос в них чужой ДНК (явление поверхностного исключения). Эта плазмида может существовать как автономно в цитоплазме у F+ донора, так и встраиваться в бактериальную хромосому. Реципиентные штаммы не имеют фактора F и обозначаются F-(минус). F+ -доноры передают F-плазмиды практически всем F- клеткам, с которыми они спариваются. Клетка после интеграции в ее хромосому F-плазмиды приобретает свойства Hfr-клетки, т.е. способность с высокой частотой ориентированно передавать свои гены в реципиенты.
F- плазмиды представляют пример генной инженерии in vivo, осуществляющейся в природе с помощью плазмид. Эти плазмиды широко используются и в молекулярной генетике и генной инженерии.