meditsin1128_1

роцитов в плазме эта величина намного больше среднего радиуса эритроцита вследствие агрегации.

Таким образом, измеряя h(t) при известном показателе гематокрита H0, при помощи математической модели можно вычислить средний радиус частиц R и реологический параметр крови.

Вывод: Предложенная в настоящей работе математическая модель оседания эритроцита в капилляре содержит всего два параметра оптимизации (реологический и радиус гидродинамического сопротивления клетки, каждый из которых имеет реальный физический смысл. Она удовлетворительно описывает экспериментальные данные, имеющиеся в литературе. С помощью данной модели возможно исследование реологии эритроцитарных суспензий по измерениям кинетики оседания эритроцитов и вычисления реологического параметра α без применениям вискозиметра. Кроме этого, математическая модель позволяет вычислять радиус гидродинамического сопротивления клетки эритроцита, среднее число клеток в агрегатах эритроцитов по формуле N = R3 / R3е, где Rе = 4 мкм – условный радиус эритроцитов.

2.5. Лабораторные способы исследования скорости оседания эритроцитов

2.5.1. Методика постановки теста СОЭ

Весьма существенное значение для получения правильных показаний СОЭ и для правильной оценки имеет методика постановки реакции.

Существуют макро- и микрометоды определения скорости оседания эритроцитов. Кровь берут из вены (первая группа методов) или из пальца (вторая группа методов), смешивают с раствором какого-либо антикоагулянта, обычно оксалата или цитрата натрия (1 часть разводящей жидкости и 4 части крови), помещают в градуированный стеклянный сосуд (пипетку) и устанавливают ее вертикально. При оценке скорости оседания за постоянную величину принимают время (1 ч), относительно которого оценивают переменную величину - оседание.

В нашей стране распространен микрометод в модификации Панченкова Т.П. Он принят в качестве унифицированного.

Принцип: цельная кровь, консервированная цитратом натрия, при стоянии в капиллярах Панченкова разделяется на два слоя (эритроциты, плазма). Реактивы: 5% раствор цитрата натрия, рН которого должен быть 7,0 или 7,2 (нейтральная или слабощелочная). Проба стабильна в течение 2 ч при 25° С и

12 ч при 4° С.

Оборудование: аппарат Панченкова, представляющий собой специальную градуированную капиллярную пипетку, имеющую просвет в 1 мм и длину

100 мм.

Ход определения: Пипетку предварительно промывают 3,7% раствором цитрата натрия, затем набирают этот раствор в пипетку до метки «70» (30

51

мкл) и выливают на дно пробирки Видаля. Кровь из пальца насасывают тем же капилляром - сначала целый капилляр, затем еще до метки «80» (120 мкл). Количество цитрата и крови может быть разное - 25 мкл цитрата и 100 мкл крови, 50 мкл цитрата и 200 мкл крови, но соотношение их должно быть обязательно 1:4. Кровь помещают в пробирку с цитратом и после тщательного перемешивания вновь набирают в капиллярную пипетку до метки «О». Капилляр с цитратной кровью ставят в штатив вертикально между двумя резиновыми прокладками и оставляют на час. Через час определяют величину оседания по столбику плазмы над осевшими эритроцитами, деление капиллярной пипетки соответствующее границе плазмы и эритроцитов, записывают как величину СОЭ в миллиметрах в час.

При определении СОЭ венозной крови в качестве антикоагулянта при взятии крови используют ЭДТА-Na2 (1 - 2 кристаллика на 1 мл крови, перемешивать 1 - 2 мин), а затем все, как описано выше. Результаты оценивают по линии раздела жидкой части и клеточных элементов.

Очень часто при анемиях нет резкой границы между эритроцитами и плазмой за счет «вуали» из ретикулоцитов. Эта «вуаль» причисляется к столбику плазмы.

Несмотря на простоту выполнения микрометода Панченкова, при его постановке требуется соблюдать аккуратность и точность.

Основные причины ошибок при постановке теста СОЭ:

•недостаточная глубина прокола иглой Франка. Это приводит к тому, что кровь приходится выжимать из пальца с известным усилием. Отсюда – травматизация капилляров, перемешивание крови с лимфой, что существенным образом влияет на скорость оседания.

•Нарушение соотношения цитрата с кровью. При постановке реакции оседания важно соблюдать точность соотношения цитрата и крови (1:4). Более концентрированный цитрат извлекает воду из эритроцитов и ускоряет оседание. Менее концентрированный цитрат (гипотонический) вызывает поступление воды в эритроцит и замедляет СОЭ.

•Качество самого цитрата. 5% раствор цитрата должен быть немутным и иметь рН нейтральный или щелочной. Кислая соль цитрата непригодна для постановки СОЭ.

•Размешивание крови с цитратом. Нужно хорошо размешивать кровь с цитратом во избежании сгустков. Недостаточное перемешивание крови с цитратом приводит к задержке оседания. Следует стремиться осуществлять перемешивание крови с цитратом насасываем смеси в капилляр строго определенное число раз, чтобы избежать длительное перемешивания, травмирующего эритроциты.

•Загрязнение капилляров сгустками крови, остатками. Необходимо хорошо промывать капилляр цитратом перед работой.

•Неоткалиброванные капилляры.

•Температурный фактор. Оптимальная температура 18 – 22 0С, при более низкой температуре оседание замедляется, при более высокой – ускоря-

52

ется. СОЭ в капиллярах следует устанавливать не позднее 2 ч от момента взятия крови.

Для экспресс - метода используют модификацию микрометода Панченкова, которая заключается в измерении СОЭ в наклонных капиллярах. Известно, что любой наклон ускоряет оседание эритроцитов, и скорость оседания в этом случае, до известной степени, обратно пропорциональна углу их наклона. Экспериментальными исследованиями установлено, что оптимальный угол наклона пробирки 450. Метод был предложен Т.Я. Гуровичем и П.А. Подрабинеком. Подобные исследования проводились в биохимической лаборатории 7-ой городской клинической больницы г. Казани и на базе Казанской Государственной Академии Ветеринарной медицины. Экспериментальные исследования показали, что в этом случае оседание эритроцитов идет направленно только под влиянием их агрегационных свойств без учета случайной составляющей, вызванной спонтанной агрегацией в гравитационном поле. Кроме этого, значительно сокращается продолжительность анализа (до 15 минут). Однако результаты этого метода не приведены в соответствие стандартным значениям показателя СОЭ, что существенно уменьшает их диагностическую ценность и вызывает некоторую скептическую реакцию со стороны врачей.

С другой стороны, возможности метода позволяют не только проводить анализ скорости оседания эритроцитов, но также оценивать их агрегационную способность и определять величину гематокрита. Это требует разработки новой методики оценки результатов экспресс – анализа агрегационных свойств эритроцитов.

2.5.2. Исследование процесса седиментации эритроцитов в динамике

Как вытекает из изложенного, в основу учета показаний СОЭ в клинических условиях принят принцип выявления скорости оседания эритроцитов за определенный отрезок времени - один час, поскольку этот период наиболее четко характеризует течение процесса оседания.

Уже в первые годы практического применения реакции появились работы, указывающие на клиническое значение определения СОЭ через короткие промежутки времени. При этом высота столбика осевших эритроцитов фиксируется через отдельные промежутки времени (обычно каждые пятнадцать минут), данные наносятся на ось ординат и точки, определяющие величину оседания за отдельные отрезки часа, соединяются. Кривая оседания позволяет не только судить о величине оседания, но и его характере.

Впоследующем такая методика исследования получила название фракционной скорости оседания эритроцитов.

Внорме, т.е. у здорового человека, оседание эритроцитов происходит равномерно и не превышает 2 – 3 мм за каждые 15 минут. При максимальном оседании эритроциты в первой и второй четверти часа следует думать об активном воспалительном процессе.

Принципы метода определения фракционной СОЭ используются в ме-

53

тоде сигма – СОЭ, предложенного французскими ревматологами в 1972 г. для определения эффективности лечения ревматоидного артрита. Особенность метода сигма – СОЭ заключается в использовании гепанизированной венозной крови, предварительная стандартизация гематокрита (0,35 г/л) и четырехкратный учет величин седиментации эритроцитов с последующим подсчетом суммы полученных показателей. Благодаря унификации гематокрита отчетливо выявляется влияние на СОЭ различных ингридиентов плазмы: белков, липидов, мукополисахаридов, концентрации желчных кислот и желчных пигментов, что свидетельствует о динамичности метода сигма – СОЭ и, как показали исследования, увеличивает его диагностическую ценность. Однако данный метод является более трудоемким, чем метод Панченкова, т.к. требует предварительной стандартизации гематокрита.

Модификацией метода определения фракционной СОЭ является «Способ контроля физиологического состояния человека», разработанный в ЗАО Центр «Анализ веществ» Воейковым В.Л., Гурфинкель Ю.И. и др. (патент

RU 2103672 кл. G01N15/05, 1998).

Способ осуществляется следующим образом: при постановке теста используется микрометод в модификации Панченкова. Особенностью метода состоит в измерении времени прохождения границей эритроциты - плазмы заранее выбранных отрезков (например, 0,1, 0,5 или 1 мм), либо в фиксировании положения границы эритроциты - плазма через равные промежутки времени. Второй способ более просто поддается автоматизации. Такие измерения выявляют колебания скорости оседания эритроцитов в ходе измерения, картина которых более точно отражает физиологическое обследуемого. Прототипы данного метода не позволяют выявить подобных колебаний. На основании полученных измерений получают зависимость скорости осаждения эритроцитов от времени, характеризующуюся времени до начала колебаний скорости, частотой колебаний, максимальными значениями СОЭ, продолжительностью периода колебаний, которые является характеристичными для физиологического состояния обследуемого.

Данный способ контроля физиологического состояния позволяет повысить диагностическую ценность теста СОЭ путем получения дополнительной информации о физиологическом состоянии человека на основе анализа зависимости скорости оседания эритроцитов от времени измерения.

По мере углубленного изучения реакции оседания эритроцитов в динамике появилось ряд работ, исследующих зависимость различных характеров кривых оседания от физиологического состояния человека.

По мнению Л. Д. Штейнберга, кривые оседания более четко характеризуют понятие «норма», чем скорость оседания эритроцитов за час. У здоровых людей, независимо от возраста, оседание происходит сравнительно равномерно, и кривая представляет собой несколько волнистую линию, приближающуюся к горизонтальной.

При наличии ряда патологических процессов максимум оседания, сопровождающийся выбуханием кривой, отмечается в начальные моменты реакции: кривая «сдвигается влево».

54

Л. Д. Штейнберг различает четыре типы кривых оседания в зависимости от реактивности организма:

1)гиперреактивные, когда наиболее выражена величина оседания в первуювторую четверть часа; подобное явление наблюдается в острой фазе патологического процесса на фоне резко повышенной общей реактивности организма (ревматизм, крупозная пневмония);

2)реактивные, когда наиболее выражена скорость оседания во вторую или третью четверть часа; это имеет место при острых инфекционных заболеваниях, протекающих с достаточной реактивностью (тифы, скарлатина);

3)гипореактивные, когда максимум оседания происходит в четвертый - пятый отрезок времени; подобные кривые обнаруживаются у выздоравливающих больных или при заболеваниях, протекающих с пониженной реактивностью;

4)ареактивные плоские кривые со скоростью оседания за каждые 15 минут по 0,5 – 1 мм, они наблюдаются у больных, сопротивляемость которых резко снижена, при тяжелых общих процессах подобные кривые могут рассматриваться как прогностически плохой признак (финальная фаза туберкулезного менингита).

По мнению Г.И. Бурчинского, объединяющим принципом для различных типов кривых является не принадлежность кривой к тому или иному заболеванию, а характер процесса и общая величина за один час. Тип кривой зависит от общей величины оседания за первый час: сдвиг кривой «влево» тем больше выражен, чем больше скорость оседания в течение первого часа. При большой скорости оседания, как правило, наблюдаются наибольшие выбухания в первую или вторую четверть первого часа; точно также, чем ниже оседание, тем равномернее выглядит кривая. При этом необходимо подчеркнуть, что при остро протекающих заболеваниях или обострениях хронических процессов чаще всего наблюдается максимальный подъем в первую или, реже, во вторую четверть первого часа, то есть сдвиг кривой «влево» характеризует острый характер течения процесса. Подобные кривые с выбуханием в первую четверть первого часа наблюдаются у больных в острой стадии ревматизма, при крупозной пневмонии, при нарастании эксудата в полости плевры, при острых лейкозах, при злокачественном малокровии на высоте заболевания.

По мере затихания процесса наблюдается сглаживание кривой, идущее параллельно уменьшению часовой скорости оседания; при этом нередко отмечается, что в то время как величина, характеризующая скорость оседания за час, еще не успевает значительно измениться, уже можно уловить изменение характера кривой: уменьшается разница оседания в первую и во вторую четверть первого часа, а иногда, наоборот, оседание во вторую четверть первого часа превышает оседание за первую четверть.

Наличие различных типов кривой оседания требует выяснения причин, которые обусловливают различный характер течения процесса оседания на протяжении первого часа. Существует мнение, что тип кривой оседания связан с накоплением в крови глобулина, являющегося полидисперсным белком,

55

и с преобладанием в плазме той или иной его дисперсной фазы: превалирование грубодисперсного глобулина сопровождается выбуханием кривой в первые четверти первого часа; накопление глобулина с преобладанием частичек средней величины сопровождается выбуханием кривой в средней части, а глобулин, изобилующий мелкими частичками, обусловливает выбухание в конце кривой. Таким образом, кривая оседания является, в сущности, изображением «дисперсного спектра» глобулинов данной сыворотки.

Экспериментальные исследования показывают, что

-если агломерация выражена резко, констатируется ясный сдвиг кривой влево с выбуханием ее либо в первую, либо во вторую четверть первого часа;

-если увеличение фибриногена в крови выражено значительно, почти всегда наблюдается выбухание кривой в первую четверть первого часа;

-в случаях, когда наблюдается одновременное увеличение фибриногена и глобулина и скорость оседания особенно высока, имеет место особенно резко выраженное выбухание кривой в первую, а также и во вторую четверть первого часа;

-в случаях, когда уровень глобулина резко повышен, а фибриноген увеличен в крови нерезко, наблюдается характерный сдвиг влево, но с максимумом оседания во вторую четверть первого часа.

-при нерезком увеличении содержания глобулина, при средних величинах ускорения наблюдается более равномерный тип кривой оседания.

Таким образом, тип кривой оседания эритроцитов, по-видимому, может быть связан с преобладанием в плазме крови тех или иных белковых фракций. Эти данные стоят в соответствии с изложенными выше взглядами на роль альбумина, глобулина и фиброгена в процессе оседания. С точки зрения коагуляционной теории оседания изменения в характере кривой, повидимому, могут рассматриваться как проявление явной и скрытой коагуляции (седиментации).

Таким образом, фракционная реакция оседания эритроцитов является более точным методом исследования, чем суммарная величина СОЭ за час и имеет большую диагностическую ценность и информативность. Анализ процесса оседания эритроцитов в динамике открывает новые возможности для экспресс-метода СОЭ. Однако вместе с этим повышается трудоемкость проведения анализа и требуется дополнительная обработка результатов исследования. Одним из рациональных решений является разработка методов автоматической регистрации и исследования процесса оседания эритроцитов в динамике.

2.6. Обзор методов и технических средств исследования агрегационных свойств клеток крови

В настоящее время многие исследователи уделяют большое внимание изучению реологических свойств крови на уровне микроциркуляции, которые определяется ее агрегационными характеристиками. Для полного описа-

56

ния феномена агрегации необходимо определить адекватные характеристики агрегационного процесса, такие как

1.Время, необходимое для формирования дуплетов и сети монетных столбиков агрегатов эритроцитов;

2.Координатное число укрупненных агрегатов в единице объема;

3.Оценка факторов, вызывающих агрегацию.

Внастоящее время ни один из методов не дает возможности определения всех трех параметров. В зависимости от используемой техники могут быть определены одновременно один либо два параметра. Исчерпывающую информацию об агрегационных способностях эритроцитов, таким образом, можно получить лишь используя по крайней мере две методики. Обычно используют две группы методов в зависимости от их способности производить либо статические, либо кинематические измерения.

Проведем классификацию методов гемореологических исследований, позволяющих определять агрегационные и реологические свойства крови.

2.6.1. Оценка агрегационных свойств крови по СОЭ

Одним из самых широкоизвестных и доступных методов непрямого измерения агрегационных свойств крови является оценка скорости седиментации эритроцитов. В настоящее время в клинико-диагностических лабораториях применяется ручной метод определения скорости седиментации эритроцитов в вертикальной пробирке, при котором пробирку с исследуемой пробой помещают в аппарат Панченкова, и процесс оседания эритроцитов наблюдается визуально, а измерение величины СОЭ проводится через ограниченный промежуток времени – один час. Скорость падения сферы в жидкости по формуле Стокса прямо пропорциональна разности плотностей сферы и жидкости и квадрату радиуса шара и обратно пропорциональна вязкости жидкости. Измеряя показатель СОЭ и оценивая вязкость плазмы, соответствующее уравнение можно решить относительно эффективного диаметра агрегата. Однако скорость оседания сильно зависит от величины гематокрита

итемпературного фактора. Кроме этого, осаждение в вертикальной пробирке осуществляется при неконтролируемом напряжении сдвига, когда остаются неизвестными факторы образования и распада монетных столбиков агрегатов

изначительную роль играет спонтанная агрегация, вызванная влиянием гравитационного поля. Данных недостатков лишен метод определения скорости оседания эритроцитов в наклонных пробирках, однако в виду несоответствия получаемых в этом случае результатов со стандартизированными значениями СОЭ, данный метод не нашел широкого применения. Модификацией анализа СОЭ является оценка скорости оседания эритроцитов в динамике – фракционное СОЭ. Этот метод более трудоемкий и требует дополнительных временных затрат со стороны исследователя. В этом случае одним из рациональных решений является использование методов автоматической регистрации и исследования процесса оседания эритроцитов в динамике.

Существует 3 автоматических метода исследования СОЭ в динамике:

57

1.Кондуктометрический метод;

2.Электрокинетический метод.

3.Фотометрический метод;

Кондуктометрический метод регистрации СОЭ основан на измерении сопротивления крови с постоянно оседающими эритроцитами. Электрический ток, проходящий через кровь, крайне мал – примерно 0,2 мА, напряжение 0,25 В, частота 10 кГц. Эритроциты при данной частоте практически является диэлектиками. Вследствие этого электрическое сопротивление крови между электродами при оседании эритроцитов на дно ячейки увеличивается, причем степень этого увеличения зависит от количества осевших эритроцитов. Электрическое сопротивление крови регистрируется в динамике и определяется как разность между сопротивлениями в данной точке (через 5, 10, 30 и 60 мин) и начальным сопротивлением крови. Однако исследования показали, что данный метод является менее чувствительным, чем ручной метод Панченкова. Кроме этого, кондуктометрический метод не позволяет оценивать агрегацию эритроцитов.

Разновидностью кондуктометрического метода является определение гематокритного числа по электропроводности крови. Принцип этого метода основан на различии удельного электрического сопротивления эритроцитов и плазмы крови на низких частотах тестового воздействия (до 25 кГц). При этом рост концентрации форменных элементов крови приводит к повышению удельного электрического сопротивления крови.

В основу электрокинетического метода исследования скорости оседания эритроцитов положен эффект Дорна. Он состоит в том, что при движении заряженных частиц в неподвижном столбе жидкости в ней возникает разность потенциалов. Известно, что одним из факторов, вызывающих агрегацию эритроцитов, является величина заряда мембраны. При ее увеличении возрастает способность эритроцита к агрегации. Измерение потенциала Дорна позволяет определить электрокинетическую характеристику оседания эритроцитов. Функциональная схема такого прибора представлена на рис. 1.7.

Рис. 1.7. Функциональная схема.

К седиментационному сосуд 1, в котором находится исследуемая суспензия эритроцитов 2, подведены отводящие электроды 3, подключенные ко входу электрометрического усилителя 4. Его входной сигнал поступает на согласующее устройство 5 и далее на регистратор 6. Седиментационный сосуд термостатируется термостатом 7. Вся измерительная часть тщательно экранируется от возможных электрических и магнитных наводок.

58

В эксперименте используется нативная кровь, разведенная в физиологическом растворе в соотношении 1:50, антикоагулянты при этом не применяются. Диаметр седиментационного сосуда 10 мм. Осаждение проводится в гравитационном поле Земли. Используются электроды второго класса: кольцевой, игольчатый и точечной формы. Плоскость их расположения в пространстве перпендикулярна вектору скорости осаждения эритроцитов. Расстояние между электродами составляло 10 мм. Температура проведения эксперимента 20 – 230. Для регистрации возникающей разности потенциалов используется электрометрический усилитель с высокоомным входом.

Зарегистрированная электрокинетическая кривая оседания эритроцитов представлена на рис. 1.8. По оси абсцисс отложено время, по оси ординат

– относительное значение измеряемого потенциала. Видно, что вся седиментационная характеристика промодулирована синусообразным сигналом с частотным диапазоном 0,02 – 0,07 Гц. По мере оседания эритроцитов амплитуда сигнала уменьшается. Исследования показали, что частота и амплитуда модулирующего сигнала зависит от состояния крови в целом. Согласно современным теоретическим и экспериментальным данным, потенциал Дорна определяется зарядом, концентрацией и скоростью оседания частиц, а также электропроводностью среды, поэтому кинетика электрокинетической кривой имеет сходство с кривой оседания эритроцитов.

Рис. 1.8. Электрокинетическая кривая оседания эритроцитов.

Таким образом, электрокинетические исследования эритроцитов при их седиментации являются косвенным методом оценки агрегационных свойств крови. Однако электрокинетический метод в настоящее время находится лишь на стадии исследования и еще не получены его количественные характеристики. Кроме этого, метод позволяет оценивать лишь один из факторов, влияющих на агрегационные свойства крови, – заряд мембраны эритроцитов и не учитывает вязкость крови и величину гематокрита.

Фотометрический метод регистрации СОЭ в динамике основан на измерении интенсивности светового потока, прошедшего через всю поверхность исследуемой пробы крови. Функциональная схема прибора изображена на рис. 1.9.

59

Рис. 1.9. Функциональная схема прибора.

Излучение от источника света 1 поступает на стандартную пробирку для определения СОЭ 3. В первоначальный момент времени она перекрывается столбиком крови 4. По мере оседания эритроцитов интенсивность излучения, прошедшего через исследуемую пробу, возрастает вследствие увеличения слоя плазмы, хорошо пропускающего излучение. Далее сигнал преобразуется к удобному для обработки и регистрации виду блоком 8 и поступает на самописец 9, который регистрирует кривую оседания эритроцитов. Данный метод является лишь простым способом регистрации фотометрических свойств крови и не позволяет адекватно оценивать размеры образующихся агрегатов эритроцитов.

Для оценки степени агрегации крови предложено устройство для графической регистрации фракционного состава эритроцитов, основанное на фотометрическом методе. Функциональная схема такого устройства приведена на рис. 1.10.

Рис. 1.10. Функциональная схема устройства для графической регистрации фракционного состава эритроцитов.

Пробирку с исследуемой пробой крови фиксируют неподвижно в вертикальном положении в специальном держателе. При перемещении каретки 3 с помощью передаточного механизма 6 пучок света 4 проходит через стеклянную пробирку 1, заполненную исследуемой жидкостью 2, содержащей эритроциты, и попадает на фотоэлемент 5. Оптическая плотность пробирки

60