1 Лекция. Физико-химические методы иследования

Люминесцентная микрофотография культурыклеток амниона человека, зараженныхвирусом кори: зоны локализации вирусного антигена обладают зеленоватым свечением

61

Люминесцентная микрофотография макрофага, внутри которого видны фагоцитированные бактерии, излучающие красное свечениеобработанный акридиновым оранжевым

62

Собственная флуоресценция белков	-— денатурацию белка
позволяетизучать:
-— конформации белка

63

64

-— число цепей полинуклеотидов

— наличие нуклеиновых кислот и хромосом, РНК в ядре

При добавлении акридинового оранжевого

-для двухцепочечных - зеленая флуоресценция

-одноцепочечных - красная флуоресценция

66

11

Авторадиография

- методизучения распределения радиоактивныхвеществ в исследуемом объекте наложением на него чувствительной к радиоактивным излучениямфотоэмульсии.

Метод, позволяющий локализовать радиоактивныйматериалв конкретной ткани, клетке, части клетки или дажевмолекуле.

67

Главноепреимущество авторадиографии

— простотаи доступность.

Выдержите (проэкспонируйте) образец срентгеновской пленкой, затем проявите пленкув стандартных условиях —и получите картинураспределениярадионуклидапо поверхности образца: геля, тонкослойной хроматограммыи т.д.

68

Применение авторадиографии

—применениерадиоактивного фосфораметодом авторадиографии дали возможность обнаружить присутствиеинтенсивного обмена веществ в растущей кости;

—применениерадиоиодаи авторадиографии позволили уточнить закономерности деятельности щитовиднойжелезы;

—введениемеченыхсоединений - предшественников белкаи нуклеиновыхкислотииспользование авторадиографии помогли уяснить роль вобменеэтихжизненно важных соединений определённыхклеточных

структур. 69

Виды вискозиметров

71

Вискозиметрия

— совокупность методов измерения вязкостей жидкостей и газов.

70

Использованиявискозиметрии

Определение:

—общей формыбелков

—соотношениякольцевой и линейнойформв молекулах ДНК

—конформации комплексов ДНК сгистонами.

Обнаружение:

—процессавпрыскивания ДНКфагами

—внутрицепочечных дисульфидныхмостиков вбелках

—образования ДНК приферментативной полимеризации мононуклеотидов

Доказательство:

— того, что некоторыевеществамогут внедрятьсямежду гетероциклическими основаниями ДНК

12

Хроматография

(Chroma –цвет) — методразделения и анализа смесей веществ, атакжеизучения физико-химических свойств веществ.

Основан нараспределениивеществ между двумя фазами — неподвижной и подвижной.

	ЦветМихаил Семёнович - русский ботаник-физиолог ибиохимик
	(14 мая 1872 – 26 июня 1919)
	Родился винтернациональной семьерусского иитальянки в
	городеАсти, в Италии. Образованиеонполучилв Швейцарии, в
	Женевском университете
	В 1897 годуон переехал наисторическуюродинуотца, в Россию.
	С 1896 годаработалв Лаборатории анатомии и физиологии
	растений Петербургской АН, с 1902 годаассистенткафедры
73	физиологиии анатомии растений Варшавского университета. 74

В ноябре 1910 годаМ. С. Цветзащитил диссертацию настепень доктоработаники подзаглавием "Хлорофиллыврастительноми животноммире". Работа эта была удостоенаАкадемией наук большой премии имени Ахматова.

75

В 1914 годуПолитехнический институтспешно эвакуировалсяиз Варшавыв Нижний Новгород. М. С.Цветпри этом потерялсвоё имуществои ценнуюбиблиотеку.

31 августа 1918 годаэвакуированв Воронеж, гдевпоследствии

работалв ботаническом садууниверситета.
Умер отголода и похороненв Воронеженатерритории
Алексеево-Акатоваженскогомонастыря	76

Хроматография

(Chroma –цвет) — методразделения и анализа смесей веществ, атакжеизучения физико-химических свойств веществ.

Основан нараспределениивеществ между двумя фазами — неподвижной и подвижной.

77

Классификация видов хроматографии

По агрегатномусостояниюфаз

•Газовая хроматография

•Жидкостная хроматография По механизмувзаимодействия

•Распределительная хроматография

•Адсорбционная хроматография

•Ионообменная хроматография

•Аффинная хроматография

•Гель - хроматография

•Осадочная хроматография

По цели проведения

• Аналитическая хроматография

• Препаративная хроматография

• Промышленная хроматография

По способувводапробы

• Элюентная хроматография

• Фронтальная хроматография

• Вытеснительная хроматография

78

13

Возьмите квадратный листок бумаги и в середину капните исследуемый раствор, содержащий смесь окрашенных веществ. Это может быть спиртовая настойка какого-либо лекарства, например валерианы или календулы. На бумагеобразуется пятно. В центр его капните несколько капель растворителя: растворителем должен служить спирт.

Растворитель, словно по фитилю, продвигаясь между бумажных волокон, разноситокрашенныевещества от пятна во все стороны. В зависимости от природы вещества и его молекулярной массы опыт идет быстрее или медленнее, но рано или поздно на листе оказывается несколько колец разного цвета. Сколько именно колец - зависит от того, сколько веществ было в анализируемой смеси.

Чаще всегоиспользуютдва типараспределительной хроматографии – хроматографиюнабумаге итонкослойную.

В бумажной хроматографии вещества различаются по их относительным положениям набумаге после того, как растворитель пройдёт данное расстояние.

81

Хроматограмма - кривая, изображающая зависимость концентрации соединений, отвремени, смомента началаразделения

Базовая линия соответствуеттомупромежуткувремени,в течениекоторого детектор регистрируетсигналтолькоот подвижнойфазы.

Пик - кривая, описывающая постепенноенарастание
концентрации навыходеизколонки.	80

Бумажная хроматография активноиспользуется при изучениибелков.

Метод пептидных карт (метод отпечатков пальцев,

метод Ингрена) находитнесколько важных приложений в молекулярнойбиологии.

82

Хроматограммаметиловыхэфировжирныхкислот.

Нахроматограмме FAME - метиловыеэфирыжирныхкислот. Start - точкананесенияразделяемых смесей.

Точка 1 -метиловыеэфиры жирныхкислот. Точка 2 - продукты метилирования общихлипидов.

Стрелкой показано направление движения фронтарастворителя (системы).

Газожидкостная хроматография

84

14

Применение ГЖХ

—идентификация компонентов душистых веществ и вин;

—обнаружение пестицидов в биологическом материале;

—органический анализ.

Микроколонка для ГЖХ

85

Если в составесмеси имеются очень крупныемолекулы, вовсенепроникающиевнутрь гранул, то они будутвыходить изколонкиили достигать края с передним фронтом подвижной фазы.

Всемелкиемолекулыдостигнутконцахроматографического пути болееилименееодновременнои заведомо позднее,чем крупные.

Гель-проникающая хроматография

Основныепринципыработыметода

Молекулыэлюируются изколонки в порядке уменьшенияих размераили в порядкеуменьшениямолекулярноймассы.

86

Из гель-хроматограммывидно, что веществаизколонки выходятв следующем порядке:

1)декстран (Мr=2000000);

2)альбумин (Мr=65000);

3)инсулин (Мr=5000).

88

Используемые материалы

Гели, используемыев качествемолекулярныхсит, - это сшитые полимеры, которые несвязываются и нереагируютс анализируемыми веществами и неимеютзаряда.

89

Достоинства метода

Разделениеможно проводить почти в любыхусловиях (поведениевеществ независитоттемпературы, рН,ионной силы)

Очень лабильныевещества неизменяются врезультате хроматографии (адсорбция практически отсутствует)

90

15

Применение метода

Тонкослойная гель-проникающая хроматография

—очисткабелков, ферментов, нуклеиновыхкислот;

—разделение продуктов отреагентов при химических синтезах;

—удалениепримесей,искажающихрезультатприизучении молекулфизическими методами;

—отделениебелков отнуклеиновыхкислот;

—отделение нуклеиновыхкислототбелков.

—идентификацияразличныхфракций РНК, приизучении ее метаболизма;

—определениеразличныхфракций белкаплазмы;

—исследованиеструктурыбелкаили ДНК;

—изучениесвязывания междубелкамии небольшими молекулами.

92

Применениегель-проникающей	Ионообменная хроматография
тонкослойной хроматографии

—определениемолекулярной массы белков и пептидов;

—определение патологических белков в сыворотке крови, спинномозговой жидкости и моче.

93

94

Виды ионообменников

Катионитполивалентный		Анионитполивалентный
анион, противоионами которого		катион, противоионами которого
являются ионы водорода,
		являются гидроксильные ионы,
способные обмениваться на
		способные обмениваться на
катионы, находящиеся в
жидкости.		анионы.

Применение метода

Разделение:

—небольшихорганическихмолекул;

—ионовметаллов;

—белков и полисахаридов;

—нуклеотидов и аминокислот.

16

Аффинная хроматография

используетспецифическоесродство междувыделяемымвеществом и специфически связывающейся сниммолекулой (лигандом). Стационарная фаза содержитлибо фермент, либо субстрат.

97

Применениеметода

—очисткаферментов;

—очисткаантител;

—очисткатранспортных белков;

—очисткамембрани частиц, содержащихизвестныевещества;

—очисткагликопротеинов;

—выделениеспецифическихклеток животных.

99

Из анализируемой смеси свысокой степеньюспецифичности будет «вылавливаться» партнер соответствующей фермент-субстратной реакции.

трипсин

химотрипсин

эластаза

98

Выпускники 2018 года 

100

Спасибо за внимание!

Ни пуха !

101

102

17