ОТВЕТЫ МИКРА
.pdf1.1. Проведение забора материала от больных для бактериологических исследований
Правила:
1.Вид материала определяется клинической картиной заболевания, т.е. он должен соответствовать локализации предполагаемого возбудителя с учетом патогенеза болезни. Например, забираем гнойное содержимое ран, фурункулов, карбункулов, мокроту при бронхо-легочных заболеваниях4; испражнения при заболеваниях ЖКТ; кровь при лихорадочных состояниях и т.д.
2.Материал следует брать до применения антибиотиков или других химиотерапевтических препаратах или через определенный промежуток времени после их назначения, необходимый для выведения препарата из организма (например, антибиотики выводятся из организма через 8-10 часов)
3.Материал необходимо брать в достаточном количестве для исследования, соблюдая правила асептики в процедурном кабинете, в перевязочной или операционной, что бы не загрязнить его микроорганизмами окружающей среды и представителями нормальной микрофлоры человека.
4.Забор материала осуществляют, по возможности, в начальном периоде болезни, т.к. именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше и они имеют более типичную локализацию. Ранний этиологический диагноз предполагает более ранее, следовательно, более эффективное лечение и профилактику.
5.Исследуемый материал в возможно короткие сроки (1-2 часа) следует доставить в лабораторию. Его доставка должна осуществляться средним медицинским персоналом и производиться в лабораторной посуде или специальных контейнерах при сохранении первоначальной температуры материала, или при охлаждении, замораживании сухим льдом (зависимости от характера материала). Любой материал, направляемый в лабораторию, должен сопровождаться соответствующим направлением, в котором указывается фамилия, имя и отчество больного, вид материала, дата и время его взятия, предварительный диагноз заболевания, название учреждения или отделения, подпись врача, направляющего материал на исследование.
6.Любой клинический материал должен рассматриваться как потенциально опасный для человека. Поэтому при его заборе, хранении, доставке, обработке во избежание заражения должны соблюдаться такие же меры техники безопасности, как в бактериологической лаборатории.
7.После исследования остатки материала подлежат уничтожению (автоклавированию или сжиганию), а посуда, контейнеры, инструменты – обеззараживанию.
1.2.Правила забора и посева крови на стерильность и гемокультуру
Производится при тифо-паратифозных заболеваниях, сепсисе, менингококковой инфекции или других инфекциях, сопровождающихся лихорадкой, причем на протяжении всего лихорадочного периода болезни, но лучше в начальном периоде или в разгаре болезни (при выраженной бактериемии). Для исследования берут кровь из вены локтевого сгиба, у маленьких детей кровь берут в меньшем количестве из мочки уха, пятки, пальца. Пробы крови отбирают после тщательной обработки кожи с соблюдением правил асептики, одноразовым стерильным шприцем. Посев на питательные среды стерильного материала (кровь или другие, содержащие микробов жидкости у здоровых лиц) также лучше делать у постели больного, либо помещать в стерильную посуду, содержащую вещества, препятствующие свертыванию крови 0,3% раствора цитрата натрия, 0,1% раствор оксалата натрия). Обычно берут 5-10мл крови и засевают во флакон, содержащий 50-100 мл среды. Для этого используют для флакона с питательной средой (один для аэробов, другой для анаэробов). Посев крови производится на жидкие питательные среды – 10% желчный бульон, 1% сахарный бульон, двухфазную среду, а также жидкие и полужидкие среды для культивирования анаэробов в разведении 1:10. Флаконы с питательной средой получают в лаборатории, переливание крови из шприца во флакон необходимо производить над пламенем спиртовки, предварительно сняв иглу. Флакон с посевом направляется в лабораторию, а в вечернее и ночное время помещают в термостат.
Студенту важно помнить, что тем раньше от начала заболевания производится посев. Тем больше шансов получить положительный результат. И, наоборот, чем позже взята кровь, тем меньшее количество возбудителя в ней находится и положительные результаты получаются реже. А при нормальной температуре – совсем редко. Следует знать, что для повышения числа положительных результатов гемокультуры рекомендуется, при отсутствии противопоказаний, за 15-20 минут для взятия крови ввести подкожно 1мл 0,1% раствора адреналина, что способствует сокращению селезенки и выходу в кровяное русло возбудителей (например, при тифозно-паратифозных заболеваниях)
Предварительный результат посева при тифо-паратифозных заболеваниях получают через 2-3 дня, а окончательный – через 7-10 дней. Следует помнить, что увеличение кратности посевов крови (три дня подряд на подъеме температуры) значительно повышают частоту выделения микробов из крови. У леченных больных кровь для посева следует брать 5-6 раз.
1.3.Правила забора и посева испражнений
Производится при кишечных инфекциях (брюшной тиф, паратифы, шигеллезы, сальмонеллезы и т.д.), а так же при всех болезнях, протекающих с поражением ЖКТ и сопровождающихся расстройством стула. Сбор испражнений производится стерильным деревянным шпателем или стеклянной палочкой в количестве 2-3г в стерильные баносчеи из судна, горшка или лотка, а так же непосредственно из прямой кишки с помощью тампонов, металлических петель или трубки ректоскопа. Студенты должны помнить, что даже остаточное количество дезинфицирующих средств на стенках судна или горшка способно значительно изменить как количественный, так и качественный состав микробов в клиническом материале, поэтому их следует тщательно промывать горячей водой. Следует брать слизь, гной, фибринные пленки и избегать примеси крови. При невозможности своевременного посева кала используют консервант – глицериновую смесь, составляющую 2\3 общего объема. Необходимо помнить, что посев испражнений производят прямым способом на чашки Петри со средой Плоскирева, Левина, Эндо, висмут-сульфит агаром или на среды обогащения (селенитовая, среда Мюллера), с последующим пересевом на перечисленные выше среды для выделения энтеробактерий, на щелочной агар (1% пептонную воду с последующим пересевом на щелочной агар) – для вибрионов, МПА – для бацилл, МПА с фурагином – для выделения псевдомонад, ЖСА – для выделения стафилококков, среду Китта-Тароцци – для клостридий.
Студенты должны знать, что при брюшном тифе посевы кала следует проводить со второй недели заболевания, перед выпиской из стационара, а пищевикам и им приравненным лицам – на протяжении всего периода работа в декретированных учреждениях. Положительные результаты копрокультуры при тифо-паратифозных заболеваниях бывают на 2-3 неделе заболевания и реже – в первые дни болезни, а рри других заболеваниях – на 2-3 день после посева.
1.4.Правила забора мочи
Производится при воспалительных заболеваниях мочевыводящих путей. Для бактериологического исследования следует брать среднюю порцию утренней мочи после тщательного туалета мочеполовых органов кипяченой водой с мылом. Мочу собирают в стерильную посуду, на исследование отбирают 3-5мл в стерильной, плотно закрывающийся флакон и доставляют в лаборатории. В течение 1 часа. При затрудненном мочеиспускании возможен отбор мочи с помощью катетера. При бактериологическом исследовании определяют степень бактериурии, т.е. количество колониеобразующих единиц в 1мл мочи, методом секреторных посевов мочи. Для этого чашку Петри с питательной средой 3-5% кровяным агаром необходимо разделить на 4 сектора. Бактериологической петлей диаметром 2мм (вместимость 0,005мл) производят посев мочи (30-40 штрихов) на сектор а чашки Петри, после этого петлю прожигают и производят 4 штриховых посева из сектора А в сектор ! и аналогичным образом – из 1 во 2, из 2 в 3.
Наносят по капле мочи на чашки Петри со средами Эндо (для энтеробактерий) и Сарубо (для грибов), а затем засевают штрихом по всей поверхности чашек. По капле материала (0,05мл) засевают в селенитовую среду и сахарный бульон в соотношении 1:9, все чашки и пробирки инкубируют 18-24
часа при 35-37 градусах. После инкубации число выросших колоний на разных секторах подсчитывают и определяют степень бактериурии по таблице.
Наличие в 1 мл мочи у детей 104, а у взрослых 105 микроорганизмов и более, говорит о наличии инфекции в мочевыводящих путях или почках. После подсчета микролных клеток в 1мл мочи проводят выделение чистой культуры микробов для дальнейшей идентификации и определения чувствительности к атибиотикам. Окончательный результат исследования выдается на 4-5 сутки.
1.5.Правила забора желчи
Производится при воспалительных заболеваниях желчевыводящих путец. Желчь забирается во время дуоденального зондирования. В отдельные стерильные пробирки собирают все три порции желчи (А, В и С) с количестве 10-20мл и не ранее 8-10 дня нормальной температуры. Конец зонда предварительно обрабатывают спиртом, затем, после выделения 1-2мл желчи, которые не используют для исследования, наполняют пробирки через зонд с помощью стерильного шприца.
При тифо-паратифозных заболеваниях студент должен знать, что положительная биликультура может быть в течение всего заболевания, а так же в периоде реконвалесценции. При этом возбудитель в желчи обнаруживается в ,15 чаще, чем в корпо- и уринокультурах. Однако, из-за опасности дуоденального зондирования в лихорадочном периоде, посев желчи производится только у реконвалесцентов и бактерионосителей. Для посева желчи используют жидкие среды обогащения (селенитовая, Мюллера и т.д.) и плотные дифференциально-диагностические (Плоскирева, висмутсульфит агар). Материал в количестве 1-2мл вносят в жидкую среду, а 0,5мл наносят на поверхность на поверхность плотной среды, затем равномерно распределяют шпателем.
При воспалительных процессах в желчном пузыре иной этиологической природы необходимо посев материала проводить как при посеве мочи. Учет результатов исследования и выписка производится на 4-5 сутки.
1.6.Правила забора рвотных масс и промывных вод желудка
Производится при пищевых токсикоинфекциях и кишечных инфекциях. Рвотные массы собирают в стерильные банки в количестве 50-100мл и немедленно отправляют их в лабораторию. Целесообразно проводить исследование материала на обнаружение и патогенной и условнопатогенной флоры. Для этого полученный материал разводят в физ. растворе, затем титруют его и засевают на чашки со вредами для выделения энтеробактерий (Левина, Эндо, Плоскирева), для вибрионов – на щелочной агар, для бацилл – на МПА, для клостридий – на стреду Китта-Тароцци. После инкубации выделяют чистые культуры, проводят их идентификацию, определяют чувствительность к антибиотикам, определяют факторы патогенности. При выделении УПМ необходимо учитывать не только качественный состав микрофлоры, но и количественный, т.к. этиологически значимой для отсутствующих или присутствующих в небольшом количестве в кишечнике здоровых людей видом является 106 и больше
Посев промывных вод желудка производится при пищевых токсикоинфекциях и кишечных инфекциях. Собираются в количестве 20-25мл в стерильные банки или широкогорлые флаконы после промывания желудка кипяченой водой без добавления гидрокарбоната натрия или перманганата калия. Из промывных вод следует забирать первые порции, доставляется материал в лабораторию немедленно. Посев проводится так же как и рвотных масс, только без разведения в физ. растворе.
1.7.Правила забора гноя, экссудата и розеолокультуры
Посев производится из воспалительных очагов. Материал забирается стерильным шприцем, пинцетом или тампоном, по возможности из более глубоких отделов, т.к. верхние отделы могут содержать сапрофитную микрофлору. При снятии повязки рекомендуется очистить поверхность от мази, отмерших тканей и только после этого отбирать материал с соблюдением правил асептики. Взятый материал помещают в стерильную пробирку, флакон или чашку Петри и доставляют в лабораторию.
Забор отделяемого проводят двумя ватными тампонами – один для приготовления нативного мазка, второй для посева на питательные среды. Посев производят в пробирку с сахарным бульоном, неоднократно погружая ее в среду, после чего несколько капель сахарного бульона пипеткой засевают в среду Китта-Тароцци или тиогликолевую. Этим же тампоном материал засевают на плотные питательные среды (кровяной агар, ЖСА, Эндо, Сабуро).
После инкубирования выделяют чистую культуру, идентифицируют микрофлору по рода и вида и определяют чувствительность к антибиотикам.
Посев из розеол производится для выделения микроорганизмов (при тифо-паратифозных заболеваниях). С целью получения содержимого розеолы кожу над ней обрабатывают спиртом и скарифицируют. На место скарификации наносят капли стерильного желчного или простого бульона, а затем с помощью пипетки переносят во флакон с 50мл желчного бульона. После инкубации 24 часа при 37 градусах материал из флакона пересевают на плотные питательные дифференциальнодиагностические среды (Плоскирева, висмут-сульфит агар и т.д.). материал в количестве 0,5мл наносят на поверхность плотной среды и затем равномерно растирают шпателем.
Посев из розеол желается с 8-10 для болезни, когда появляются розеолы на коже. Метод не ранний, но важный в периоде реконвалесценции и при диагностике стертых форм тифо-паратифозных заболеваних, так как в крови возбудители бывают в небольшом количестве.
1.8.Правила забора и посева носоглоточной слизи
Производится при менингококковом назофарингите и для выявления носительства менингококка, реже – при других формах менингококковой инфекции. Слизь из носоглотки берется натощак или через 3-4 часа после еды. Стерильный тампон, укрепленный на изогнутой проволоке (угол 120-130 градусов), направляется концом вверх и подводится под мягкое небо в носоглотку. Материал берется при надавливании шпателем на корень языка. После взятия носоглоточной слизи необходимо сразу же сделать посев на теплые чашки с сывороточным агаром, можно с добавлением ристомицина, который ингибирует рост сопутствующей флоры. После посева необходимо незамедлительно поставить чашки в термостат и, не допуская охлаждения, доставить их в лабораторию, так как менингококк очень чувствителен к снижению температуры ниже 36 градусов. Окончательный ответ посева выдается на 4 день исследования. Необходимо помнить, что при менингитах другой этиологии в носоглоточной больного может быть обнаружен менингококк, а так же отрицательные результаты посева не исключают менингококковую этиологию заболевания.
1.9.Правила забора слизи из зева и носа
Производятся при ангине, дифтерии и других инфекциях. Тампон для взятия мазков должен быть заранее простерилизован в лаборатории. Мазок из зева берут натощак или не ранее 2 часов после полоскания, питься, или еды под контролем глаза, не касаясь тампоном слизистых оболочек рта, языка, зубов. Корень языка придавливают книзу и кпереди шпателем, держа его левой рукой, а правой осторожно вводят в ротовую полость тампон и осторожно снимают налет или слизь на границе пораженного участка и здоровой ткани, где количество возбудителей больше, чем в других местах.
Перед взятием слизи из носа предварительно необходимо очистить нос, удалить корки. Тампон вводят поочередно в обе ноздри, плотно прикасаясь к стенкам, перегородке носа и плотно прижимая крылья носа к тампону. Полученный материал с тампона немедленно засевается на плотные питательные среды и одновременно наносится на предметное стекло, подсушивается и направляется в лабораторию для микроскопического исследования.
При подозрении на дифтерию материал засевают на кровяно-теллуритовый агар, предварительно подогретый до комнатной температуры. При посеве материал со всех сторон тампона втирают в среду на участке площадью 2х1см, а затем этим жен тампоном засевают круговыми движениями, втирая в общую поверхность среды. Засеянные чашки инкубируют при 37 градусах на 24-48 часа. При отсутствии возможности доставить материал в лабораторию в течение 3 часов с момента взятия пробы рекомендуется засевать материал на чашки с питательной средой непосредственно у постели больного или пробирки с транспортной средой помещают в термостат и затем доставляют в лабораторию. Через 24 часа инкубации с транспортной среды проводитсч пересев на КТА, поэтомк срок исследования увеличивается на одни сутки. После инкубации проводится выделение чистой культуры. Определяется род и вид. Кроме того, обязательно определяется токсигенность возбудителя дифтерии.
При подозрении на другую инфекцию мазок из зева берется параллельно двумя стерильными тампонами. Один помещают в пробирку с сахарным бульоном, другой используют для приготовления мазка. После инкубации через 24 часа проводится пересев с сахарного бульона на питательные среды (кровяной агар, шоколадный агар, ЖСА, Эндо, Сабуро). Чем больше набор селективных питательных сред используется для посева материала, тем больше вероятность
выделения и идентификации микроорганизмов, вырвавших болезнь. После идентификации до рода и вида необходимо определить чувствительность к антибиотикам.
1.12. Правила забора и посева ликвора
Производится на 20% сывороточный агар или же на среду обогащения – 0,1% полужидкий агар. Среды должны быть свежими: срок хранения их в холодильнике не более суток. Ликвор необходимо собирать в стерильную пробирку и немедленно доставлять в лабораторию на исследование в водяной бане при 37 градусах. Ликвор центрифугируют, берут 2-3 капли осадка жидкости, взятой со дна пробирки, засевают на повехность подогретого сывороточного агара в чашку Петри. Готовится мазок для бактериоскопического исследования, а оставшийся ликвор в пробирке заливается 5мл стерильного полужидеого 0,1% агара с добавлением сыворотки и помещается в термостат для накопления микробных клеток (так называемое «обогащение»). Предварительный результат посева, получается через 1-2 дня, а окончательный – через 3-4 дня, при выделении чистой культуры менингококка с помощью метода обогащения – через 7-8 дней.
2. Правила приготовления и окрашивания микропрепаратов, методы окраски
Окраска по Граму. Методика:
1)окрасить мазок генцианвиолетом ( 2 минуты,через фильтровальную бумагу);
2)бумагу удалить, оставшуюся краску слить;
3)окрасить мазок раствором Люголя (1 минута);
4)раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло);
5)тщательно смыть спирт водой;
6)окрасить водным фуксином (2 минуты);
7)промыть водой и высушить.
Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – в красный
Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это связано с наличием в клеточной стенке и мембране сравнительно большого количества липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными способами, поэтому используют концентрированные растворы с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой клетки, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена, который разработан с учетом все указанных особенностей
Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:
1) нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);
2) бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);
3)тщательно промыть водой;
4)окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);
5)промыть водой и высушить.
Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску.
Метод Ожешко.
1)нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);
2)слить кислоту, промыть водой, высушить;
3)зафиксировать в пламени;
4)окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.
Окраска включения волютина (по Нейссеру).
1)Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);
2)Промыть;
3)Окрасить раствором Люголя (30 секунд);
4)Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)
5)Промыть препарат и высушить
Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные.
Окраска по Бурри (обнаружение капсул). Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с неокрашенными бактериями.
1)Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;
2)Высушить на воздухе и бактериоскопировать.
Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.
Окраска по Романовскому-Гимзе. Относится к сложным методам окраски и применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и зерна волютина. Для окраски берут каплю готовой краски на 1мл воды, которая должна быть подщелочена до рН – 7,2.
1)Поместить препарат (мазком вниз) в чашку Петри, подложив под края стекла спички или кусочки предметных стекол;
2)Подлить краску сбоку так, чтобы она без пузырей подтекла под мазок (красить 1-24ч);
3)Промыть водой (рН – 7,2) и высушить;
Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы – в краснофиолетовый.
4. Правила проведения посева на жидкие и плотные питательные среды для получения чистых культур аэробных бактерий. Методы выделения чистых культур бактерий.
1.Посев петлей. Посевной материал втирают петлей в поверхность среды у края чашки. Избыток снимают, поколов петлей агар, а оставшийся материал рассеивают параллельными штрихами по всей поверхности агара.
2.Посев шпателем. Материал наносят петлей или пипеткой, а затем стеклянным или металлическим шпателем тщательно втирают его по всей поверхности среды.
3.Посев тампоном. Тампон и исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.
4.Посев на секторы. Дно чашки делят на секторы. Посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, что бы штрихи с одного не переходили на другой.
5.Посев газоном. 1мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микробов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют по всей поверхности. Избыток материала отсасывают пипеткой.
После посева чашки закрывают и кладут вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, на пробирках – в верхней части.
При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и растирают посевной материал по стенке пробирки. После чего смывают его средой.
6. Правила проведения посева на питательные среды для получения чистых культур анаэробных бактерий. Методы создания анаэробных условий.
Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Для контролем за насыщением этих сред кислородом используют специальные радокс-индикаторы.
Для сохренения низкого ОВП среды должны быть агаризованы. Для культивирования оглигатноанаэробных бактерий среды должны быть свежеприготовленными (не позднее 2 часов). Для
успешного выращивания требуется внесение большого количества посевного материала. Это связано с тем, что в больших количествах анаэроб способны быстрее понижать ОВП среды.
Среды должны очень богаты питательными субстратами и витаминами, факторами роста, т.к. анаэробный типа дыхания менее продуктивный, чем аэробный.
Методы создания анаэробных условий
1.Физичесикие методы. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода используют их регенерацию путем кипячения в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 50 градусов. После посева поверхность среды заливают парафином или вазелиновым маслом. Так же, возможен посев в столбик плотной или полужидкой среды на глубину 10-12см. кислород с воздуха диффундирует на 1,5-2см, а в глубине создаются благоприятные условия.
Применение анаэростатов и анаэробных боксов.
2.Химические методы. Для поглощения кислорода из замкнутого простанства можно использовать гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1л объема используют 100мл свежеприготовленного 20% Na2S2O4 и 16мл 50% КОН.
Для связывания остатков кислорода используют вещества-редуценты, к которым относится тиогликоевая кислота или тиогликолат натрия, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин, муравьинокислый натрий и т.д.
3.Биологические методы. Совместнео выращиевание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). При нем на одну половину чашку засевают исследуемы материал, а на другую – культуру аэробного или факультативно-анаэробного микроба, способного энергично поглощать кислород.
Помещение в среду кусочков печени, почек, мозга. При это тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют кислород, а в среде создаются анаэробные условия.
Методы выделения чистых культур анаэробов.
1.Метод Цейсслера. Исследуемый материал сеют штрихами по поверхности плотной среды. Создают анаэробные условия. И инкубируют при 37 градусах 24-72ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают на среду контроля стерильности или среду Китта-Тароцци.
2.Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материал вносят в пробирку с 4-5мл изотонического раствора. Перемешивают запаянным капилляром переносят в пробирку с охлажденным до 45-50 градусов сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают под струей воды. Выросшие в глубине колонии пересевают на СКС или среду КиттаТароцци.
3.Метод Перетца. Готовят разведение материала, как указано выше. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в чашку Петри, на дне которой на двух палочках лежит стеклянная пластина 6х6см. среду заливают так, что бы она заполнила пространство между пластиной и дном чашки. При появлении роста пластинку поднимают и чистые колонии пересевают.
7. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам диско-диффузионным методом. Расшифровывание антибиотикограммы.
Для использования необходимо использовать стандартные питательные среды. Стандартные диски с антибиотиками используются только до истечения срока годности. После вскрытия флакон с дисками можно хранить в течение недели в рефрижераторе при 10 градусах.
На поверхность подсушенной питательной среды в чашке Петри наносят 1мл исследуемой культуры, равномерно распределяют путем покачивания, избыток удаляют пипеткой. Плотные субстраты (мокрота, кал, рвота) должны быть предварительно гомогенизированы, мочу и экссудат засевают из осадка после центрифугирования. Материал наносят на чашку ватным тампоном. После выделения чистой культуры исследование проводят уже с ней. После посева среду подмушивают при комнатной температуре 10-15 минут. Диски с антибиотиками накладывают пинцетом на равно расстоянии друг от друга и на 2см от края чашки (на одну чашку не более 6 дисков). Чашку сразу ставят в термостат вверх дном и инкубируют при 35-37 градусах в течение 18-20 часов.
Для учета результатов чашки помещают на темную матовую поверхность и освещают под углом 45 градусов. Допускается учет в проходящем свете. С помощью линейки определяет диаметр зон задержки роста, включая сами диски, с точность до 1мм. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии в пределах зоны торможения роста. Оценку проводят по таблицам в соответствии с используемой средой и видом возбудителя.
10.Методы дезинфекции, правила дезинфекции в бактериологической лаборатории
Взависимости от характера действующего агента различают физический и химический способы дезинфекции.
Физический способ сводится к механической очистке объектов (орошению, мытью, чистке, встряхиванию и выколачиванию, влажной уборке, вентиляций помещений). Он не позволяет достигнуть полного обеззараживания обрабатываемых объектов, однако его применение приводит к значительному уменьшению числа патогенных микроорганизмов во внешней среде.
В микробиологической практике широкое применение нашли способы химической дезинфекции (рук и рабочего места, отработанного патологического материала, градуированных и пастеровских пипеток, стеклянных шпателей, стекол).
Дезинфицирующие средства предназначены для уничтожения возбудителей во внешней среде (помещениях, предметах ухода за больными, выделениях и одежде больных). Они должны:
1.Хорошо растворяться в воде
2.В короткие сроки проявлять бактерицидное действие
3.Не утрачивать обеззараживающих свойств при наличии органических примесей в среде, подлежащей обработке
4.Не оказывать токсического действия на людей и животных
5.Достаточно долго сохранять бактерицидные свойства при хранении в сухом виде или растворе
6.Быть дешевыми и удобными при транспортировке
Антисептческие средства применяются для воздействия на микробы, контаминирующие поверхности кожных покровов, слизистых оболочек и соприкасающихся с ними тканей.
Галогеносодержащие соединения: хлорная известь, хлорамин, раствор Люголя, спиртовой раствор йода.
Соединения тяжелых металлов: сулема, серебра нитрат, цинка сульфат, цинка окись, ксероформ, дерматол
ПАВ: пероксид водорода, калия перманганат. Спирты: спирт этиловый.
Альдегиды: формальдегид. Циминаль Фенолы: карболовая кислота, лизол, деготь, ихтиол Красители: зеленка, синька
11. Методы стерилизации, аппаратура и режимы стерилизации, используемые в бактериологической лаборатории.
Стерилизация сухим жаром применяется для обеспложивания стеклянной посуды, пробирок, колб, чашек Петри и пипеток. Для этой цели используют сухожаровые шкафы (печи Пастера), в который необходимый эффект достигается при температуре 160 градусов в течение 2 часов или при температуре 170 градусов в течение 40 минут.
Принципиальные преимущества сухого жара заключаются в том, что при его применении не происходит коррозии металлов и инструментов, не повреждаются стеклянные поверхности. Он пригоден для стерилизации порошков и не содержащих воды нелетучих вязких жидкостей.
Стерилизация паром под давлением – один из наиболее эффективных методов, основанный на сильном гидролизирущем действии насыщенного пара. Паром под давлением стерилизуют различные питательные среды (кроме содержащих нативные белки): жидкости, приборы, резиновые предметы, стеклянную посуду с резиновыми пробками. Для этого применяют автоклавы.
Питательные среды, перевязочные материалы и белье стерилизуют при 1атм 15-20 минут, питательные среды с углеводами – при 0,5атм 15 минут, а патогенный материал обеззараживают при 2атм.
12. Использование реакций Аг+Ат (РА, РИГА, РП) для идентификации бактерий
РА. Проводят на предметных стеклах. Для этого на обезжиренное стекло наносят пастеровской пипеткой несколько капель сыворотки в небольших (1:10 – 1:20) разведениях и каплю ИХН для контроля. Для идентификации в каждую каплю сыворотки, а также в каплю контроля вносят петлю суточной культуры испытуемого микроорганизма, взятой с поверхности плотной питательной среды. Для выявления АТ в исследуемой сыворотке крови в нее, как и в каплю ИХН, пастеровской пипеткой
вводят по 1 капле взвеси известных микроорганизмов (диагностикума). Внесенную культуру тщательно перемешивают до получения суспензии.
Реакция происходит при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают невооруженным глазом через 2-5 минут, иногда для этого используют лупу. Если предметные стекла поместить во влажную камеру, что бы исключить испарение капель, то результаты реакции можно учитывать и позже.
При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных и мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. При отрицательной реакции жидкость остается равномерно мутной, как и в контроле.
РНГА. Применяется для идентификации бактериальных и вирусных аг а исследуемом материале, а так же для экспресс-диагностики ряда инфекций.
В данной реакции эритроциты сенсибилизируют антителами. Частицы антительного эритроцитарного диагностикума склеиваются при добавлении аг.
Готовят двукратные разведения исследуемого материала в стабилизирующем растворе. Вносят по одной капле каждого разведения аг в три соседние лунки планшета (реакция занимает три параллельных ряда лунок). В каждую лунку первого ряда вносят по 1 капле стабилизирующего раствора, второго ряда – по одной капле гомологичной иммунной сыворотке, третьего ряда – по 1 капле гетерологичной иммунной сыворотке. Второй и третий ряды служат контролем специфичности реакции. Смесь оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Затем во все лунки добавляют по 1 капле 1% суспензии эритроцитарного антительного диагностикума и тщательно встряхивают планшеты. Результаты реакции учитывают через 30-40 минут. При наличии специфического аг гемагглютинация наблюдается в первом и третьем рядах и отсутствует во втором ряду, где аг предварительно нейтрализован гомологичной сывороткой. Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации.
РП (реакция кольцепреципитации). В узкую пробирку (диаметр 0,5см) наливают 0,3-0,5мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пастеровской пипеткой медленно наслаивают по стенке (пробирку держат наклонно) аг в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, что бы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении аг на сыворотку четко видна граница между двумя жидкостями. РП должна обязательно сопровождаться контролем аг и сыворотки. Результаты учитывают в зависимости от вида микроорганизма через 5-10 минут, 1-2 часа, 20-24 часа. В случае положительной реакции в случае в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым материалом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.
РП (реакия преципитации в геле). Основана на взаимодействии гомологичных аг и ат в агаровом геле с образованием видимых полос преципитации. Аг и ат в результате встречной диффузии в гель образуют макромолекулярные иммунные комплексы, регистрируемые визуально.
Взастывшем агаре вырезают лунки, удаляя из них гель пастеровской пипеткой. В одни лунки вносят ат,
вдругие – аг. И оставляют во влажной камере на несколько дней. Учитывая результаты реакции, сравнивают локализацию и характер линий преципитации возле опытных лунок и контрольной тестсистемы.
14. Использование реакций Аг+Ат с мечеными компонентами (РИФ, ИФА, РИА) для идентификации бактерий
РИФ. Основана на использовании флюоресцеинизотиоционата или других флюорохромов, химически связанных с ат. При этом меченные ат сохраняют свою иммунологическую специфичность. И вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными аг. Комплексы аг и меченными ат можно легко определить по интенсивному желто-зеленому свечению при изучении препарата в люминисцентном микроскопе.
Прямая РИФ ставится следующим образом: препарат окрашивается специфической меченой антисывороткой во влажной камере 30 минут при 25 градусах.
Непраямая РИФ проводится в 2 этапа с использованием двух различных антисывороток. В начале применяют немеченые ат против искомого аг, а на втором этапе образовавшийся комплекс ат-аг обрабатывают люминесцирующей антисывороткой, содержащей меченые ат против гамма-глобулина того вида животного, на котором была получена немеченая антисыворотка, использованная на первом этапе реакции.
ИФА. Метод основан на использовании для метки ат ферментов, способных разгалать субстрат и приводить к образованию окрашенных продуктов. Коъюшированные с ферментом ат сохраняют
способность соединяться с гомологичными аг. Интенсивность окраски хромогена соответствует количеству образовавшихся комплексов аг-ат+фермент. В качетве ыерментов чаще всего используют пероксидазу, щелочную фосфотазу. Субстратом для пероксидазы служит перекись водорода, а хромогеном 5-аминосалициловая кислота и другие вещества.
В настоящее время в микробиологии используется твердофазная модификация ИФА. Ее суть заключается в том, что в начале на каком-либо твердом материале сорбируют аг (или ат) и лишь после этого добавляют остальные ингредиенты реакции.
Определение неизвестных аг состоит из следующих этапов:
1.Связывание ат, специфичных для искомого аг. С пластиком лунки планшета;
2.Внесение антигенсодержащего материала;
3.Внесение 2-х антител той же специфичности;
4.Внесение коъюгата (меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки);
5.Внесение хромогенного субстрата;
РИА. Аг илил ат для РИА метят радиоизотопом. Чаще всего 125I. Реакция РИА очень чувствительна, позволяет определить 1-2нг и меньше исследуемого материала.
Чаще всего применяется радиофазная модификация РИА (суть такая же, как и ИФА). Применяют три метода твердофазной РИА: конкурентный, обратный и непрямой.
При конкурентном методе на поверхности сорбента сорбируют известные ат. Затем в лунки вносят исследуемый аг и спустя определенное время, достаточное для специфического взаимодействия, добавляют меченый радиоизотопом очищенный аг той же специфичности.
Если в исследуемом материале содержится аг, соответствующий иммобилизированым ат, чатсь активных центров последних блокируется. В таком случае внесенный в лунки меченый аг будет в меньшей степени (в сравнении с контролем) соединяться с ат, о чем можно судить по радиоактивной жидкой части реагирующей смеси.
При проведении РИА обратным методом на поверхности лунок сорбируют очищенный немеченый аг, гомологичный исследуемому аг. В отдельной пробирке соединяют антигенсодержащий материал с меченвми ат, специфичными с аг, иммобилизированными в лунках. Если в исслудемомо материале модержится аг, способный взаимодействовать и мечеными ат, активные центры последних полностью или частично блокируются. В таком случае при внесении в лунки с аг смеси, меченые ат буду не полностью взаимодействовать с аг, о чем можно судить по степени радиоактивности жидкости в сравнении с контролем.
Наиболее удобным является непрямой метод РИА с использованием антивидовых меченых ат. Метод может использован для идентификации неизвестных аг и ат. В обоих случаях применят антивидовую сыворотку, содержащих ат против соответствующих гамма-глобулинов.
Для проведения этого метода на поверхности лунок сорбируют аг, а затем добавляют разведенную сыворотку больного. При наличии в ней соответствующих ат на поверхности лунок формируется комплекс ат-аг. При последующем введении в лунку антивидовой меченой сыворотки ат, содержащиеся в ней, адсорбируются на образовавшемся комлексе. Чем больше в сыворотке больного ат, тем больше удет связанной с поверхностью лунок радиоактивной метки.
15. Использование реакций Аг+Ат с мечеными компонентами (РИФ, ИФА, РИА) для обнаружения антител в сыворотке крови.
ИФА. Определение неизвестных ат включает несколько этапов:
1.Связывание известного аг с пластиком лунки планшета;
2.Внесение испытуемой сыворотки
3.Внесение конъюгата (меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки);
4.Внесение хромогенного субстрата;
Остальные реакции по сути такие же.
17. Использование иммунобиологических препаратов для специфической профилактики бактериальных инфекций.
Кишечные инфекции: