9.5. Капиллярный электрофорез

Наряду с хроматографическими методами разделения в аналитическую практику, начиная с 1990 г., активно внедряется метод капиллярного электрофореза (КЭ).

Капиллярный электрофорез является альтернативой и дополнением к методу высокоэффективной жидкостной хроматографии, в первую очередь, для ионогенных и полярных соединений, воплотив в себе достоинства капиллярной газовой хроматографии, ВЭЖХ и традиционного электрофореза. Метод КЭ основан на разделении сложных смесей компонентов, находящихся в электролите, заполняющем квар- цевый капилляр, при приложении к нему разности потенциалов и прямого УФ-детектирования в потоке жидкости. Эффект разделения достигается за счет различия в электрофоретической подвижности ионов в присутствии электроосмотического потока.

Главными достоинствами метода КЭ являются выигрыш в эффективности, малый объем дозы, более простая процедура пробоподготовки, простое и дешевое аппаратурное оформление, возможность on-line детектирования и автоматизации, включая процедуру пробоподготовки. Высокая чувствительность лазер-индуцированного флуоресцентного детектирования в сочетании с различными приемами концентрирования пробы, так называемым стэкингом (stacking), позволяет использовать КЭ для анализа предельно малых количеств ве- щества (10^–16–10^–21 М). Стэкинг образца происходит, когда ионы аналитов пересекают границу, которая отделяет зону высокой проводимости раствора образца и низкой – ведущего электролита, – и применителен к заряженным и нейтральным аналитам. Использование стэкинга позволяет приблизить чувствительность метода КЭ к ВЭЖХ.

Дальнейший прогресс микросепарационной техники связан с обращением к микроэлектромеханическим системам. Это, в первую очередь, чип-приборы КЭ (одноканальные чип-сенсоры и многоканальные чип-линейки). Система, реализующая принципы электрофоретического разделения, включает кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему вывода информации (рисунок 9.4).

Рисунок 9.4 – Устройство системы капиллярного электрофореза

Дополнительные устройства позволяют автоматизировать подачу образцов, осуществлять отвод тепла от капилляра, управлять прибором, собирать и обрабатывать полученные данные.

На границе раздела кварц-водного раствора электролита возникает двойной электрический слой. Распределение катионов между неподвижным и диффузным слоями, а следовательно, и толщина двойного слоя зависит от общей концентрации электролита в растворе: чем она больше, тем большая часть положительного заряда диффузного слоя перемещается в неподвижный слой и тем меньше толщина диффузного слоя. Микрообъем анализируемого раствора ( 2 нл) вводится в кварцевый капилляр, предварительно заполненный электролитом, обладающим буферными свойствами (ведущий электролит). После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей от их заряда и массы, достигая в разное время зоны детектирования.

При наложении продольного электрического поля в капилляре возникает движение носителей электрических зарядов во взаимно противоположных направлениях – электрофорез. Избыточная концентрация катионов в диффузной части двойного электрического слоя увлекает за собой всю массу жидкости в капилляре. Возникает течение жидкости в капилляре под действием электрического поля – электроосмотический поток (ЭОП), который осуществляет пассивный перенос раствора внутри капилляра. ЭОП характеризуется плоским профилем потока, который при движении зон компонентов внутри капилляра практически не вызывает их уширения. Этим и определяется очень высокая эффективность КЭ.

Метод капиллярного электрофореза может быть представлен в нескольких вариантах. Для аналитических целей используются следующие разновидности КЭ:

1. Зонный капиллярный электрофорез.

2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография.

3. Капиллярный гель-электрофорез.

4. Изоэлектрическая фокусировка.

Наиболее распространенными вариантами капиллярного электрофореза являются зонный и мицеллярный.

Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ), используемый в основном для разделения биополимеров (белков, полипептидов, нуклеотидов и т. д.), реализуется в капилляре, заполненном гелем (агарозой, целлюлозой, акриламидом и т. д.). На электрофоретическую подвижность биополимеров оказывает влияние характер пористости матрицы геля. Разделение молекул осуществляется по их размерам (так называемый «ситовый эффект»).

Компоненты смеси движутся в среде электролита с разными скоростями, образуя дискретные зоны. Катионные компоненты пробы, перемещаясь к катоду, обгоняют ЭОП и первыми регистрируются на электрофореграмме. Затем детектора достигает зона исходного раствора, в которой перемещаются нейтральные компоненты. Нейтральные соединения мигрируют с одинаковой скоростью, равной скорости ЭОП, и не могут быть разделены. В зависимости от их способности поглощать в УФ-излучении на электрофореграмме регистрируется пик, называемый системным. Для его идентификации в пробу часто добавляют специальные вещества – маркеры (ацетон, бензиловый спирт, оксид мезитила).

Поведение анионных компонентов пробы зависит от соотношения скоростей миграции электромагнитного потока и анионов. Если скорость электромиграции аниона меньше скорости ЭОП, он может быть зарегистрирован на той же электрофореграмме после системного пика. В противном случае анион выйдет из капилляра в прианодное пространство. Описанный вариант носит название капиллярного зонного электрофореза, в режиме которого могут определяться катионы и медленно мигрирующие анионы.

Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ)объединяет принципы электрофореза и хроматографии. Введенная в 1984 г. японским ученым Терабе МЭКХ получила наиболее широкое распространение среди других вариантов капиллярного электрофореза, в первую очередь, за счет способности разделять как ионогенные, так и незаряженные компоненты проб. Разделение нейтральных соединений стало возможным благодаря введению в состав ведущего электролита ПАВ – мицеллообразователей.

Компоненты пробы распределяются между фазой раствора и мицеллой, причем константа этого распределения специфична для каждого сорта молекул пробы. На электрофореграмме регистрируются нейтральные компоненты, а также медленно мигрирующие анионы пробы. В МЭКХ применяется новая техника концентрирования заряженных или нейтральных частиц – свипинг (sweeping), суть которой заключается в том, что аналиты концентрируются мицеллой, которая проникает в зону образца. При этом (в отличие от стэкинга) проводимость раствора образца близка проводимости ведущего электролита. Свипинг некоторых анионных аналитов дает высокие факторы концентрирования (в 1 000 раз) без какой-либо стадии предварительного концентрирования.

Для качественного и количественного анализа в КЭ используются два важнейших параметра: площадь (или высота) пика на электрофореграмме и время миграции. На точность определения площади (высоты) пика особенно влияет вводимый объем образца. Точность улучшается с повышением концентрации образца, особенно когда используется площадь, а не высота.

Важной областью применения капиллярного электрофореза (таблица 9.2) стала фармацевтика. Оценка чистоты лекарственных препаратов и хиральные разделения на 90% выполняются различными вариантами КЭ.

Таблица 9.2 – Использование различных вариантов КЭ для характеристики объектов биофармацевтики

Вид капиллярного электрофореза	Применение
Зонный капиллярный электрофорез	Белки, пептиды, гликопротеины, моноклональные антитела, олигосахариды

Окончание таблицы 9.2

Вид капиллярного электрофореза	Применение
Изоэлектрическая фокусировка	Белки, пептиды, гликопротеины, моноклональные антитела; определение изоэлектрической точки
Капиллярный гель-электрофорез	Олигонуклеотиды, ДНК, полисахариды; определение молекулярных масс белков
Мицеллярная электрокинетическая хроматография	Пептиды, углеводы

Развитие новых возможностей метода привело к расширению круга соединений и областей, доступных для анализа с использованием КЭ: криминалистика (анализ наркотиков), биомедицинские исследования, экологический мониторинг (анализ пестицидов, фунгицидов), анализ продовольственного сырья, пищевых продуктов, напитков (определение кофеина в растворимом кофе, ароматических альдегидов в винах); исследование и определение отдельных комплексных форм d-элементов в растворе.

В случае изотахофореза проба движется между двумя электролитами с различными подвижностями ионов. Как вариант вытеснительной хроматографии изотахофорез может быть использован на стадии предварительного концентрирования перед разделением методом КЭ.

В последние годы часто применяют капиллярный аффинный электрофорез и электрохроматографию. В последнем варианте воплощается техника высокоэффективного капиллярного электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии: разделение осуществляется в кварцевых капиллярах с внутренним диаметром 50–100 мкм, упакованных ультрасорбентом (диаметр частиц сорбента < 3 мкм). Течение элюента и перенос пробы происходит за счет электроосмотического потока.