Методика взятия, фиксирования и уплотнения материала для гистологического исследования.

Приготовление гистологического препарата включает в себя следующие этапы.

1. Взятие материала – кусочка ткани или органа.

При заборе материала необходимо выполнять следующие правила:

1) забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, при возможности от живого объекта, чтобы как можно лучше сохранить структуру исследуемых клеток;

По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов:

а) срезы органов,

б) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки),

в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты.

Материалом для гистологического исследования могут служить кусочки органов экспериментальных животных, полученные путем:

• прижизненного иссечения у человека/животного кусочков тканей (биопсия),

• трупный материал,

• мазки жидких исследуемых материалов (крови, костного мозга).

2) забор материала должен проводиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани: участки органов, подвергшихся травмированию (например, при зажиме пинцетом) не следует оставлять для исследования.

3) толщина кусочка не должна превышать 5-10 мм, чтобы фиксирующий раствор смог проникнуть на всю глубину ткани;

Поперечные же и продольные размеры не имеют столь важного значение и определяются задачами исследования.

Если орган состоит из участков, различных по своему строению, необходимо проводить разрез таким образом, что бы все они попали в кусочек, а при не возможности – брать кусочки отдельно из каждого участка. Например, при взятии кусочков мозга человека или крупных лабораторных животных приходиться вырезать участки из определенных отделов. Из почки можно вырезать один кусочек, охватывающий всю толщину органа от капсулы до лоханки, что обеспечивает попадание в него всех слоев. Если орган имеет однородное строение (большинство желез, мышцы), то выбор места для вырезания кусочка не имеет большого значения.

Если необходимо приготовить гистологические препараты из стенки кишечника, иссекают нужный отрезок органа, ополаскивают его в изотоническом растворе хлорида натрия (что бы не высохла серозная оболочка), разрезают вдоль (напротив брыжейки) и накалывают с помощью игл на восковую или пробковую подушку в расправленном состоянии слизистой оболочкой кверху.

Взятие материала из легкого также имеет некоторые особенности, ибо легкое всегда содержит воздух и ткань его плавает, не погружаясь полностью в фиксирующую жидкость. Для полного  погружения необходимо кусочек органа завернуть в марлю в месте с каким-либо грузом.

4) обязательно необходимо произвести маркировку кусочка, при этом указываются наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора.

2. Фиксация материала.

Фиксация материала проводится для того, чтобы остановить обменные процессы в клетке и сохранить ее от распада.

Для этого взятый на исследование кусочек ткани погружают в фиксирующий раствор.

Раствор может быть:

• простым – состоят из одного вещества (спирт или формалин)

• сложным – состоят из нескольких веществ (раствор Карнуа, фиксатор Цинкера).

Фиксатор вызывает денатурацию белков и сохраняет структуру клеток в состоянии, близком к прижизненному. Фиксацию можно проводить также путем замораживания – охлаждением жидким азотом или струей углекислого газа.

Существует ряд общих правил фиксации:

1) объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемого кусочка ткани;

2) фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон, по этому на дно сосуда кладут вату или кусочек фильтровальной бумаги или подвешивают кусочек на нитке;

3) продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего от скорости проникновения фиксатора в ткань;

4) различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические компоненты клетки.

Большинство фиксаторов оказывает уплотняющее действие на обрабатываемый  материал. Размер исследуемых кусочков должен быть таким, чтобы произошло полное его пропитывание в оптимальные для данного фиксатора сроки.

После фиксации материал промывают для того, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей. Способ промывания зависит от методики фиксации. Например, после фиксирующих смесей, содержащих пикриновую кислоту, дихлорид ртути, трихлоруксусную кислоту, применяют этиловый спирт разной концентрации. После фиксации в формалине, в жидкостях, содержащих хром, осмиевую кислоту, обычно употребляют воду. В большинстве случаев промывку кусочков тканей производят в проточной водопроводной воде.

После промывания кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации (иначе гидрофобный уплотнитель не сможет проникнуть в ткань).

3. Заливка кусочков ткани в уплотняющие среды (парафин, смолы) – или замораживание.

Приготовление высококачественных гистологических препаратов требует наличия равномерно тонких срезов с исследуемого объекта. Для того чтобы их получить, кусочки тканей надо пропитать и залить такой средой, которая превратила бы их в хорошо режущуюся массу.

Наиболее употребительными для этих целей материалами являются парафин.

Заливка в парафин требует тщательного соблюдения двух основных условий:

1) препарат должен быть полностью обезвожен,

2) не должен содержать спирт.

После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином, специально приготовленным для этих целей и хранящимся в термостате.

2) Техника изготовления срезов, их окраска и заключение.

4. Приготовление срезов на микротоме или ультрамикротоме с помощью специальных ножей .

Микротом (от греч. mikros — малый и tomē — рассечение, отрезок) — специальное механическое устройство, предназначенное для изготовления тонких срезов (от десятков и сотен нанометров до сотен микрометров), используемых в качестве объектов исследования методом микроскопии.

В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож, направляемый под углом к поверхности парафинового блока, срезает с него тонкой слой органа (срез) заданной толщины

Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий.

Ультрамикротом ("ультратом") – это микротом, на котором получается очень тонкие срезы (до 20 нм, минимум 5 нм), исследуемые в электронном микроскопе.

После этого срезы (для того чтобы можно было подвергнуть дальнейшей обработке) для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла в расправленном положении, а для электронной – монтируются на специальные сеточки.

5. Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии).

Перед окраской срезов необходимо удалить уплотняющую среду (выполнить депарафирование) с помощью любого его растворителя – бензола, толуола, ксилола, бензина. Особенно тщательно удаляют парафин перед исследованием ткани в поляризационном микроскопе, так как парафин обладает двоякопреломляющим свойством.

Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.

С помощью окраски достигается контрастность изучаемых структур. Красители можно подразделить на:

• основные

• кислые

• нейтральные

Наиболее широко применяются основные красители (гематоксилин) и кислые (эозин). Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными красителями. Часто используются и сложные красители.

По происхождению различают краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные. Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и в Армении.

К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др. В настоящее время большинство красок готовят синтетически (искусственные краски).

По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски:

• ядерные (окрашивание ядра): гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовая синь, азур, тионин;

• цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму),: эозин, пикрофуксин;

• специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры: судан Ш (окрашивает жир в оранжевый цвет), осмиевая кислота (импрегнируемый ею жир окрашиватся в черный цвет), резорцинфуксин Вейгерта (дает темно-синюю окраску эластических волокон), орсеин (окрашивает эластические волокна в бурый цвет). Метиленовый синий окрашивает нервные элементы в синий цвет, а при импрегнации серебром они приобретают коричневый цвет.

6. Просветление срезов в ксилоле и толуоле.

Одним из основных условий, определяющих пригодность гистологических препаратов к микроскопическому исследованию, является их прозрачность. Кроме того, препараты должны быть защищены от высыхания и загрязнения. Все это обеспечивается просветлением и заключением в специальные среды, которые можно подразделить на:

• смешивающиеся с водой (глицерин, гуммиарабик, поливиниловый спирт, желатин)

• не смешивающиеся с водой (ксилол, толуол, их смеси с фенолом, эфирные масла).

7. Заключение

Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду.

После данных процедур препарат можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго храниться и многократно использоваться. Для электронной микроскопии каждый срез используется только 1 раз, при этом он фотографируется, и изучение структур ткани производится по электронограмме.

Если ткань имеет жидкую консистенцию (например, кровь, костный мозг), то препарат изготавливают в виде мазка на предметном стекле, который затем также фиксируется, окрашивается и изучается.

Из ломких паренхиматозных органов изготавливают препараты в виде отпечатка органа, проводят разлом данного органа, затем к месту разлома прикладывают предметное стекло, на которое приклеиваются свободные клетки. После этого препарат фиксируется и изучается.

Из некоторых органов (например, брыжейки, мягкой мозговой оболочки) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливают пленочные препараты путем растягивания или раздавления между двумя стеклами с последующей фиксацией и заливкой в смолы.

Строение клетки, как саморегулируемой системы организма.