[Мікробіологія] Лекції / #2 med-physiology

DNA-DNA hybridization

Strain 1

Heat

+

Strain 2

0% Homology	100% Homology

МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

КРИМИНАЛИСТИКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТЦОВСТВА

DNA microarray - ДНК-микрочип

Пластина с нанесенными на нее в определенном порядке фрагментами ДНК известной последовательности. ДНКмикрочипы могут одновременно измерить экспрессию десятков тысяч генов у человека и выявить около миллиона мутаций.

DNA microarray - ДНК-микрочип

Активная работа гена в ткани выражается в накоплении его матричной РНК (мРНК). Все мРНК экстрагируются из образца ткани, и с помощью фермента обратной транскриптазы на них синтезируется т.н. комплементарная ДНК (кДНК), которая значительно устойчивей и удобней в работе, чем мРНК.

Микрочип для

40000 проб

•Полученный набор кДНК метят с помощью флуоресцентных или радиоизотопных меток. Содержание индивидуальных кДНК в образце прямо пропорционально содержанию их мРНКматриц и, следовательно, уровню активности соответствующих генов.

•Смесь кДНК наносят на микрочип, в каждой точке которого пришиты ДНК-фрагменты, соответствующие кодирующей последовательности одного из генов. кДНК находят «свои» точки и связываются (гибридизуются) с ними по принципу комплементарности. Чем больше в растворе кДНК данного вида, тем больше ее прикрепляется к своей точке. Затем специальное сканирующее устройство определяет содержание кДНК в каждой точке микрочипа, а программа соотносит его с названием гена, представленного данной точкой.

•	Результатом исследования является матрица из
	точек,	интенсивность	которых	прямо

пропорциональна активности соответствующих генов.

Какие гены работают

в опухолевых клетках? Normal cell

Known gene	Cy3 dye
sequences

	Isolation RNA
Glass slide (chip)	Cy5 dye

YELLOW - если ген экспрессируется и в больной (Cy5) и в нормальной

(Cy3) тканях, то в данном пятне будет гибридизоваться ДНК, меченная

и красной и зеленой красками, и в результате получится желтый цвет Cancer cell

RED - если ген экспрессируется только в больной (Cy5) ткани, то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная красной краской

GREEN - если ген экспрессируется только в здоровой (Cy3) ткани, то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная зеленой краской

BLACK – если ген не экспрессируется ни в больной, ни в здоровой ткани

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Цели

•обнаружение в патологическом материале конкретного вида

микроорганизма без выделения чистой культуры

•идентификация микроорганизмов

•генотипирование микроорганизмов

Праймеры для ПЦР

Праймер (англ. primer) — это короткий фрагмент НК, который служит стартовой точкой при репликации ДНК. Праймеры необходимы ДНК-полимеразам, так как ДНК-полимеразы могут только наращивать существующую цепь.

•Создание своих праймеров

•Программы: PrimerSelect (DNASTAR), Oligo

•Необходимо знать последовательность (генбанк)

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Принцип осуществления

патологический материал или штамм микроорганизма



выделение ДНК



нагрев



расплетение ДНК на две нити



добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’- концам искомого гена)



охлаждение



связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена



ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Принцип осуществления



добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов



нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров



повторение циклов (30-80) – накопление (амплификация) искомого гена



резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена



определение количества ДНК с помощью электрофореза

+количество ДНК увеличивается

–количество ДНК не увеличивается

•Выделенная ДНК

•Буфер

•Mg

•dNTPs (dA, dC, dT, dG)

•Термостойкая ДНКполимераза –

-Taq-полимераза -

Thermus aquaticus

-Pfu-полимераза -

Pyrococcus furiosus

-Pwo-полимераза-

Pyrococcus woesei

•Праймеры («туда и обратно») – cпецифичность реакции

•Амплификатор