Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5

Электрофорез в агарозном геле

М.Сомма, М.Кверчи

WORLD HEALTH ORGANIZATION	ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE	BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION	ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA	ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

Электрофорез в агарозном геле

2

Содержание

Сессия 5

Электрофорез в агарозном геле

Введение	3
Физические принципы электрофореза в агарозном геле	3
Компоненты электрофореза в агарозном геле	6
Экспериментальная часть	9
Литература	13

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5

Электрофорез в агарозном геле

3

Введение

Электрофорез в гелях – это метод, который служит для разделения макромолекул на основе их размера, электрического заряда и других физических свойств. Термин электрофорез описывает миграцию заряженных частиц под воздействием электрического поля. Первая часть слова «электро» относится к электричеству, а вторая часть слова «форез» происходит от греческого форос (phoros), что означает «переносить». Таким образом, электрофорез в гелях, - это метод, в котором молекулы вынуждены перемещаться через пространство геля под воздействием электрического тока. Движущей силой электрофореза является напряжение, прикладываемое к электродам на каждом конце геля. Свойства молекул определяют, насколько быстро электрическое поле может перемещать их через желеобразную среду.

Много важных биологических макромолекул (например, аминокислоты, пептиды, белки, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты) обладают ионизируемыми группами, и при любом заданном рН, существуют в растворе как электрически заряженные частицы, либо как катионы (+), либо как анионы (-). В зависимости от природы заряда среды, заряженные частицы будут мигрировать либо к катоду, либо к аноду. Например, когда электрическое поле прилагается к гелю при нейтральном рН, отрицательно заряженные фосфатные группы ДНК способствуют ее перемещению в сторону анода

(Westermeier, 1997).

Электрофорез в агарозном геле является стандартным методом, используемым для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. Эта методика проста, быстро осуществляется, и способна разделять фрагменты ДНК, которые не могут быть разделены надлежащим образом с помощью других процедур. Более того, локализация ДНК в геле может быть определена путем окрашивания бромистым этидием, - флуоресцентным интеркалярным красителем, в низких концентрациях. В следующих разделах будут описаны физические принципы, компоненты (матрикс геля, буфер, буфер для нанесения и маркер), а также процедуры, применяемые для подготовки электрофореза в агарозном геле (Sambrook et al., 1989).

Физические принципы электрофореза в агарозном геле

Гель-электрофорез – это метод, используемый для разделения нуклеиновых кислот и белков. Разделение макромолекул зависит от двух переменных: заряда и массы. Когда биологический образец, такой как ДНК, смешивается в буферном растворе и наносится на гель, две эти переменные действуют одновременно. Электрический заряд от одного электрода отталкивает молекулы, в то время как другой электрод

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5

Электрофорез в агарозном геле

4

одновременно притягивает молекулы. Силы трения материала, образующего гель, действуют как «молекулярное сито», разделяя молекулы по размеру. В процессе электрофореза макромолекулы вынуждены перемещаться через поры, и скорость их перемещения через электрическое поле зависит от следующих параметров:

•сила электрического поля

•размер и форма молекул

•относительная гидрофобность образцов

•ионная сила и температура буфера, в котором движутся молекулы

Для полного понимания процесса разделения заряженных частиц в гельэлектрофорезе, важно посмотреть на простое уравнение, имеющее отношение к электрофорезу. Когда к электродам прикладывается напряжение, создается градиент

потенциала Е, что может быть выражено уравнением:
E = V/d	(1)

где V, - прилагаемое напряжение, измеряемое в вольтах, и d – расстояние между электродами в сантиметрах.

Когда создается градиент потенциала E, на заряженной молекуле образуется сила F,

что выражается уравнением:
F = Eq	(2),

где q – заряд на поверхности молекулы в кулонах. Эта сила, измеряемая в ньютонах, перемещает заряженную молекулу к электроду.

Существует также сопротивление трения, которое замедляет движение заряженных молекул. Эта сила трения является функцией от следующих параметров:

•гидродинамический размер молекулы

•форма молекулы

•размер пор среды, в которой происходит электрофорез

•вязкость буфера

Скорость v заряженной молекулы в электрическом поле является функцией градиента потенциала, заряда и силы трения молекулы и может быть выражена уравнением:

v = Eq / f

(3)

где f – это коэффициент трения.

Электрофоретическая скорость М любого иона может быть определена скоростью

иона, разделенной на градиент потенциала:
M = v / E	(4)

В дополнение, из уравнения (3) можно видеть, что электрофоретическая скорость М может быть также выражена как заряд молекулы q, поделенный на коэффициент трения f.

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5

Электрофорез в агарозном геле

5

M = q / f

(5)

Когда создается разница потенциалов, молекулы с различным суммарным зарядом начинают разделяться в соответствии с различной электрофоретической подвижностью. Электрофоретическая подвижность является очень важным параметром, характеризующим заряженную молекулу или частицу, этот параметр зависит от величины рК заряженной группы и размера молекулы, или частицы. Даже молекулы с одинаковым зарядом будут разделяться, если различен размер молекул, так как они будут испытывать воздействие различной по величине силы трения. Линейная двухцепочечная ДНК перемещается через матрикс геля со скоростью, которая обратно пропорциональна десятичному логарифму (log10) числа нуклеотидных пар. Молекулы большего размера перемещаются медленнее, вследствие большего сопротивления трения и меньшей эффективности прохождения через поры геля.

Ток в растворе между электродами создается в основном за счет ионов буфера и, в небольшой степени, за счет ионов анализируемого образца. Соотношение между током I, напряжением V и сопротивлением R выражается как в законе Ома:

R = V / I

(6)

Это уравнение демонстрирует, что при заданном сопротивлении R возможно ускорить электрофоретическое разделение путем увеличения подаваемого напряжения V, что приведет к соответствующему увеличению тока I. Пройденное расстояние будет пропорционально величине тока и времени. Однако, повышение напряжения V и соответствующее увеличение тока I может стать причиной одной из серьезных проблем для разных видов электрофореза, а именно – образования тепла. Это может быть проиллюстрировано следующим уравнением, в котором мощность W (измеряемая в ваттах), генерируемая в процессе электрофореза равна произведению сопротивления и квадрата тока:

W = I2 R

(7)

Так как основная часть мощности, производимая в процессе электрофореза, растрачивается в виде тепла, могут возникать следующие нежелательные эффекты:

•возросшая скорость диффузии ионов исследуемого образца и буфера, приводящая к расширению зоны разделяемого образца

•образование конвекционных токов, что приводит к перемешиванию разделенных образцов

•термическая нестабильность образцов, которые более чувствительны к нагреванию (например, денатурация ДНК)

•уменьшение вязкости буфера, приводящее к снижению сопротивления среды.

Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов

Сессия 5