МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
Учреждение образования «Гродненский государственный аграрный университет»
Кафедра переработки и хранения животного сырья
Лабораторная работа
«Определение коллагена в мясе»
Выполнила студентка
3 курса 4 группы ИТФ
Пастырчук Дарья Дмитриевна
Гродно, 2012
Цель работы. Приобрести навык в определении количественного содержания коллагеновых белков в образцах различных видов тканей убойных животных и птицы.
Задачи. Экстрагировать коллаген и количественно определить его на основе минерализации, а также путем гидролиза коллагеновых полипептидов с последующим проведением качественной реакции на оксипролин и фотометрированием.
Объекты исследования. Образцы мышечной и соединительной ткани убойных животных и птицы.
Методические указания. Количественное определение коллагена в животных тканях проводят либо по методу В. П. Воловинской, основанному на экстрагировании фракции коллагеновых белков и последующем определении в экстрактах белкового азота, либо по количественному содержанию аминокислоты оксипролина, специфической для коллагена. Метод основан на предварительном гидролизе коллагеновых полипептидов с последующим проведением качественной цветной реакции на оксипролин и фотометрированием. Включает следующие основные операции:
- гидролиз ткани соляной кислотой в присутствии хлорида олова;
- нейтрализация кислоты и удаления олова;
- окисление оксипролина;
- развитие цветной реакции с пара-диметиламинобензальдегидом;
- измерение интенсивности окраски фотометрированием.
Результаты, полученные по этому методу, приведены в таблице.
Таблица. Массовая доля(%) оксипролина и соединительнотканных белков в разных видах тканей
Образец |
Оксипролин |
Соединительнотканные белки |
Поясничная мышца свиней |
0, 046 |
0,371 |
Шейная часть туши крупного рогатого скота |
0, 322 |
2,600 |
Филей крупного рогатого скота |
0,220 |
1,800 |
Сырые связки убойных животных |
10,56 |
85,200 |
Расчет количества белка ведут на основании известного массового содержания оксипролина (23% к сумме аминокислот) в коллагенах.
Для выделения оксипролина мышечную ткань подвергают гидролизу с применением кислоты или щелочи. Продолжительность гидролиза имеет большое значение: недостаточная приводит к неполному освобождению оксипролина, а избыточная – к частичному его разрушению.
Добавление хлорида олова II (не менее ¾ количества белка в навеске) необходимо для предотвращения образования гуминовых веществ.
При нейтрализации и подщелачивании гидролизата используют карбонат натрия, чтобы предотвратить образование ионов олова в щелочной среде и облегчить его удаление в виде гидрата олова.
Окисление оксипролина пероксидом водорода в щелочной среде приводит к образованию продуктов, дающих с пара-диметиламинобензальдегидом цветную реакцию. Следы пероксида водорода могут понизить интенсивность окраски или придать раствору неспецифический оттенок, поэтому его избыток разрушают нагреванием на водяной бане при 80⁰С. При этом рекомендуется добавлять мочевину, образующую довольно стойкое соединение с пероксидом водорода CO(NH2)2 H2O2.
Интенсивность образовавшейся розовой окраски измеряют спектрофотометрически или колориметрически. Окраска устойчива в течение 60-90 мин. В пределах до 25 мкг оксипролина поглощение подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера. Специфичность реакции очень высока.
Из всех аминокислот, содержащихся в кислотном гидролизате белков мяса, определению мешает только тирозин. По данным Е. Вербицкого и Ф. Е. Деасраджа, окраска тирозина составляет 1,3% окраски, развиваемой оксипролином. Поэтому используется поправка на тирозин – 0,072 единицы оптической плотности на 1 см кислотного гидролизата, соответствующего 40 мг мяса:
Полная поправка с учетом окраски самого гидролизата, соответствующей 0,01±0,003, составляет 0,082 единицы оптической плотности на 40 мг мяса в 1 см гидролизата.
Для проведения цветной реакции в зависимости от ожидаемого содержания соединительной ткани в продукте следует брать разные объемы испытуемого раствора. Если, например, на анализ взята препарированная длиннейшая спинная мышца свиньи, то объем исследуемого раствора может быть равен 1 см(при разведении гидролизата до 100см). Массовая доля соединительной ткани в указанной мышце составляет 0,2-0,4%. Если же взят образец, содержащей больше соединительной ткани, то на цветную реакцию нужно значительно меньше испытуемого раствора. Объем раствора доводят до 1 см дистиллированной водой.
Подготовка проб к анализу. Ткани животных предварительно режут на маленькие кусочки и взвешивают согласно нижеприведенным рекомендациям в соответствии с принятым методом определения.