Культура органов и тканей растений

Культура органов и тканей растений.

Содержание лист Введение. 2 1.Регенерация растения из протопластов. 4 2. Соматический эмбриогенез. 6 3. Размножение побегами. 11 4. Культура генеративных органов. 12 4.1 Культура пыльников. 12 4.2 Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек. 14 Выводы. 16 Список литературы. 20 Введение. Успехи в исследовании гормонов и биохимии ДНК сделали возможным вмешательство в генетику растений. Термин биотехнология используется для описания практической реализации этой возможности. Среди важных методов биотехнологии следует отметить культуру тканей, которая может быть осуществима только благодаря разработанным теперь представлениям о гормонах, регулирующих развитие организма (1). В идеальных случаях культура тканей используется для получения целого растения из одиночных, генетически измененных клеток. Кроме того, культура тканей может быть использована для получения в течение короткого периода времени многих идентичных копий (клонов) растений.(1,2) В настоящее время культура тканей широко используется для размножения растений путем клонирования, поскольку получаемые при этом индивиды генетически идентичны. Основы экспериментальной эмбриологии растений были заложены исследованиями Массарта, который наблюдал набухание завязей некоторых растений после обработки их спорами Lycopodium, нежизнеспособными поллиниями и водными экстрактами пыльцы. В связи с этим было высказано предложение, что пыльцевая трубка не только обеспечивает перемещение ядер спермиев к яйцеклетке, но одновременно переносит в завязь различные ауксины, стимулирующие ее рост. Изучая тонкие срезы корня свеклы и одуванчика и сегменты стебля тополя, помещенные на фильтре во влажную камеру, ученые пытались определить то минимальное количество клеточной массы, которое еще способно к росту. Эти исследования показали, что каллус не образуется при толщине среза, меньшей 1,5 мм. Габерландт предпринял попытку культивирования клеток, изолированных из листьев ряда покрытосеменных растений, в частности клеток палисадной паренхимы Lamium purpureum и волосков Tradescantia virginica и Pulmonaria mollissima. Исходное предположение автора о том, что хлорофиллсодержащие клетки полностью обеспечивают себя питательными веществами, необходимыми для их жизнедеятельности и роста, не было подтверждено экспериментально. Однако эти неудачные попытки сыграли важную роль в развитии экспериментальной эмбриологии, поскольку заложили основу для поиска адекватных питательных смесей и условий, необходимых для поддержания роста органов, тканей и клеток растений. Большое влияние на развитие исследовании в области культур тканей и клеток растений оказали работы зоологов, уже научившихся к тому времени успешно выращивать ткани млекопитающих на средах сложного состава, содержащих плазму крови или экстракты эмбриональных тканей. Под влиянием этих работ Прэт и другие авторы перешли к культивированию тканей растений на средах с добавками растительных экстрактов. Эти эксперименты не дали положительных результатов. Более успешными оказались попытки с подбором состава синтетической питательной среды, обеспечивающей в культуре рост апикальной меристемы. К числу "первопроходцев" в деле разработки техники культуры тканей следует отнести Ф. Р. Уайта из США и французского ученого Р. Готре. Уайт был первый, кто сумел создать условия для длительного роста отделенных корней томата в искусственных условиях. Этот исследователь научился также выращивать кончики боковых корней, развившихся in vitro, и получил первый долгоживущий клон культивируемых корней томата. Вслед за работами Уайта были опубликованы данные о культивировании камбиальных тканей Salix capraea и моркови. Готре выращивал экспланты камбия и флоэмы корня моркови на среде, содержащей неорганические соли, глюкозу, тиамин, цистеин-гидрохлорид и индолилуксусную кислоту (ИУК). Методические приемы, впервые изложенные в работах Уайта и Готре, заложили основу для получения культур тканей самых разнообразных видов растении. Со времени появления пионерских работ Уайта и Готре в области культивирования тканей был достигнут большой прогресс. В настоящее время в культуре тканей и органов растений используются следующие способы размножения: регенерация из протопластов и (или) каллуса, соматический эмбриогенез, размножение побегами, а также культура генеративных органов (пыльников, завязей, семяпочек) (1,3,4). 1.Регенерация растения из протопластов. Выделение и культивирование протопластов представляют собой относительно новое направление экспериментальной физиологии растений (1,3,5).Для выделения протопластов широко используются ферменты - целюлазу и проктиназу, при этом процессы осмотического сжатия и разрушения клеток минимизируются. Выход протопластов зависит от физиологического состояния растения - донора, чистоты используемых ферментов, конкретного состава ферментной смеси, величины рН и осматической силы соответствующих растворов. После разрушения клеточных оболочек протопласты переносят на среду, свободную от ферментов, пропуская суспензию протопластов через фильтры с диаметром отверстия ? 8 мкм. В некоторых случаях с этой же целью проводят низкоскоростное центрифугирование суспензии. Полученную суспензию протопластов высевают на жидкую питательную среду (обычно 1 каплю суспензии на пластиковую чашки Петри). При таком способе культивирования легко пополнять культуральную жидкость, кроме того, кроме того, эти условия благоприятны для газообмена и диффузии выделяемых продуктов. В других случаях аликвоты (2 мл) суспензии протопластов в жидкой питательной среде разливают в пластиковые чашки Петри., где их осторожно смешивают с равным объемом той же среды, но содержащий 1%-ный агар (при температуре ниже 45 ?С), затем чашки Петри герметизируют с помощью парафина и хранят в перевернутом положении при температуре 28 ?С и непрерывном освещении (2300 лк) (2). При этом можно наблюдать всю последовательность процессов роста, развития и дифференциации протопластов. Протопласты обычно культивируют на модифицированной среде МС или среде Нагата и Такебе, дополняя эти среды теме или иными стимуляторами роста в зависимости от типа протопластов и видовых особенностей объекта (2). Успех культивирования протопластов зависит от их способности синтезировать новую клеточную оболочку, делиться и давать начало регенерантам. В настоящее время используют несколько методических подходов регенерации растения из протопластов. Например, слияние протопластов двух различных растений с получением гибридных клеток (межвидовые гибриды петунии, моркови, картофеля, межродовые гибриды картофеля и томата); использование Тi-плазмид корончатых галлов, образованных Agrobacterium tumefaciens или каких либо других методов инъекции ДНК для введения в протопласты специфических генов, далее культуру тканей используют для регенерации растения из отдельных протопластов (получение устойчивых к гербицидам растений табака и подсолнечника) (1). Наиболее многообещающей областью приложения культур протопластов является проведение "парасексуальной гибридизации" (2). Использование этой методики раскрывает широкие возможности по управлению геном. Это явление - индуцированное слияние протопластов - впервые наблюдал Пауэр и др. в 1970 г. В качестве индуктора слияния эти авторы использовали NaNО3 (0,25 М). Эффект данного соединения был в целом аналогичен влиянию вируса Сендай, индуцирующего слияние клеток животных. Повышение величины рН среды и увеличение концентрации в ней кальция также могут приводить к слиянию протопластов. Частота слияния протопластов под действием NaN03 ниже той, которая может быть достигнута на основе использования полиэтиленгликоля (6). Эффективность этого процесса в значительной мере возрастает, если суспензию протопластов предварительно обработать мембраноактивными соединениями, такими, как лизоцим. В результате слияния протопластов одного вида образуется гомокарион, из протопластов разных видов формируется гетерокарион. Большое количество межвидовых гибридов получено у моркови, Petunia и Nicotiana.(1,2).Образование межродовых гибридов наблюдали при слиянии протопластов Glycine max и протопластов представителей ряда других родов, таких как Angelica, Cicer, Hordeym, Medicago, Melilotus, Pisum и Vicia, а также Nicotiana + Petynia. Для выявления гетеропластических продуктов слияния протопластов используют различные "селективные маркеры" (3,5). При слиянии протопластов рапса и сои, табака и моркови, Atropa belladonna + Penynia hybrida, A. belladonna + Nicotiana tabacum, а также при межвидовой гибридизации у Torenia в качестве таких маркерных признаков служили свойства пластид. Наряду с ними при идентификации соматических гибридов применяют и ряд других признаков. Первое сообщение об успешном получении межвидового гибрида путем слияния протопластов касалось Nicotian glauca + N. Langsdorfii (2). Этот гибрид во всех отношениях был идентичен природному амфидеплоиду. Аналогичный соматический гибрид получен при работе с Petunia. Используя в качестве родительских форм зеленые растения и растения-альбиносы, удалось наблюдать успешное слияние протопластов у Diacus и табака. Получены регенеранты соматического гибрида табака путем слияния протопластов Nicotiana sylvestris (клеточная линия, устойчивая к канамицину) и N. knightiana. У обоих указанных растений была снижена способность к образованию побегов. С использованием хлорофиллдефектных мутантов были получены протопласты-гетерокарионы, которые давали начало гибридным регенератам Nicotiana и удалось получить также соматические гибриды травянистых и древесных видов (2). 2. Соматический эмбриогенез. В природных условиях зародыш, помимо зиготы, образуется из синергид, нуцелуса и клеток интегумента, т.е. только из тканей семяпочки. Экспериментальная индукция эмбриогенеза осуществлена как в соматических, так и в репродуктивных тканях самых разнообразных растений. Возможность получения целых растений на основе соматического эмбриогенеза была впервые продемонстрирована на моркови. Ф. Стюард из Корнеллского университета получил культуру тканей (зародыш) моркови из единичных клеток корня (1). Из камбиальной зоны корнеплода вырезали диски, захватывающую прилежащую флоэму, а нередко ксилему. При культивировании таких дисков на питательной среде, содержащей кокосовое молоко, наблюдали неорганизованный рост каллусной массы. В конечном итоге из каллуса дифференцировались многочисленные биополярные зародыши, которые в своем развитии повторяли путь зиготических зародышей, проходя стадии проэмбрио, глобулярную и торпеды). В дальнейшем из них развивались регенеранты с оформленным побегом и корнем. Огромное число зародышей образуется и в суспензионной культуре моркови при субкультивировании на соответствующей питательной среде. Они также развиваются подобно зиготическим зародышам и превращаются в полноценные растения. По Стюарду, соматическая клетка начинает вести себя подобно зиготе при соблюдении двух основных условий: во-первых, она должна быть освобождена от сдерживающего ее рост влияния других клеток той же ткани, и, во-вторых, обязательно присутствие в среде для культивирования кокосового молока (жидкого эндосперма незрелого кокосового ореха). Однако, как показали дальнейшие исследования ни то, ни другое условие в действительности не является необходимым. Бутенко и другие наблюдали соматический эмбриогенез при культивировании различных тканей - листа, черешка, цветоножки и стебля - женьшеня (Panax ginseng). Однако регенерации полноценных растений при этом не происходило. Несколько позднее Ченг и Синч сообщили о формировании целых регенерантов из эмбрионоидов в каллусных культурах, полученных из корней женьшеня. Им удалось даже наблюдать цветение в условиях in vitro. Данное явление сулит больше выгоды селекционерам, поскольку в естественных условиях цветение у женьшеня наступает лишь после длительного ювенильного периода, продолжительность которого составляет около трех лет. В настоящее время в качестве эсплантов используют практически все органы и ткани растений (7). Культивирование зародышей, находящихся на ранних стадиях развития, нередко существенно осложняется их высокой чувствительностью к составу питательной среды (6). В таких случаях бывает полезно начать с культуры интактных семяпочек и лишь затем выделять из них зародыши. Необходимо подчеркнуть, что не всегда решающее значение для успеха культивирования зародыша имеют его размеры. Правильнее было бы ориентироваться на число содержащихся в нем клеток и уровень эндогенных метаболитов. Однако регистрация последнего параметра пока не представляется возможной. Выбирая зародыш для культивирования, руководствуются такими критериями, как размеры зародыша и примерное число образующих его клеток. Важно также, чтобы развитие зародыша в условиях in vitro в целом было сопоставлено с аналогичным процессом, протекающим in vivo. Наиболее важным аспектом культивирования зародышей является получение межвидовых и межродовых гибридов, особенно в тех случаях, когда из-за гибели зародышей in vitro образуются стерильные гибридные семена. Зрелые зародыши Аllium сера, имеющие б-7 мм в длину, прорастали in situ после 5 дней культивирования на среде Нича с 5% сахарозой. Присутствие интактного эндосперма не оказывало существенного влияния на рост зародыша в этих условиях. Добавление в среду Нича индолилуксусной кислоты (ИУК) (1 мг/л) вызывало пролиферацию зародышевого корня и развитие аномальной корневой системы. На среде Нича, содержащей 0,5 мг/л индолилуксусной кислоты, происходили переориентация проростков и образование луковиц. Развитие листьев и фибразных корней в этих условиях подавлялось. Образование полноценных проростков наблюдали на среде Нича с триптофаном (5 мг/л) или при добавлении в питательную среду томатного сока (20 % объем/объем). При культивировании недифференцированных зародышей длиной 0,1 мм на среде Нича или на среде Нича с триптофаном создавались благоприятные условия для формирования нормальных проростков. В то же время на среде Нича недифференцированные зародыши продуцировали только каллус. Дифференциация корней отмечалась лишь в 6-недельной культуре. Проэмбрио, находящийся на глобулярной стадии, не может расти на среде Ннча, однако в присутствии индолилуксусной кислоты (I мг/л) он образует массивный каллус. При этом дифференцируются почкоподобные структуры, не способные к дальнейшему росту. Зародыш, изолированный из зрелого кокосового ореха (Cocos nucifera) хорошо растет на среде МС. Существенным образом влияет на этот процесс внесение в среду активированного угля, в его отсутствие ткань быстро буреет и прекращает свой рост. В условиях in vitro семядоли (гаустории) увеличиваются в размерах и превращаются в характерную мягкую губчатую ткань, которая всасывает из эндосперма питательные вещества, необходимые для роста зародыша. В условиях культуры семядоли приобретают темно-коричневый цвет и легко инфицируются при пересадке проростка, что приводит к его гибели. Рост корней в условиях in vitro можно стимулировать, отсекая первый большой корень, который развивается при прорастании зародыша, а также множество боковых и сублатеральных корней. Корневая система обычно лучше развивается в жидких культурах. При этом зародыш располагается на подложке из фильтровальной бумаги, помещенной на поверхность среды (2). Семена Costus speciosus, выделенные из незрелых плодов спустя 15-20 дней после опыления, не способны к прорастанию. Исследования зародышей в условиях in vitro, их инокулировали на разных стадиях развития семени, включая: 1) белые мягкие семена диаметром 1 мм; 2) серовато-черные семена, с вязким эндоспермом, неотделимым от зародыша; 3) серые семена с черным кончиком, в которых зародыши можно отделить от эндосперма; 4) зрелые семена, коричневато - черные, покрытые мягкой семенной кожурой, с большим гантелевидным зародышем и эндоспермом, однослойным на микропилярном конце зародыша, но ниже микропилярного воротничка его толщина достигает нескольких клеточных слоев; 5) семена полностью зрелые, черные, с твердой кожурой. Такой зародыш лишен суспензора; стадия с третьей по пятую в морфологическом отношении идентичны. Культуры зародышей Costus speciosus выращивали на 16-часовом дне при освещенности около 2500 лк на модифицированной среде МС+ индолилуксусная кислота (3 мг/л) + кинетин (2,5 - 5 мг/л). Культуры выращивали на 12-часовом световом дне (1,2 - 1,6 х 200 лм/кв.фут). Все исследуемые экспланты проявляли способность к каллусогенезу. Дифференциация корней отмечалась у Citrus grandis, Durio zibethus, Mangifera indica, Nephelium lappaceum и N. malainse. У Averrhoa carombola, Citrus microcarpa и Cucumis molo развились как корни так и побеги. Кончики побегов, пыльники и сегменты семядолей Thea sinensis культивировали на модифицированной среде МС + 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,0 - 2,8 мг/л). Оптимальная для роста каллусов среда содержала индолилуксусную кислоту (2,0 - 4,0 мг/л) и кинетин (2,0 - 4,0 мг/л). Однако наиболее выраженный эффект оказывало добавление в среду для культивирования КМ (10 % объем/объем). В культурах срезанных кончиков побегов каллусогенез отмечался только в зоне контакта с питательной средой. Каллусы развивались также из тканей пыльников тычиночных нитей, причем образование каллусов из нитей подавляло каллусогенез в пыльниках. В культурах сегментов семядолей индукция образования каллусов проходила легче. Каллусы, полученные из семядолей Thea sinensis cv. Chyi-Men и Pyng-Shoei, дифференцировались на среде МС + индолилуксусная кислота (1,0 мг/л) + кинетин (10,0 мг/л) с образованием регенерантов. Полученные регенеранты высаживали на вермикулит. Через некоторое время их переносили в почву. В начале они росли в питомнике, и лишь после этого растения помещали в полевые условия. Они характеризовались увеличенной длиной главного корня, иными массой и диаметром стебля, иными длиной и шириной листовой пластинки, площадью листовой поверхности, наличием у них цветочных бутонов "открытого" типа (в естественных условиях бутоны закрытого типа), иным числом цветков, семян в плоде и диаметром семян. Выращенные в условиях in vitro растения были использованы в качестве женского подвоя при скрещивании с высококачественным сортом чая Chin - Msin Dolong. Завязывание плодов при скрещивании наблюдали в 32,5 ? 15,8 % случаев, F1 - гибриды, полученные из этих семян, переносили из питомника в поле, где с этих растений собирали большой урожай чайного листа высшего качества. При скрещивании Secale cereale с тетраплоидной или гексаплондной разновидностью пшеницы не происходит развития семян тритикале. Это связано с присутствием двух доминантных генов Кч 1 и Кч 2. Культивируя зародыши, можно более половины из них довести до состояния взрослых растений. При скрещивании Hordeum vulgare и H.bulbosum развитие зародыша останавливалось через 15 суток после опыления. Однако в культурах изолированных зародышей при использовании соответствующей питательной среды были получены нормальные проростки. Зародыши межвидовых гибридов риса страдают теми или иными аномалиями. Выращивая их в УСЛОВИЯХ культуры, можно получать нормальные гибридные растения, устойчивые к неблагоприятным воздействиям и болезням. В культурах гибридных зародышей Hordeum vulgare Linn x Agropyron repens Linn, H. vulgare x Triticum aestivum эндосперм ячменя использовали в качестве ткани - "няньки". Зибур и Бринк сообщали о выращивании зародышей ячменя, трансплантированных на клеточный эндосперм Hordeum в условиях стерильной культуры. Стимулирующее действие на рост зародышей оказывали также экстракты из ткани эндосперма. Растущий на питательной среде эндосперм Hordeum использовался в качестве субстрата и для зародышей межродовых гибридов, полученных при скрещивании Hordeum, Triticum, Agropyron и Secale. Аналогичную методику трансплантации зародышей на ткань эндосперма Вильямc и де Латур разработали для пастбищных бобовых (Trifolium, Lotys и Ornithopus). При этом гибридный зародыш внедряли в клеточный эндосперм, изолированный из нормально развивающейся семяпочки, после чего зародыш вместе с эндоспермом переносили на поверхность питательной среды, содержащей агар. Культуру зародышей применяли для регенерации гаплоидных растений, получаемых методом элиминации хромосомного набора. По некоторым данным, выход гаплоидов ячменя при этом был достаточно высок. На основе селективной соматической элиминации одного или более геномов Hordeum bulbosum удалось получить гаплоидные растения Hordeum vulgare и Triticum aestivum. Культуры зародышей могут быть также использованы для преодоления самостерильности семян. В качестве примера можно привести семена Musa balbisiana Colla, не способных к прорастанию в естественных условиях. Желая получить проростки, Кокс и другие культивировали изолированные зародыши in vitro. Положительные результаты были получены также в культурах зародышей ряда межвидовых гибридов и при 2n х 4n скрещиваниях, включая Trifolium (T.repens x T.ambiguum и T.ambiguum x T.hubridum), Melilotus alba x M.officinalis, Phaseolus vulgaric x P.acutifolius, Medicado truncatula x M.orbicalaris и Lathirus clymenum x L.articulatus. Незрелые гибридные зародыши L.langi (Lilium. longiflorum x L.sudehime) и L.shikayama x L.henryi. успешно культивировали, используя нормальный эндосперм в качестве ткани - "няньки". Инокулируя гибридные зародыши на питательную среду на тех стадиях, когда аномалии развития еще не проявляются, удалось получить проростки многих важных культур: Gossypium arboreum Linn. (2n = 26) х А.hirsutum Linn. 4n = 52), Corchorus capsularis х C.olititorius, Carsia papaya x С.cauliflora, Allium сера x A. fistulosum. Побеги и плоды Solanum melondena серьезно страдают от насекомых вредителей Leucinodes orbonalis. В то же время некоторые виды баклажан к ним устойчивы, такие как S.khasianum и S.sisymbrifolium. Благодаря использованию культур зародышей была успешно проведена гибридизация S. melongena x S. khasianum. Этот метод занимает важное место в селекции Coffea - объекта, крайне вариабельного в генетическом отношении. Культивирование незрелых зародышей, полученных при скрещивании более или менее далеко отстоящих растений рода Coffea открывает больше возможности для получения новых гибридов. Весьма прибыльным делом оказалось культивирование зародышей орхидных. В ботаническом саду Сингапура уже получили таким образом 1431 гибрид и 142 самоопыляемых вида. Культуры зародышей применяют также для выведения семян из состояния покоя, например семян Magnolia soulangeana. Сообщалось также о сокращении продолжительности жизненного цикла (от семени до цветения) Iris благодаря культивированию зародышей. Природу факторов, регулирующих выход семян из состояния покоя, широко исследовали на гвинейской маличной пальме (Elaeis guineensis). При этом оценивали влияние степени оводненности семян и времени их замачивания перед началом культивирования зародышей. Методика культуры тканей позволяет исследовать всю последовательность процессов превращения зародыша в проросток. Особый интерес представляют такие семена, у которых отсутствует структурная дифференциация зародыша. В культуре таких семян можно проследить изменения, происходящие в них при подготовке к прорастанию и в ходе этого процесса. Семена корневых паразитов легко прорастают в отсутствие растения-хозяина, если в питательную среду добавить необходимые неорганические вещества - ростовые добавки. Ход морфогенеза определяется наличием специфического ростового гормона, что показано, например, на Orobanche aegyptiaca, Cistanche tubulosa и Santalum album. 3. Размножение побегами. Эта методика основывается на свойствах цитокинина усиливать рост побега и противодействовать ауксину в регуляции апикального доминирования. Верхушки растительных побегов помещают в культуральную среду с достаточно высокой концентрацией цитокинина для поддерживания роста побега и для развития боковых почек в пазухах листьев. После рассаживания отдельные побеги могут быть использованы для дальнейшего размножения или укоренения после обработки ауксином по данным Тосио Мурасиге из Калифорнийского университета.Этот методический подход применяют для размножения папоротников,орхидей и представителей семейства розоцветных (1). 4. Культура генеративных органов. Среди методов культуры тканей особое место занимает культура репродуктивных органов - пыльников,неоплодотворенных завязей и семяпочек,открывших перспективу разработки способа массового получения гаплоидных растений,представляющих ценный исходный материал для селекции. 4.1 Культура пыльников. Методики работы с культурой пыльников быстро совершенствуются. Йоханссон и Эрикссон предложили новый метод "двойного слоя" с добавлением в питательную среду активированного угля (АУ). Они культивировали пыльники в чашках Петри, содержащих в качестве нижнего слоя полужидкую среду с АУ, поверх которой наслаивалась жидкая среда без АУ. На такую двухслойную Н - среду помещали пыльники, изолированные на одноядерной стадии развития пыльцевых зерен. После инокуляции культуры выдерживали на протяжении семи дней при t = 7°С. Последующее культивирование пыльников проводили при t = 25° С в темноте в воздушной среде обычного состава или обогащенной СО2 (до 2%). В контрольном варианте пыльники переносили с двухслойной среды на жидкую, не содержащую АУ. Частота образования эмбриоидов в двухслойной культуре была в 3 раза выше, чем в контроле. В тех случаях, когда АУ вводили в агар-содержащую среду лишь на время и удаляли его накануне инокуляции пыльников, отмечалось увеличение числа эмбрионов по сравнению с культурами, растущими на среде, но обработанной АУ. Культуры плавающих на жидкой среде пыльников обладают рядом преимуществ по сравнению с эксплантантами, растущими на твердых средах. При использовании двухслойных сред, содержащих АУ, создаются еще более благоприятные условия для индукции эмбриогенеза. Как полагают, АУ абсорбирует из среды абсцизовую кислоту, выделяемую пыльниками, а также фенольные соединения, продуцируемые развивающимся зародышем (2,6). С целью получения андрогенных гаплоидов Saccaharum officinarum соцветия, изолированные на стадии диад - тетрат, подвергали холодовой обработке при t 1- 5°С в течение 5-10 дней. При культивировании пыльников на среде МС (модифицированная среда),содержащей от 0,5 до 2 мг/л 2,4 -дихлорфеноксиуксусной кислоты и от 0 до 2,0 мг/л кинетина, наблюдали индукцию каллугенеза. Увеличение концентрации сахарозы в среде до 20 % способствовало развитию диад и тетрад с образованием микроспор (3 -7 дневная культура) и многочисленных агрегатов. В 7-15 дневных культурах отмечалось деление ядра микроспоры на два равных или неравных ядра МС - среда, содержащая 5 % сахарозу, 2,0 мг/л 6-безиламинопурина и 2,0 нафтилуксусной кислоты, использовалась в качестве "дифференцирующей". Развитие растения, т.е. формирование корня и листов, проходило на среде Уайта с добавлением 1 мг/л индолилуксусной кислоты или 0,5 мг/л индолилмасляной кислоты ("растениеобразующая" среда). Число растений - регенерантов увеличивалось в присутствии гидролизата казеина. В клетках кончика корня у регенерантов насчитывалось от 5 до 90 хромосом, в то время как у растения - донора 2п = 120, из полученных андрогенных растений отбирались экземпляры с наибольшим содержание сахара, которые затем размножались. В этой же работе культивировали пыльники Hevea braxiliensis, изолированные на одноядерной стадии развития пыльцевых зерен. Спустя 5 суток от начала культивирования ядра микроспоры делились с образованием двух дочерних ядер. Через 25 дней около 20 % пыльцевых зерен превращалось в многоклеточные массы; в это же период отмечалась пролиферация соматической ткани. После 50 дней культивирования каллусы и небольшие эмбриоиды, ведущие свое происхождение из пыльцевых зерен, обнаруживали признаки интенсивного деления клеток. Эмбриоиды выявлялись в пыльниках, образующих каллус, уже на 15-е сутки после их переноса на "дифференцирующую" среду. Спустя 30-60 суток происходило развитие семядольных примордиев и одновременно дифференцировались примордии боковых корней. На этой стадии эмбриоиды переносили на '"растениеобразующую" среду, где развивались главные и боковые корни и зеленые семядоли. Спустя 30-60 дней наблюдалось значительное увеличение размеров эмбриоидов, формировались стеблевой апекс, примордии терминальных почек и в конечном счете интактное растение. Однако частота образования таких растений не превосходила 3- 6 % (число растений - регенерантов в пересчете на 100 пыльников). Гаплоидная природа этих растений была подтверждена цитологическим анализом эмбриоидов, кончиков корней и листьев растений - регенерантов. В серии работ, проводившихся на одном из сортов виргинского табака Nicotiana tabacum, пыльники изолировали на двухклеточной стадии развития пыльцы и культивировали на среде МС + I мг/л 6- бензиламинопурина. В условиях in vitro наблюдали различные варианты последовательных клеточных делений, приводящих к образованию эмбриоидов: делилась только одна из клеток - либо вегетативная, либо генеративная - или обе клетки. В соответствии с этим развивались три типа гаплоидных эмбриоидов, легко отличимых друг от друга: I) при делении вегетативной клетки образовывались вакуолизированные клетки, слабо связывающие краситель; 2) производные генеративной клетки интенсивно окрашивались; 3) при делении обеих клеток происходило образование химерных эмбриоидов. Растения, развивающиеся из эмбриоидов, пересаживали в вазоны и выращивали вплоть до цветения. По данным морфологического анализа листьев и цветков, эти растения также подразделялись на три типа (соответственно тем клеткам, от которых они ведут свое происхождение). Сообщение о развитии гаплоидов из вегетативной клетки, генеративной клетки или обеих этих клеток появлялись и раньше, однако только в данной работе впервые был проведен морфологический анализ взрослых растении и тем самым установлена их природа. Бутоны Hyoscyatus niger помещали на питательную среду на стадии развития,соответствующей одноядерной невакуолизированной микроспоре (длина бутона 5-7 мм). В работе использовали среду Буржин - Нича с 2 % сахарозой. В условиях 12- часового фотопериода и освещенности около 5500 лм/м2 в 3-дневных культурах обнаруживали многоклеточные пыльцевые зерна, а после трех недель культивирования наблюдалось образование регенерантов. Не менее успешной была индукция эмбриогенеза и при использовании жидкой среды даже при культивировании пыльников в полной темноте. В первые 24 часа после инокуляции в пыльцевых зернах можно было различить вегетативную и генеративную клетки. В дальнейшем отмечалось деление только генеративной клетки, вегетативная же на препаратах окрашивалась очень слабо и располагалась на проксимальном конце эмбриоида, формируя некое подобие суспензора. Эмбриоиды, "пробившись" сквозь стенку пыльника, приходили в соприкосновение с питательной средой. Процесс завершался развитием растений - регенерантов. Следует, однако, отметить, что образование эмбриоидов в культуре пыльников на основе деления только генеративной клетки представляет собой достаточно редкое явление. Додде и Рейнолдс исследовали эмбриогенез в культуре пыльников с помощью СЭМ. Пыльники изолированные на стадии одноядерных пыльцевых зерен, помещали на полужидкую среду Буржнн - Нича. Культуры инкубировали при 25 0 С и 12- часовом фотопериоде (5500 лм/м2).В первые 24 часа от начала культивирования объем многих пыльцевых зерен удваивался, а спустя 48 ч. возрастал еще в большей мере, превышая исходный в 8 раз. Эмбриогенная пыльца выявлялась в 4 - 5 дневных культурах. При этом некоторые пыльцевые зерна лопались "по шву", обнажая поверхность покрытую папиллами. Постепенно форма зародыша изменялась от глобулярной (7 дней культивирования) к сердечковидной (9 дней) и далее торпедовидной (10 дней), обнаруживая тем самым черты сходства пыльцевого зародыша с зиготическим. Эмбриоиды 14-дневных культур прорывали стенку пыльника. В процессе развития зародыша происходило также разрушение поверхности пыльцевого зерна. В тех случаях когда пыльцевое зерно погибало, этого не наблюдали. Проведенное методом СЭМ исследование показало, что эмбриоиды в культуре пыльников H. niger развиваются преимущественно из генеративной клетки, хотя иногда в этом процессе участвует и вегетативная клетка. 4.2 Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек. Методы получения гаплоидных растений в культуре неоплодотворенных завязей и семяпочек начали разрабатываться в 50-х годах (8).Большой вклад в их развитие внесли исследователи школы Магешвари. Впервые гаплоидный каллус был получен в культуре женского гаметофита голосеменных.Ткань женского гаметофита выращивали на среде Уайта с 6 мг / л 2,4 -дихлорфеноксиуксусной (2,4Д) и кокосовым молоком (9). Возможность индукции гаплоидного каллуса в культуре женского гаметофита покрытосеменных впервые продемонстрировали японские исследователи ( Uchimia et al,1971). Формирование гаплоидных растений является результатом аномального развития женского гаметофита и осуществляется через эмбриоидо- или каллусогенез. При этом на процесс индукции гаплоидных растений влияет целый комплекс лимитирующих факторов: генотип донорского растения, стадия развития женского гаметофита, состав питательной среды и условия культивирования (9,10). Результаты опытов Сан Ноум (ячмень) и другие исследователи (кукуруза, табак, гербера, шалфей) свидетельствуют, что при разработке методов получения гаплоидных растений в культуре завязей и семяпочек необходимо учитывать эффект генотипа донорского растения. Эмпирические подобранные условия получения гаплоидов для одного вида или сорта, как правило, оказываются непригодными для другого и требуют существенных модификаций (9). Индукция гаплоидных растений возможна на разных стадиях развития женского гаметофита. Однако, для большинства исследованных видов лучшие результаты удалось получить при эксплантации завязей, содержащих полностью сформированные зародышевые мешки. Наиболее часто для культивирования неоплодотворенных завязей и семяпочек используются питательные среды на основе Мурасиге-Скуга, Миллера, Нич, N 6.В связи с тем, что питательные среды для культивирования завязей и семяпочек различных видов покрытосеменных существенно различаются по своему составу, целесообразно рассматривать вопрос о влиянии среды на развитие гаплоидного растения отдельно для каждого вида. Так при выращивании неоплодотворенных завязей эфедры на среде МС, содержащей 2,4 -Д в концентрации 2 мг/л, наблюдалось формирование каллусной ткани; низкие концентрации ?-нафтилуксусной кислоты (НУК) и БАП стимулировали корнеобразование;высокая концентрация БАП (8 мг/л) индуцировала образование стеблевых почек (10). Положительный эффект от внесения в питательную среду витаминов отмечен для культуры завязей табака:частота образования из семяпочек эмбриоидов или эмбриогенного каллуса возрастала с 55 до 100 % при повышении концентрации тиамина, пиридоксина, аскорбиновой, никотиновой, фолиевой кислот и инозитола. Обязательным компонентом питательных сред на всех этапах культивирования не оплодотворенных завязей и семяпочек является сахароза. Для большинства злаков наилучшие результаты были получены при высоких ее концентрациях:8-14 % - для пшеницы, 3-10 % - для ячменя. Важным условием получения гаплоидных растений в культуре завязей и семяпочек является правильный подбор температуры и световых режимов культивирования. Для большинства видов оптимальная температура для культивирования составляет 25-28 °С. Индукция гаплоидных эмбрионов из каллусной ткани наблюдается как в темноте, так и на свету. Как правило, регенерация растений успешно происходит при культивировании эмбриоидов или каллуса в условиях освещенности 1000 - 3000 лк и 16 часовом фотопериоде (9). Выводы. Методы культуры изолированных тканей и органов растений в последнее десятилетие активно используются в самых различных областях теоретической биологии, включая физиологию, биохимию, молекулярную биологию и генетику (1,3,4). Общеизвестно успешное применение культуры in vitro для размножения растений, оздоровления и производства посадочного материала, для создания новых форм и сортов. Важное значение для развития экспериментальной эмбриологии имела разработка методов выделения, культивирования и слияния протопластов растительных клеток (5). Отдельный протопласт в условиях in vitro может дать начало целому растению. Использование культуры протопластов открывает широкие возможности для получения новых сортов растений на основе модификации клеток и соматической гибридизации - межвидовых, внутривидовых и межродовых слияний протопластов. Образование соматических гибридов наблюдали у табака, петунии и моркови. Удалось осуществить слияние протопластов, выделенных из томата и картофеля, т. е. относящихся к различным родам. Соматический эмбриогенез открывает большие возможности для клонального размножения растений и уже успешно применяется для кукурузы, пшеницы и сорго (1).Культуры изолированных зародышей могут быть с успехом использованы в селекционной работе. Невозможность осуществления межвидовых скрещиваний очень части связана с приостановкой развития гибридного зародыша, что, в свою очередь, может быть обусловлено либо его ранней гибелью, либо дегенерацией эндосперма. При скрещивании Linum регеnnе x L. ostriacum развились коробочки, содержащие сморщенные семена, не способные к прорастанию в почве. Однако изолированные из них зародыши прорастали после того, как их замачивали в растворе сахарозы и размещали на поверхности ваты. Благодаря использованию культуры зародышей удалось существенно увеличить число гибридов. На основе этой методики были получены межвидовые гибриды Abeltoschus и Secale и ряд межвидовых гибридов: Hordeum vulgare Linn и Bowden х Agropyron repens (Linn). Культуры изолированных зародышей могут быть с успехом использованы в селекционной работе. Невозможность осуществления межвидовых скрещиваний очень части связана с приостановкой развития гибридного зародыша, что, в свою очередь, может быть обусловлено либо его ранней гибелью, либо дегенерацией эндосперма. При скрещивании Linum регеnnе x L. ostriacum развились коробочки, содержащие сморщенные семена, не способные к прорастанию в почве. Однако изолированные из них зародыши прорастали после того, как их замачивали в растворе сахарозы и размещали на поверхности ваты. Благодаря использованию культуры зародышей удалось существенно увеличить число гибридов. На основе этой методики были получены межвидовые гибриды Abeltoschus и Secale и ряд межвидовых гибридов: Hordeum vulgare Linn и Bowden х Agropyron repens (Linn) (2). Метод размножения побегов обычно используют для размножения папоротников,орхидей и древесных растений семейства Eriaceae (семейство вересковых,включающее рододендроны,азалии,кальмии) и Rosaceae (семейство розовых,к которому относятся яблоки,розы,земляника) (1). Много внимания уделяют изучению культур флоральных органов, в особенности пыльников. Интерес к культивированию пыльников связан с тем, что из пыльцы можно регенерировать гаплоидные растения, играющие важную роль в селекции сельскохозяйственных культур. Культуры пыльников широко используют во всем мире (особенно в Китае) при осуществлении генетических и селекционных программ. В культурах пыльников моносомных растении табака были получены нуллигаплоидные организмы, послужившие прекрасным исходным материалом для изучения групп сцепления и картирования генома этих растений. Культуру пыльников табака используют также для получения гаплоидных растении с различным содержанием алкалоидов (2). В ряде работ сообщалось об успешном оплодотворении растений в условиях in vitro. Важное значение для практической селекции может иметь методика оплодотворения в пробирке. Таким образом, исследования, проводимые в этой области, открывают новые пути получения гибридных и гомозиготных растении. Культуры изолированных зародышей представляют большой интерес для селекционеров и, в частности, садоводов, поскольку при этом выявляются следующие возможности: 1) получение гибридных зародышей, которые в условиях целостного организма не смогли бы выжить вследствие элиминирующего воздействия материнского растения; 2) выведение зародыша из состояния покоя, характерного для некоторых видов растений; 3) разработка тестов определения. Много внимания уделяют изучению культур флоральных органов, в особенности пыльников. Интерес к культивированию пыльников связан с тем, что из пыльцы можно регенерировать гаплоидные растения, играющие важную роль в селекции сельскохозяйственных культур. Культуры пыльников широко используют во всем мире (особенно в Китае) при осуществлении генетических и селекционных программ. В культурах пыльников моносомных растении табака были получены нуллигаплоидные организмы, послужившие прекрасным исходным материалом для изучения групп сцепления и картирования генома этих растений. Культуру пыльников табака используют также для получения гаплоидных растении с различным содержанием алкалоидов. В ряде работ сообщалось об успешном оплодотворении растений в условиях in vitro (3,4). Важное значение для практической селекции может иметь методика оплодотворения в пробирке. Таким образом, исследования, проводимые в этой области, открывают новые пути получения гибридных и гомозиготных растении. Культуры изолированных зародышей представляют большой интерес для селекционеров и, в частности, садоводов, поскольку при этом выявляются следующие возможности: 1) получение гибридных зародышей, которые в условиях целостного организма не смогли бы выжить вследствие элиминирующего воздействия материнского растения; 2) выведение зародыша из состояния покоя, характерного для некоторых видов растений; 3) разработка тестов определения. Много внимания уделяют изучению культур флоральных органов, в особенности пыльников. Интерес к культивированию пыльников связан с тем, что из пыльцы можно регенерировать гаплоидные растения, играющие важную роль в селекции сельскохозяйственных культур. Культуры пыльников широко используют во всем мире (особенно в Китае) при осуществлении генетических и селекционных программ. В культурах пыльников моносомных растении табака были получены нуллигаплоидные организмы, послужившие прекрасным исходным материалом для изучения групп сцепления и картирования генома этих растений. Культуру пыльников табака используют также для получения гаплоидных растении с различным содержанием алкалоидов. В ряде работ сообщалось об успешном оплодотворении растений в условиях in vitro (2,11). Важное значение для практической селекции может иметь методика оплодотворения в пробирке. Таким образом, исследования, проводимые в этой области, открывают новые пути получения гибридных и гомозиготных растении. Культуры изолированных зародышей представляют большой интерес для селекционеров и, в частности, садоводов, поскольку при этом выявляются следующие возможности: 1) получение гибридных зародышей, которые в условиях целостного организма не смогли бы выжить вследствие элиминирующего воздействия материнского растения; 2) выведение зародыша из состояния покоя, характерного для некоторых видов растений; 3) разработка тестов определения жизнеспособности семян; 4) исследование потребностей развивающегося зародыша в тех или иных веществах. Эндосперм, триплоидная природа которого связана с процессом двойного оплодотворения, служит источником питательных веществ для развивающегося зародыша. По мере созревания семени эндосперм может быть полностью израсходован, но может и сохраниться, выполняя функции емкого вместилища "продовольственных запасов" - крахмала, жиров или белков. Имеются многочисленные данные о развитии триплоидных растений из клеток эндосперма при его культивировании in vitro. Эмбриогенез у растений начинается с оплодотворения яйцеклетки мужской гаметой. Вначале зигота не обнаруживает признаков дифференциации, и лишь по прошествии небольшого промежутка времени выявляется ее полярность. Явление так называемого неполового эмбриогенеза можно наблюдать в соматических и репродуктивных тканях самых разнообразных растении (2). Выявлен ряд факторов, участвующих в регуляции эмбриогенеза в условиях in vitro. К их числу относятся наличие в питательной среде азотсодержащих соединений, калия, неорганических ионов, в частности кальция, осмотическая сила раствора, а также концентрация углеводов, витаминов, аминокислот, амидов и регуляторов роста. Исследование культуры неоплодотворенных завязей и семяпочек позволит в дальнейшем дать ответ на ряд важных теоретических вопросов, среди которых следующие: способны ли клетки зародышевого мешка воспринимать индуцирующие воздействия и специфически реагировать на них изменением своего развития, каковы факторы, обусловливающие выход клеток зародышевого мешка из состояния тупиковой дифференцировки. Успехи, достигнутые при выращивании in vitro женских гаметофитов покрыто- и голосеменных растений, иллюстрируют способность клеток с обычно ограниченными онтогенетическими возможностями представлять почти весь диапазон морфогенетических потенций вида. Культура их может оказаться наиболее полезной при создании гаплоидных и диплоидных форм с желаемыми генетическими характеристиками (10). Список литературы Рейвн П., Эверт Р., Айкхорн С. Современная ботаника./Мир, 1990, 2 т. Джори. Экспериментальная биология/Под ред. Ермакова. 1990, 2 т. Вопросы биотехнологии./Межвузовский научный сборник. Изд-во Башкирского университета, 1995. Биотехнология и генетика./ Межвузовский научный сборник. 1991. Бутенко Р.Г. Изолированные протопласты растений - объект и модель для физиологических исследований./В кн.: Культура клеток растений. М., 1981. Thimann, Kenneth V. Hormone Action in the whole Life of Plants./University of Massachusetts Press, A mherst. Mass., 1977. Torrey, John G. The Development of Plant Biotechnology./ American Scientist № 73, 1985. Hoseman D., Bossoutrot D. Induction of haploid plants from in vitro culture of unpollinated beet (Beta vulgaris L.)./Pflanzenzucht., т. 91 № 1, 1983. Бугара А. М., Русин Л. В. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений./Физиология и биохимия культурных растений. 1988, т.20, № 5. Павлова М. К. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек: возможности и перспектива./Сельскохозяйственная биология. 1987, № 1. Сытник К. М., Галкин А. П. XIII Международный ботанический конгресс (XIII Intenational Botanical congress), 21 - 28 августа 1981 г. Сидней, Австралия/Молекулярная биология, 1982, т.16, № 3.