наука / методы науных исследований / Флуоресцентные методы исследования
.docФлуоресцентные методы исследования
Флуоресцентный метод от большинства стандартных гидробиологических методов исследования отличается более высокой точностью и меньшей трудоемкостью, что позволяет уменьшить время обработки пробы. Это предоставляет возможность проводить экспресс-анализ состояния водных экосистем, создавая большие массивы данных для проведения систематических исследований в течении многих лет. Объектами исследования, кроме экстракта пигментов, служат живые клетки водорослей (in vivo), что позволяет судить о физиологическом состоянии фитопланктона, важнейшего звена в природных экосистемах.
Определение концентрации хлорофилла «а» у основных таксонов фитопланктона
Для чего же необходимо узнать содержание хлорофилла «а» в пробе воды? Из этой величины можно рассчитать биомассу фитопланктона, и по ее динамике судить о развитии сообщества водорослей. Как же вычислить концентрацию хлорофилла «а», измерив сигнал флуоресценции?
Теоретически в определённом диапазоне концентраций пигментов величина интенсивности флуоресценции пропорциональна их концентрации
Фл = К· Са
Коэффициент пропорциональности К, соответствующий флуоресценции единицы вещества, принято называть удельным выходом. Удельный выход флуоресценции зависит от состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза и может быть заметно снижен за счет отвлечения части поглощенной энергии на фотохимические реакции. При действии симазина (1. 10-5 М) выход флуоресценции достигает максимального значения, а возможность ошибки из-за различий физиологического состояния водорослей снижается.
Особенности спектров возбуждения флуоресценции у микроводорослей трех отделов
Диапазон длин волн возбуждающего света выбирается исходя из специфических отличий спектров действия флуоресценции у представителей отдельных таксономических групп водорослей.
Для возбуждения флуоресценции было выбрано излучение трех областей спектра:
СИНЕЕ, lmаx = 400±40 нм, поглощаемое преимущественно хлорофилл-белковым комплексом зеленых и эвгленовых водорослей (хлорофиллы а, b),
СИНЕ-ЗЕЛЁНОЕ, l mаx=515±30 нм, для фукоксантина и хлорофилл-белкового комплекса диатомовых водорослей (хлорофиллы а, с),
ЗЕЛЁНОЕ, l mаx = 540 ± 10 нм - для фикобилинового комплекса сине-зеленых водорослей.
Высокая стабильность величин удельных выходов объясняется, вероятно, тем, что генетическая детерминация таксономических различий в структуре таксономического аппарата выше, чем фенотипические изменения внутри отдельной группы. Кроме того, высокая стабильность коэффициентов может быть связана с реализацией принципа поведения водорослей, как самонастраивающейся системы. Значительные изменения удельных выходов (не зависящих от физиологического состояния водорослей) могут определяться, в основном, нарушениями фотосинтетического аппарата. Однако, если какие-то факторы вызывают данные изменения, то они в конце концов приведут к эллиминации "дефектных" видов и их заменяют виды с нормальной организацией аппарата, со своим довольно устойчивым выходом. Адаптация системы заключается не в том, что накапливаются виды с деформированной организацией фотосинтетического аппарата, а в том, что за счет сукцесии доминирующими становятся другие таксоны.
Рентгено-флуоресцентный метод в агрохимической службе
А.В. Пуховский, Ю.М. Логинов
(ЦИНАО, Москва, 1999)
В нашей стране вопрос об использовании рентгено-флуоресцентного метода (РФА) для анализов сельскохозяйственных объектов был поставлен в середине 70 годов. Тогда для ЦИНАО и Почвенного института были закуплены приборы фирмы Ортек (США), которые были использованы для методических исследований и массовых анализов проб почв и растений. Результаты исследований были опубликованы в ряде работ, в сентябре 1979 в ЦИНАО прошел советско-американский симпозиум на тему "Перспективы использования рентгено- флуоресцентного анализа в агрохимической службе", в котором приняли участие специалисты АН СССР, ЦИНАО, ВПНО "Союзсельхозхимия" (газета Сельская жизнь от 26 сентября 1979 г.). Тогда встал вопрос об оснащении агрохимической службы аналогичными приборами отечественного производства.
С участием специалистов ЦИНАО, ВПНО "Союзсельхозхимии", НПО Агроприбор, НПО Буревестник, ПО Научприбор в 1980-1985 гг. были проведены научно-исследовательские и опытно-конструкторские работы для оснащения агрохимической службы соответствующим оборудованием. Все приборы и оборудование проходили апробацию в ЦИНАО, где были разработаны "Методические указания по проведению рентгено-флуоресцентного анализа кормов и растений на спектрометре СРМ-20М" (Москва, 1988).Это позволило разработать и внедрить комплекс оборудования для массовых анализов кормов с использованием многоканальных рентгеновских спектрометров типа СРМ-20М и СРМ-25 (рис.1) и комплекта вспомогательного оборудования, который состоит из кассет двух типов для хранения проб (рис.2), гидравлический пресс и пресс-форма с подогревом для таблетирования проб кормов.
Комплекс обеспечивает возможность хранения (до 2000 проб), таблетирования и анализа до 100 проб кормов в смену при одновременном определении магния фосфора, серы, хлора, калия, кальция, марганца, железа, цинка и меди. С использованием комплекса на Тверской станции были проанализированы несколько тысяч проб кормов из различных регионов СССР, что позволило подготовить справочник по минеральному составу кормов. В течение многих лет аналогичные комплексы успешно эксплуатировался на Белгородской станции и Кишиневской станции агрохимической службы.
Несмотря на высокую производительность и хорошие метрологические характеристики этих приборов выявился ряд эксплуатационных недостатков: большие затраты на подготовку специального помещения, высокая стоимость эксплуатации, необходимость подготовки квалифицированного обслуживающего инженерного персонала. Поэтому возникла необходимость в разработке новых более экономичных и простых в обращении приборов, пригодных для целей и задач агрохимической службы.
В 1991 году появилась новая отечественная разработка - малогабаритный рентгеновский спектрометр СПЕКТРОСКАН. По сравнению с приборами типа СРМ малогабаритные спектрометры СПЕКТРОСКАН обладают рядом преимуществ:
Масса прибора снижена с 1000 до 24 кг, по габаритам прибор СПЕКТРОСКАН не превышает персональный компьютер
Энергопотребление прибора снижено от 15 кВА до менее чем 100 ВА.
Рентгеновская трубка не требует охлаждения проточной водой.
Прибор легко перестраивается с одной линии на другую. Запись спектра в автоматическом режиме позволяет определить, какие элементы и в каких количествах присутствуют в пробе, что особенно важно для анализа проб неизвестного состава.
Прибор легко транспортируется и может использоваться в условиях передвижных лабораторий.
В отличие от приборов с полупроводниковыми детекторами СПЕКТРОСКАН не требует охлаждения жидким азотом и имеет в 3-5 раз более высокое спектральное разрешение.
Для разработки методик, нормативных документов и оказания методической помощи Агрохимической службе в 1994 в ЦИНАО была создана самостоятельная лаборатория РФА. В этом же году лаборатория приняла участие международном межлабораторном эксперименте по аттестации почвенных стандартных образцов, "Методические указания по определению тяжелых металлов в почвах, кормах и пищевых продуктах рентгено-флуоресцентным методом на спектрометре Спектроскан " (1995) были успешно апробированы и внедрены в Государственных Центрах Агрохимической службы (ГЦАС) "Удмуртский", "Камчатский", "Новгородский", "Ростовский", "Оренбургский", в лабораториях ГСЭН, Минприроды, ветеринарной службы и других ведомств.
Контроль загрязнений сельскохозяйственных объектов тяжелыми металлами требует определения следовых количеств элементов, что представляет серьезную проблему для всех физико-химических методов и, особенно, для РФА. Разработанные в лаборатории РФА ЦИНАО методы концентрирования и пробоподготовки позволили более чем в 2 раза сократить время минерализации и более чем в 100 раз снизить пределы обнаружения токсичных элементов и тем самым решить проблему определения субмикрограммовых количеств большого числа загрязняющих элементов.
Для анализа кормов и сельхозпродукции с использованием приборов СПЕКТРОСКАН разработан ОСТ 10-215-98 "Продукция сельскохозяйственная, Ускоренная подготовка проб для определения тяжелых металлов и мышьяка", который позволяют провести минерализацию проб мяса, рыбы, овощей массой 10-20 г за 1-2 часа, молока массой до 50 г - за 2-3 часа. В золе пробы на приборе СПЕКТРОСКАН определяют Zn, Fe, Mn, Ni, а после дополнительного экстракционного концентрирования, длительность которого не превышает 30 мин., Pb, As, Cu.
Не менее перспективным представляется использование метода РФА для анализа почв, осадков сточных вод и сапропелей. При содержании определяемых элементов в пробе выше 20-50 мг/кг анализ можно проводить без химической пробоподготовки. В области более низких содержаний элементов используют методы концентрирования. Кроме определения валовых форм элементов метод позволяет определять содержание кислоторастворимых и подвижных форм элементов. При этом проводят экстракцию элементов по стандартным методикам, полученные растворы выпаривают и исследуют сухой остаток или используют другие методы концентрирования. В настоящее время разрабатывается ОСТ "Почвы. Рентгено-флуоресцентное определение валового содержания и кислоторастворимых форм тяжелых металлов (Pb, Zn, Ni, Cu, Mn, Cr)
В заключение следует отметить, что аппаратура для РФА непрерывно совершенствуется. В настоящее время появились новые модели приборов с полупроводниковыми детекторами, которые не требуют охлаждения жидким азотом, вакуумные спектрометры типа СПЕКТРОСКАН, который позволяют определять легкие элементы (фосфор, серу, калий, хлор), ведутся разработки в области создания приборов с повышенной чувствительностью, основанных на использовании полного внешнего отражения и другие. Благодаря этому метод РФА становится более привлекательным для пользователей и имеет большое будущее, в том числе и в области агрохимического обслуживания сельского хозяйства.