- •Научно-исследовательский институт цитохимии и молекулярной фармакологии
- •Глава 1. Описание движения ионов в биологических компартментах с использованием различных математических моделей
- •1.1. Применение решений краевых задач для уравнения диффузии в целях описания пространственно временных градиентов незаряженных химических соединений в биологических компартментах
- •1.2. Расширение диффузионного подхода при описании пространственных потоков для случая движения заряженных частиц
- •1.3. Рассмотрение слу,чая малого компартмента и описание движения совокупности молекул с использованием уравнений молекулярной динамики.
- •1.4. Кинетический подход к моделированию переноса заряженных частиц через биологические мембраны
- •Глава 2. Построение физической модели движения заряженных частиц в ограниченном пространстве вблизи поверхности мембраны
- •2.1. Описание физико-химических свойств моделируемой системы с учетом используемых предположений и допущений
- •2.2. Формулировка задачи Коши для системы уравнений Ланжевена и ее пошаговое решение
- •2.3. Возможные варианты распределения плотности фиксированных зарядов в рассматриваемой системе и их влияние на динамику движения ионов
- •Глава 3. Разработка алгоритма описания движения ионов в рассматриваемом примембранном пространстве на основе решения уравнений Ланжевена
- •3.1. Последовательное пошаговое построение траектории перемещения частиц в рассматриваемом компартменте
- •3.2. Формулировка правил описания трансмембранного ионного тока в рамках предложенной модели
- •3.3. Методика проведения компьютерного эксперимента с использованием предложенного оптимизированного алгоритма
- •3.4. Принцип получения вольтамперной характеристики ионного белкового канала, на основе используемого в работе подхода
- •3.5. Моделирование открытия ионного канала рецептора под действием связывания лиганда с использованием вероятностного подхода
- •Глава 4. Формализация предложенного алгоритма в виде независимого программного обеспечения для пк
- •4.1. Создание программного продукта на базе предложенного в работе алгоритма с использованием объектно-ориентированной среды разработки Delphi
- •Выбор параметров мембраныСоздание массива ионов
- •Создание массива неподвижных зарядов
- •4.2. Описание интерфейса программного пакета и локализация основных параметров модели
- •Глава 5. Приложение разработанного подхода к описанию реальных мембранных белковых каналов
- •5.1. Случай неселективной мембранной поры заданного диаметра, в незаряженной мембране, разделяющей два компартмента с фиксированным градиентом ионов
- •5.3. Моделирование трансмебранных хлорных токов, возникающих при открытии ионного канала глицинового рецептора
5.1. Случай неселективной мембранной поры заданного диаметра, в незаряженной мембране, разделяющей два компартмента с фиксированным градиентом ионов
Одним из наиболее общих случаев, для которого можно применить представленную в предыдущих главах модель, является мембранная пора, созданная белком, пептидом, полимером, либо возникающая вследствие образования полиморфной структуры в составе ламелярного бислоя. При «больших» размерах поры можно считать, что она наполнена гидрофильным растворителем. Следует отметить, что геометрия поры в общем случае может быть произвольной, не только цилиндрической. Важно, что трансмембранная пора, т.е. геометрический элемент, предполагающий свободное прохождение частиц через гидрофобный барьер, можно рассматривать как универсальный элемент огромного количества мембранных белков, выполняющих функции каналов, рецепторов, генераторов/потребителей электрохимического градиента. Можно было бы также обратить внимание на то, что цилиндрические участки внутри мембраны могут быть не только обычными порами, но и представлять собой функциональные элементы ионных каналов. По своей природе они являются относительно гидрофобными и во многих случаях выполняют функции либо селективного фильтра, либо воротного механизма. Их наличие в различных потенциал-зависимых и лиганд-зависимых каналах, таких как КсзА и пАСИЯ говорит об их важной роли в процессах ионного транспорта [39,40]. Также узкие гидрофобные области участвуют в механизмах протонного транспорта в таких биологических системах как аквапорины, цитохромоксидазы и бактериородопсин [41,42,43].
Достаточно очевидно, что изменение диаметра поры влияет на ее проводимость. При этом при определенном значении можно рассматривать вариант прохождения иона как в гидратной, так и без гидратной оболочки. Вариант прохождения внутри поры без гидратной оболочки является одним из возможных вариантов, однако не следует исключать и возможность переоблачения иона из гидратной оболочки в «толщи» раствора в «гидратное окружение» внутри канала. Причем достаточно очевидно, что вероятность прохождения в своей оболочке будет тем выше, чем больше диаметр поры. Таким образом, исследование того, насколько диаметр гидрофобной поры влияет на трансмембранный ионный ток, позволит в дальнейшем определить, как геометрическое строение различных ионных каналов определяет их свойства по проводимости.
В качестве примера было проведено моделирование трансмембранного переноса ионов через цилиндрические гидрофобные поры различного диаметра. Толщина мембраны принималась равной 8 нм. В качестве среды в компартментах моделировался раствор, содержавший ионы Ыа+ и СГ с концентрациями 120 мМ во внешнем и 5 мМ во внутреннем компартментах
соответственно. Были рассмотрены два случая прохождения ионов через
\
пору. В первом случае ион не терял гидратную оболочку при прохождении, а во втором движение проходило без нее.
В случае движения с гидратной оболочкой (Рис. 13) значение тока при диаметрах до 10 А не превышает 0.1 пА, и даже при высоких диаметрах поры порядка 20 А составляет всего 0.45 пА. Однако в случае отсутствия гидратной оболочки прохождение иона через канал сильно облегчается, и значения трансмембранного тока сильно зависят от диаметра поры (Рис. 14). При 4 А он составляет 0.1 пА, а при увеличении диаметра до 20 А растет вплоть до 2.9 пА.
Следующий шаг в рассмотрении применения представленного подхода к описанию мембранной поры состоял в получении вольтамперных характеристик данного участка мембраны. На Рис. 15 и Рис. 16 представлены вольтамперные характеристики для поры двух разных диаметров: бА и 10А. Точки представляют собой среднее по десяти экспериментам. Градиент концентраций соответствует 100 мМ во внешнем и 10 мМ во внутреннем компартментах. Легко видеть, что увеличение диаметра поры приводит к возрастанию абсолютного значения токов, причем значение потенциала при нулевом токе соответствует значению Нернстовского потенциала при данном градиенте ( 59 мВ). Величина тока при нулевом напряжении отлична от нуля поскольку в данном случае существует упомянутый градиент концентрации. Отметим, что практически не важно, какие именно ионы выбраны в качестве составляющих компонентов среды. Каждый из них в предлагаемом подходе аппроксимируется заряженным шаром, движущимся в вязкой среде с заданной диэлектрической проницаемостью. Геометрия поры так же не имеет решающего значения для проведения расчетов.
Представленные в данном разделе результаты делают предпосылку для перехода к рассмотрению белковых каналов. Особенностью таких структур будет более сложная геометрия внутренней полости канала и наличие особых зарядов. Поскольку наиболее важно опираться на наиболее точные и проверенные экспериментальные данные о структуре мембранных белковых
каналов,
в следующем разделе предложенный
подход будет применен для моделирования
трансмембранных токов в калиевых
каналах.
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Рис. 13. Зависимость трансмембранного ионного тока от диаметра гидрофобной поры. Ион не теряет гидратную оболочку
.О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
О, А
Рис. 14. Зависимость трансмембранного ионного тока от диаметра гидрофобной поры. Ион движется без гидратной оболочки
.
Рис.
15. Вольтамперные характеристики
цилиндрической мембранной поры
диаметром
бА.
Рис.
16. Вольтамперные характеристики
цилиндрической мембранной поры
диаметром 10А.
5.2. Описание потока К+ при открытии в плазматической мембране клеток калиевого канала
К потенциал-зависимым калиевым каналам клетки относятся каналы, специфически активируемые деполяризацией клеточной мембраны и ассоциированные с мембранной реполяризацией. Калиевые каналы играют важную роль в процессах возбудимости и проводимости мембран [44]. Катионные каналы (калиевые, натриевые и кальциевые), зависящие от потенциала на мембране и образующие большое семейство, построены на сходных принципах. Одним из первых каналов, для которого был в достаточной степени изучен принцип работы, стал калиевый потенциал- зависимый канал KvAP, выделенный из архебактерии Aeropyrum pernix.
Центральная ионная пора окружена четырьмя субъединицами. Два гидрофобных сегмента S5 и S6, которые представляют собой а-спиральные мотивы, образуют стенки этой поры. Каждая субъединица состоит из шести подобных спиральных сегментов S1-S6. Из них образуется два принципиально различных по функциональности участка. Первый из них — S1-S4 отвечает за сенсорную функцию канала и реагирует на изменение мембранного потенциала. Участок S5-S6, как было показано выше, образует стенки поры, а также отвечает за ее ионоселективность. В структурном элементе S1-S4 присутствует консервативная последовательность из четырех остатков аргинина. Таким образом, за счет наличие заряженной области и гибкого сочленения спиральных сегментов данная структура способна быстро менять конформацию и обеспечивать открытие/закрытие ворот канала. Наличие специфической последовательности аминокислот Thr — Val - Gly - Туг — Gly в селективном фильтре позволяет координировать ионы калия с помощью обращенных внутрь узкой поры карбонильных атомов кислорода. Боковые группы этой последовательности обращены в гидрофобную область домена и стабилизируют структуру поры в целом. Области ответственные за чувствительность к мембранному потенциалу локализованы в сегменте 85, и во время работы он отклоняется от оси канала. Сегмент 85, связанный с 86 посредством линкерного глицина, также изменяет свое положение. Таким образом, в процессе работы участок 85-86 в субъединице движется синхронно, как единое целое.
Положение сегментов фильтра и сенсорной части в КуАР было определено на основе его полной структуры, установленной рентгеноструктурным анализом с разрешением 3.2 А [45]. Показано, что две его спирали (81 и 82) располагаются концентрическим слоем около фильтра (т.е. снаружи от 85), а другие (83 и 84) - по-наружному периметру центральной поры. Спираль 83 является не единой структурой, а состоит из двух фрагментов» (83а и 83Ь), соединенных петлей БЗ. Сегмент БЗЬ и №концевая часть спирали, уложенные антипараллельно строго друг против друга, образуют почти полностью гидрофобный элемент со структурой спираль-петля-спираль. Элемент (83Ь-84) называется единицей сенсорных "лопастей". Через петлю, разделяющую 83Ь и 84 спирали, весь элемент соединен с той частью белковой субъединицы, которая удерживает белок в липидном слое мембраны. Судя по структуре, "лопасти" датчика, расположенные сбоку от И-конца молекулы, ограничены петлей 83, а с карбоксильного конца соединены крутым витком (шарниром) по остатку глицина со спиралью 85. Такое сочленение позволяет "лопастям" свободно отклоняться относительно основного "тела" канала на внутренней стороне мембраны. Четвертая спираль располагается около внутренней поверхности мембраны (перпендикулярно оси поры), что в принципе противоречит всем электрофизиологическим данным: ингибиторы канала (токсины и серосодержащие реагенты) взаимодействуют с Ы-концевым фрагментом спирали 84 только с внешней стороны мембраны. Однако было установлено, что "лопасть" представляет собой консервативную единицу калиевых каналов, регулируемых потенциалом, и что в связующем звене межд
у
Рис.
19. Вольт-амперная характеристика,
полученная путем компьютерной симуляции
работы изолированного калиевого канала
В тоже время существование подобных источников поля в мембране
способно изменять состояние самого белка, однако подобный эффект в
к
рамках представленного подхода не учитывается.
Примечательно, что, несмотря на некоторую «упрощенность» алгоритма его результаты весьма точно совпадают с экспериментальными измерениями трансмембранного тока в канале. Из приведенного сопоставления результатов моделирования процесса протекания тока через открытый канал и непосредственных измерений видно, что расхождение результатов математической аппроксимации и эксперимента составляет не более 9% для случая прохождения в гидратной оболочке и 2% в случае прохождения катионов без нее (Таблица 1). Данный результат свидетельствует в пользу гипотезы о сбрасывании гидратной оболочки калием при входе в канал. Рассмотренный в данном разделе пример является одним из наиболее характерных случаев ионных каналов, локализованных в мембранах. Тем не менее, необходимо проверить реализацию предложенного подхода и в случае более сложного мембранного белка - рецептора канального типа. Поскольку в данном разделе рассматривался катионный каналу то в качестве примера рецептора можно воспользоваться анионным каналом. В качестве такого рассмотрим хлорный канал глицинового рецептора.
Таблица 1. Сравнение экспериментальных значений трансмембранных ионных токов, измеренных для случая калиевого канала КсбА с результатами компьютерной симуляции на основе предложенного алгоритма. Концентрация КС1 принималась равной значениям использованным в экспериментальной системе Сои^120 мМ; С1„=5 мМ. Результаты компьютерного моделирования представлены в виде от десяти симуляций. Величина трансмембранного тока, пА |
Ссылка на работу, комментарии |
4,1 ±0,12 |
Моделирование по предложенному алгоритму с учетом прохождения иона в гидратной оболочке |
4,6±0,12. |
Моделирование по предложенному алгоритму с учетом прохождения иона без гидратной оболочки |
4,5±0,1. |
Экспериментальные данные[71] |