1.3 Внедрение и использование пцр в практическом здравоохранении Российской Федерации.

К моменту начала нашей работы (середина, вторая половина 90-х годов 20 века) в развитых зарубежных странах уже сложилась индустрия, связанная с ПЦР диагностикой. Спустя 10 лет после опубликования первых работ о ПЦР за рубежом уже имелись лаборатории и диагностические центры, использующие указанный метод. Фирмами, специализирующимися на биологическом и медицинском приборостроении («Bio-rad», «Perkin almer», «Thermo», «Eppendorf», «Roshe» и др.), производились амлификаторы, микроцентрифуги, микротермостаты, гель-документирующие системы, ПЦР -диагностикумы и комплектующие для них. Изданы книги с протоколами ПЦР детекции обширного круга возбудителей [152, 281, 300, 347]:

1. вирусных агентов: вирусов иммунодефицита человека: лимфотропных вирусов первого типа; вирусов гепатитов В и С; вирусов герпеса простого; Эпштейн-Барр вирусов; цитомегаловирусов; варицелла-зостер вирусов; Jc- вирусов; парвовирусов; вирусов гриппа А, В, С типов; ротавирусов; аденовирусов человека; вирусов краснухи; энтеровирусов человека; генитальных папилломавирусов человека;

2. бактериальных агентов: M.tuberculosis; B.burgdoferi; Y.pestis; T.pallidum; C.trachomatis; C.pneumoniae; M.pneumoniae; Mycoplasma spp., L.pneumophila; L.dumoffii; V.cholerae; энтеротоксигенных, энтероинвазивных E.coli; бактерий рода Shigella; H.pylori; C.difflcile; генов токсинов S.aureus:

3. грибков: С.albicans; C.neoformans; P.carinii.

4. одноклеточных napa3HTOB:T.gondii, T.vaginalis, E.histolitica, G.lamblia .

В Российской Федерации на середину 90-х годов 20 века пришелся начальный период становления развития системы отечественной ПЦР диагностики. Исходно ПЦР была доступна крупным научно- исследовательским центрам и институтам молекулярно-биологического профиля, оснащенным современным зарубежным оборудованием, и использовалась для решения теоретических проблем.

В 90-х годах в Российской Федерации появились первые фирмы, специализирующиеся на производстве диагностических препаратов и оборудования для ПЦР («Литех»; «ДНК-Технология», «БиоКом», «Внедрение систем в медицину», «Интерлабсервис» и др.), лаборатории, использующие метод ПЦР для выявления патогенных микроорганизмов и наследственных заболеваний. Начато производство отечественных моделей ДНК-амплификаторов - Amply-250 («БиоКом»); Терцик МС2 («ДНК- технология»), имеющих рабочие характеристики, близкие зарубежным аналогам, и пригодных для проведения практических диагностических исследований. Были разработаны коммерческие ПЦР тест-системы первого поколения. Подавляющее большинство этих систем было представлено диагностикумами для выявления возбудителей негонококковых урогенитальных инфекций и парентеральных вирусных гепатитов. Они представляли собой улучшенные варианты «in hause» тест-систем. Каждый компонент реакционной смеси был помещен в отдельную пробирку, что усложняло этап подготовки к исследованию.

За прошедшие десять лет ситуация существенно изменилась. Количество ПЦР лабораторий в стране, которых в середине 90-х не насчитывалось и ста, превысило тысячу. Наряду с разнообразными моделями традиционных зарубежных и отечественных ДНК амплификаторов, имеется широкий выбор моделей, предназначенных для проведения «Real time» ПЦР, причем четыре из них являются отечественными разработками (модели «ДНК-технологии», Российской Академии Наук, «Биомедицина Сибири»). Созданы флюориметры, адаптированные под микропробирки для ПЦР, что позволило использовать тест-системы с детекцией по конечной точке флюоресценции («end point»).

Значительные изменения претерпели отечественные ПЦР тест - системы. В настоящее время коммерческие диагностикумы представлены смесью лиофильно высушенных реактивов и универсальным буфером- дилюэнтом. Такая комплектация упрощает постановку ПЦР, для этого достаточно добавить к высушенным реактивам дилюэнт и исследуемый образец. Второй вариант тест-систем представлен двухкомпонентными диагностикумами. Нижняя реакционная смесь (праймеры и дезоксинуклеотидтрифосфаты) разлиты по пробиркам и запечатаны пробкой из легкоплавкого воска. Для приготовления полной реакционной смеси добавляется верхняя реакционная смесь (буфер, фермент, краситель) и исследуемая проба. Во время горячего старта пробка плавится и все компоненты смешиваются. Новые технологичные тест-системы сделали метод ПЦР более доступным для практической медицины.

Существенно расширился и спектр выявляемых ПЦР инфекционных агентов. Отечественными диагностикумами в настоящее время возможно обнаруживать более 90 инфекционных агентов вирусной, бактериальной, грибковой и протозойной природы. Проводятся исследования по таким актуальным направлениям, как диагностика ОКИ, гнойных и серозных менингитов, воспалительных заболеваний органов дыхания, хеликобактерной инфекции и ряда других патологий. Но среди ПЦР анализов по-прежнему подавляющее большинство составляют исследования на НУГИ и вирусные гепатиты. Такое узконаправленное развитие определяется тем, что большинство ПЦР лабораторий являются коммерческими организациями и выполняют только экономически целесообразные работы.

Сдерживающим фактором развития ПЦР является то, что эти исследования не включены в официальные стандарты диагностики и не финансируются фондом обязательного медицинского страхования. Метод ПЦР рекомендован для диагностики целого ряда инфекционных заболеваний, но его результаты имеют консультативный характер. Несмотря на значительное количество работ, посвященных ПЦР-детекции как отдельных инфекционных агентов, так и нескольких патогентов одновременно, достаточно редко рассматриваются вопросы рационального применения метода, разработки оптимальных алгоритмов ПНР-диагностики. Как правило, работы по этому направлению подчеркивают актуальность проблемы, но не содержат конкретных предложений [52, 75, 81].

В своей работе мы стремились комплексно использовать метод ПЦР в изучении ряда социально значимых инфекционных заболеваний человека: бактериальных ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов, ГГУТИ, определить существенные аспекты и проблемы в их диагностике, требующие для решения применения ПЦР, разработать оптимальные алгоритмы ПЦР-детекции инфекционных агентов с цел^о получения максимальной информации при минимальных материальных затратах.