2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 - Фрагменты гена шигоподобного токсина vt1.

В 2003 г. ген VT1 был выявлен у 34-х штаммов энтеробактерий: у 11 штаммов Escherichia серовариантов 016, 0144, 075, 026, 0128, 0124 и 23 штаммов Shigella, главным образом у Shigella flexneri 2а.

Наиболее часто выявлялся фактор инвазивности. Он обнаружен у всех клинических изолятов шигелл (536 штаммов) и у 6 штаммов E.coli сероварианта 0124. Шесть штаммов шигелл, у которых оперон инвазивности отсутствовал, хранились в музее культур более 2-х лет. Это свидетельствовало о возможности утраты плазмиды, в составе которой находится оперон инвазивности у представителей рода Shigella, что и было подтверждено при изучении плазмидных профилей этих культур.

момент мы не располагали полным набором тестов для идентификации этого варианта эшерихий как серологическими, так и генетическими методами.

Особо следует отметить эпизод исследования энтеробактерий на наличие генов факторов патогенности с использованием ПЦР тест-системы для детекции вирулентных V.cholerae (НИИ микробиологии МО РФ). В ее состав входили три пары праймеров: первая - специфичная гену холерного токсина, вторая - гену адгезии типичного холерного вибриона, третья - гену адгезии вибриона Эль-Тор. Из данных литературы известно о возможност

и

обмена генетическим материалом между бактериями семейств Vibrionaceae и Enterobacteriaceae. В частности показано, что ген холерного токсина имеет 70% гомологию с геном LT-токсина и механизмы действия этих токсинов идентичны [83]. В связи с этим представляло интерес провести поиск генетических детерминант вирулентности V.cholerae у энтеробактерий. Было проанализировано 35 штаммов энтеропатогенных эшерихий разных серовариантов, 18 штаммов S.sonnei и 12 штаммов S.flexneri.

Штаммов, имеющих последовательности ДНК, гомологичные гену холерного токсина, выявлено не было. С праймерами к генам адгезии также не взаимодействовало большинство исследованных культур. Исключение составили 3 штамма Е. coli сероварианта 0127, процессе амплификации их генома с праймерами к гену адгезии типичного холерного вибриона синтезировался фрагмент ДНК размером около 300 п.о. Результат не мог быть артефактом, так как амплификация проводилась в жестких условиях ирезультат подтверждался в нескольких повторах. Полученные данные свидетельствуют о наличии у E.coli 0127 генетических структур сходных по нуклеотидной последовательности с геном адгезии холерного вибриона. Данный факт установлен впервые.

Полученные в ходе многолетних исследований результаты свидетельствуют о том, что для Нижегородского региона не характерна циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий. На двух этапах исследования выявлялись только гены токсина VT1. Причем токсигенные E.coli, выявленные в 1994г., являлись завозными штаммами. Последующие находки штаммов шигелл и эшерихий с геном токсина VT1 относятся к 2003 г. Ген VT1 чаще встречался в клинических изолятах S.flexneri 2а. Этот факт согласуется с литературными данными о том, что S.flexneri 2а, доминировавший в то время в этиологической структуре дизентерии в РФ, в ряде случаев вызывал глубокие поражения кишечника, что в ряде случаев приводило к летальному исходу заболевания [91].

В последующие годы - 2004, 2005, 2006 гг. находок токсигенных штаммов не было. Возможно, это связано со сменой доминирующего штамма шигелл (в настоящее время преобладает S. sonnei) и с тем, что токсигенные штаммы достаточно быстро элиминируются из бактериальных популяций. Нельзя исключить, что токсигенные изоляты в 2003г. являлись преимущественно завозными штаммами, поскольку активность миграции населения значительно возросла.

В заключение этого подраздела особо следует отметить выявление у штаммов Е.соН 0127 генетических детерминант, имеющих гомологию с геном адгезии V.cholerae tcpA, что обнаружено нами впервые.

Проведенные исследования показали, что гены факторов патогенности характерны для бактерий родов Shigella и Escherichia. У бактерий рода Salmonella и других представителей семейства Enterobacteriaceae генов факторов патогенности не выявлено, несмотря на имеющиеся в литературе данные об обмене генетическим материалом среди различных родов и видов энтеробактерий.

Наиболее практически значимым из результатов данного исследования явилось подтверждение факта, что все свежевыделенные культуры шигелл содержат гены оперона инвазивности. В дальнейшем это послужило базой для разработки ПЦР тест системы для выявления бактерий рода Shigella и энтероинвазивных эшерихий.

В настоящее время, несмотря на значительный прогресс, нет основания считать проблему выявления энтеробактерий, содержащих факторы патогенности, полностью методически решенной. Все ПЦР тест системы для детекции генов факторов патогенности стабильно работают на чистых культурах возбудителей ОКИ. Исключение составляет диагностику для выявления оперона инвазивности, который позволяет выявлять шигеллы и инвазивные эшерихии в клиническом материале и объектах внешней среды.

Разработка тест-систем для выявления генов энтеротоксинов в различных субстратах имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Применение таких диагностикумов позволит широко проводить изучение циркуляции генов патогенности, поскольку не потребуется выделения чистой культуры бактерий, и расширит возможности диагностики атипичных ОКИ с тяжелым клиническим течением, даст возможность осуществлять объективный контроль пищевых продуктов (в первую очередь, импортированных из стран Южной и Юго-восточной Азии). Наиболее целесообразна разрабортка мультиплексной тест-системы для выявления генов токсинов LT, ST, VT1, VT2 и фактора инвазивности одновременно в одной ПЦР реакции. Такой вариант анализа экономичен, прост, производителен. Имеющиеся в настоящее время методические возможности позволяют успешно решить эту задачу.

2.2.2.2. Использование ПЦР тест-систем для детекции бактерий родов Shigella и Salmonella в санитарно-эпидемиологической и клинической практике.

Как правило, практическое применение ПЦР тест-систем для выявления бактерий родов Shigella и Salmonella проходило параллельно с лабораторными исследованиями, посвященными их совершенствованию. ПЦР-диагностика шигеллезое. Первый экспериментальный вариант тест- системы на шигеллы был апробирован при расследовании случаев групповой заболеваемости дизентерией в соматических стационарах г. Нижнего Новгорода.

Так в городской психиатрической больнице №1 были зарегистрированы повторяющиеся вспышки дизентерии, вызванной штаммом Shigella flexneri 2а. Было сделано предположение о бактерионосительстве среди пациентов и сотрудников больницы. Микробиологические исследования не выявили бактерионосителей. Для дальнейшей проверки предположения о бактерионосительстве было проведено обследование сотрудников и пациентов, имеющих антитела к шигеллам, методом ПЦР с использованием «in hause» тест-системы, основанной на праймерах SF1 и SF2. Исследовали пробы фекалий 40 человек. У 2 больных и 5 технических сотрудников были выявлены бактерии рода Shigella. На рисунке представлена электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных при исследовании проб от серопозитивных пациентов больницы. После дополнительного курса лечения, повторное ПЦР обследование установило элиминацию возбудителя. В дальнейшем вспышки дизентерии в этом стационаре не регистрировались (рис. 7).

Экспериментальная лабораторная ПЦР тест-система на бактерии рода Shigella апробировалась также при расшифровке вспышек ОКИ в Доме ребенка Автозаводского района г. Нижнего Новгорода. В течение короткиого промежутка времени были зарегистрированы два групповых заболевания, по клиническим признакам сходных с дизентерией. Однако выявить шигеллы у больных традиционным бактериологическим методом не удавалось.

1 23456789 10 11

Рис. 7. ПЦР-исследование клинических проб серопозитивных пациентов с применением тест-системы первого поколения для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий

треки 3 и 10 положительный сигнал; трек 4 - слабо-положительный сигнал).

Методом ПЦР во время первой вспышки было проведено обследование 15 детей, возбудители дизентерии были выявлены у 3 человек. Во время второй вспышки при обследовании 10 детей с подозрением на дизентерию, у 3 пациентов методом ПЦР также были выявлены шигеллы.

При купировании вспышки дизентерии в психиатрической больнице и расшифровке вспышек ОКИ в доме ребенка, несмотря на отрицательный результат микробиологических исследований, метод ПНР позволил в первом случае установить источник инфекции, а во втором — этиологический агент. Однако недостатком проведенных ПЦР-исследований была их продолжительность. Результаты, из-за необходимости подращивания проб, были получены на 3-4 сутки, что не соответствует требованиям, предъявляемым к экспресс-методам.

Последующие, исследования проводились с использованием тест- системы «Ашр1у-1пу». Ее апробация была проведена на базе детской инфекционной больницы №8 г. Н. Новгорода. Было исследовано 165 фекальных проб от больных с диагнозами: ОКИ, дизентерия, гастроэнтерит, энтерит, пищевая токсикоинфекция, ОРВИ. Работа проводилась в режиме сопровождения лечебного процесса. Все пробы параллельно исследовались микробиологическим методом в бактериологической лаборатории больницы №8. Полученные результаты представлены в таблице 11.

Таблица 11.

Частота выявление бактерий рода Shigella у больных различными нозологическими формами заболеваний желудочно-кишечного тракта методом ПЦР и бактериологическим методом

Диагноз	Кол-во пациентов	Выявлено шигелл
		ПЦР		Бактер. метод
		Абс.ч.	%	Абс.ч.	%
ОКИ	49	30	61,2±6,9	8	16,3±5,3
Дизентерия	18	17	94,4±5,4	10	55,5±11,7
Гастроэнтерит	31	—	—	—	—
Энтерит	22	—	—	—	—
ОРВИ	18	—	—	—	—
Пищ.токс.инфекция	27	—	—	—	—
Всего	165	47	28,5±3,5	18	10,9±2,4

При ПЦР-исследовании шигеллы были выявлены у 47 пациентов (28,5±3,5%), при бактериологическом анализе шигеллы выделены из 18 образцов (10,9±2,4%). Эффективность выявления шигелл методом ПЦР во всей выборке оказалась достоверно выше бактериологического анализа в 2,6 раза (г = 4,2).

Положительные результаты, полученные обоими методами, были зарегистрированы при обследовании детей с диагнозами «ОКИ» и «дизентерия». Клинический диагноз «дизентерия» был подтвержден методом ПЦР у 17 пациентов из 18, бактериологическим методом - только у 10. При диагнозе ОКИ шигеллы выявлены ПЦР в 61,2±6,9% случаев, а высеяны только в 16,3±5,3 %. Эффективность ПЦР диагностики по сравнению с микробиологическим исследованием выше в 3,8 раза.

При одновременном исследовании клинического материала методом ПЦР и бактериологическим было получено 4 варианта результатов (рис. 8).

Данные бактериологического анализа и ПЦР-исследования совпадали в 80,0±3,1% случаев: отмечено совпадение отрицательных результатов — в 70,4±3,6%; а положительных результатов - в 9,6±2,3%.

Наиболее распространенный вариант несовпадения - положительный результат в ПЦР и отрицательный в микробиологическом исследовании был выявлен в 18,8±3,0% случаев. Существование таких вариантов может быть объяснено тем, что метод ПЦР как более чувствительный позволяет обнаружить низкие концентрации возбудителя, которые бактериологическим методом не определяются. Кроме того, метод ПЦР выявляет бактерии, находящиеся в некультивируемом состоянии.ПЦР- БАК -

• ПЦР + БАК +

• ПЦР + БАК -

• ПЦР - БАК +

Рис.8. Варианты результатов, полученные при параллельном исследовании клинического материала на наличие шигелл ПЦР и бактериологическим методом (в %).

Такая форма состояния сравнительно недавно выявлена у энтеробактерий - сальмонелл, шигелл и ряда других [23, 71]. Некультивируемое состояние характеризуется снижением метаболической активности и неспособностью рости на питательных средах при полном сохранении генома.

В 2 пробах шигеллы были выявлены бактериологически при отрицательном результате в ПЦР. Это, возможно, связано с ингибированием ПЦР компонентами клинической пробы. На момент проведения исследований тест-система еще не комплектовалась внутренним контрольным образцом, позволяющим выявлять случаи ингибирования ПЦР.

Следует отметить, что у детей со стертой клинической формой ОКЗ или с отсутствием симптомов заболевания результат бактериологического анализа, как правило, был отрицательным, а методом ПЦР шигеллы выявлялись.

1%

Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет выявлять низкие концентрации возбудителя, которые не вызывают манифестных форм заболевания. Полученный результат согласуется с исследованиями,

проведенными в Бангладеш [204], в которых показано преимущество метода ПЦР при детекции шигелл в клиническом материале.

Достоинства тест-системы «Amply-Inv» были продемонстрированы и подтверждены при расшифровке крупной вспышки дизентерии, охватившей 300 человек, в г. Кстово Нижегородской области осенью 2005г.

При поиске источников и факторов передачи инфекции исследовались фекальные пробы сотрудников молокоперерабатывающего предприятия, пробы питьевой воды, образцы продукции местного молочного комбината. Бактериологические исследования проб воды, смывов с оборудования на разных этапах технологического процесса, образцов продукции комбината не выявили шигелл.

Несколькими днями позднее были взяты аналогичные пробы и исследованы нами методом ПЦР на наличие бактерий рода Shigella. Полученные результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12

Результаты ПЦР исследования различных материалов на наличие бактерий рода Shigella.

Анализируемый материал	Количество образцов
	Исследованных	Положительных
Пробы воды	28	0
Продукты питания	46	1*
Смывы с объектов внешней среды	52	0
Фекальные пробы	19	2**

* - проба масла Кстовского молочного комбината;

** - пробы фекалий рабочих Кстовского молочного комбината

В результате бактерии рода Shigella были выявлены в одной из проб масла Кстовского молочного комбината и в фекальных пробах двух сотрудниц этого предприятия. Следует отметить, что в крови этих же сотрудниц методом РНГА службой санэпиднадзора были обнаружены антитела к шигеллам в диагностически значимом титре 1:200. Результаты ПЦР и серологического исследования, анализ особенностей распространения заболевания и санитарного состояния комбината в значительной степени подтверждали причастность к вспышке дизентерии Кстовского молочного комбината.

Тест-система «Amply-Inv» была апробирована также при расследовании вспышки ОКИ в детском оздоровительном лагере в Городецком районе в летний период 2002 г. Было обследовано 10 детей, госпитализированных из лагеря с диагнозом «ОКЗ». Во всех фекальных пробах этих детей методом ПЦР были выявлены бактерии рода Shigella, бактериологический анализ выявил наличие шигелл только у 3 детей.

Таким образом, использование ПЦР тест-системы «Amply-Inv» значительно (в 2,6 - 3,8 раза) позволяет повысить эффективность выявления шигелл при первичной диагностике ОКИ. Особо следует отметить положительные результаты детекции возбудителя при стертом и бессимптомном течении заболевания. Полученные результаты свидетельствуют не только о перспективности использования системы в лабораторной диагностике шигеллезов, но и о целесообразности ее использования при расшифровке вспышек дизентерии (для обследования контактных лиц, анализа объектов внешней среды, продуктов питания) с целью выявления источников и факторов передачи инфекции. Опыт практического применения тест-системы «Amply-Inv» свидетельствует о возможности ее успешного использования бактериологическими лабораториями инфекционных стационаров и ФГУЗ Центров «Гигиена и эпидемиология» Роспотребнадзора, располагающими оборудованием для проведения ПЦР.

ПЦР-диагиостика сальмонеллезое. ПЦР тест-система для выявления бактерий рода Salmonella разработки фирмы «Ниармедик» (Москва) апробирована при проведении плановых санитарно-эпидемиологических мероприятий весной 1995 г. Нами совместно с сотрудниками центра ГСЭН г. Н. Новгорода были обследованы мясокомбинат №1, продуктовые рынки Ленинского и Сормовского районов г. Н. Новгорода. Производились смывы с с тушек кур, мяса, яиц, оборудования, торгового инвентаря, прилавков. Пробы отбирали одновременно для ПЦР-исследования и бактериологического анализа. Микробиологические исследования на наличие бактерий рода Salmonella проводили специалисты бактериологической лаборатории городского центра ГСЭН.

Проанализировано 78 образцов. В 24 (30,8±5,2%) из них методом ПЦР были выявлены сальмонеллы, микробиологическим методом они были выделены из 10 (12,8±3,8%) смывов. Сальмонеллы методом ПЦР выявлялись в 2,4 раза достоверно чаще (t=2,8). Следует отметить, что все пробы, давшие положительный результат при бактериологическом исследовании, оказались положительными и при ПЦР-детекции.

Эта ПЦР тест-система была использована для выяснения причин повторяющихся внутрибольничных вспышек сальмонеллеза в больнице №35 г. Нижнего Новгорода в 1998 году. При проведении эпидемиологического расследования вспышек городской службой СЭН в результате серологического скрининга персонала больницы № 35 были выявлены 2 сотрудника (работники пищеблока) с серопозитивной реакцией. Бактериологический анализ положительных результатов не дал. При проведении ПЦР-исследования проб фекалий этих сотрудников на бактерии рода Salmonella в обоих случаях были получены положительные результаты, что свидетельствовало о бессимптомном носительстве. После санации бактерионосителей вспышки сальмонеллеза в больнице №35 не повторялись.

Апробированная тест-система показала свою эффективность при проведении санитарно-эпидемиологических исследований. Тем не менее, ряд ее недостатков, в первую очередь, необходимость культивирования исследуемых проб в накопительной среде, не позволяет рекомендовать ее для экспрессного выявления сальмонелл.

Дальнейшие исследования проводили с использованием тест-системы следующего поколения «Ампли-сенс - Salmonella species 250». За период 1999-2000гг. тест-система апробировалась при расследовании двух вспышек сальмонеллеза и при плановых обследованиях продовольственных рынков г. Нижнего Новгорода.

В июне 1999 года была зарегистрирована вспышка сальмонеллеза в Городецком районе Нижегородской области, охватившая 100 человек. Все заболевшие отмечали употребление пирожных с кремом, при приготовлении которого использовались яйца Балахнинской птицефабрики. В связи с этим была проведена проверка санитарного режима на указанном объекте. Исследования проводились совместно с сотрудниками бактериологической лаборатории и эпидотдела Областного центра ГСЭН и эпидемиологического отдела центра ГСЭН г. Балахны. Были исследованы 34 смыва с оборудования убойного и других цехах на разных этапах технологического процесса, с тушек птиц, с яиц, спецодежды, рук персонала, складского оборудования.

Несмотря на то, что непосредственно перед проверкой на фабрике проводились дезинфекционные мероприятия, на всех этапах технологического процесса была выявлена высокая контаминация оборудования сальмонеллами. Положительные находки были даже в пробах клея, используемого для наклейки этикеток на ящики с готовой продукцией. Сальмонеллы методом ПЦР были обнаружены в 20 образцах (58,9±8,4%), при бактериологическом исследовании - в 18 (52,9±8,6%). Во всех пробах, давших положительный результат в бактериологическом анализе, сальмонеллы были выявлены и методом ПЦР.

При плановой проверке санитарного состояния продовольственного рынка Советского района г.Н.Новгорода было проведено исследование 38 смывов с продуктов питания, торгового оборудования, одежды и рук продавцов. Методом ПЦР сальмонеллы выявлены в 7 образцах (18,4±6,3%), при микробиологическом исследовании получен один положительный результат (2,6±2,5%). Сальмонеллы обнаружены только в смывах с продукции птицеводства, оборудования, контактирующего с такой продукцией и рук продавцов, торгующих птицей.

Тест- система была также апробирована при расследовании вспышки сальмонеллеза пищевого характера, зарегистрированной в г. Саранске осенью 1999 г. Предполагалось, что фактором передачи инфекционного агента является майонез производства Нижегородского масложиркомбината. Было проведено исследование 15 проб майонеза и 9 образцов яичного порошка, использованного для изготовления этой партии майонеза. Методом ПЦР сальмонеллы выявлены в одной из проб майонеза и одной из проб яичного порошка. Микробиологическим методом бактерии рода Salmonella в данном материале обнаружить не удалось.

Как правило, при проведении санитарно-эпидемиологических исследований метод ПЦР существенно превосходил по эффективности бактериологический метод. Исключение составили результаты проверки Балахнинской птицефабрики. В данном случае обоими методами были показаны близкие значения выявления бактериий рода Salmonella (58,9% - ПЦР и 52,9% - бактериологическим методом). Возможно, это связано с высокой контаминацией птицеводческих производств сальмонеллами.

С 2002 г. совместно с сотрудниками детской инфекционной больницы №8 Н. Новгорода с использованием тест-системы «Ампли-сенс — Salmonella species 250» проводятся исследования клинического материала (проб фекалий) от детей с диагнозом «ОКЗ». Нами обследовано 526 пациентов. Методом ПЦР бактерии рода Salmonella выявлены у 169 детей, что составило 32,1±2,0% от общего числа обследованных. При параллельном бактериологическом исследовании сальмонеллы выделены у 76 человек (14,8±1,5%). Методом ПЦР бактерии рода Salmonella выялялись в 2,2 раза достоверно чаще (t=6,92)

Таким образом, проведенные нами исследования клинического материала, смывов с объектов внешней среды, продуктов питания продемонстрировали значительное преимущество ПЦР-детекции сальмонелл по сравнению с микробиологическим методом. Частота выявления инфекционного агента методом ПЦР была выше в 2 раза аналогичного показателя при бактериологическом анализе. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использования метода ПЦР в клинической практике с целью лабораторного обеспечения эпиднадзора за данной инфекцией (для первичной индикации сальмонелл в клиническом материале от больных с подозрением на ОКИ и пищевую токсикоинфекцию; в продуктах питания и объектах окружающей среды при расследовании вспышечной заболеваемости).

2.2.2.3. Изучение эффективности панели отечественных ПИР тест-систем для выявления наиболее значимых бактериальных возбудителей ОКИ в Нижегородском регионе

С 2003 г. ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора был начат выпуск экспериментальных ПЦР тест-системы для детекции бактерий рода Campylobacter и Y.enterocolytica. Появление этих диагностикумов сделало возможным проведение комплексного ПЦР-исследования клинического материала одновременно на четыре наиболее значимых и распространенных бактериальных возбудителя ОКИ - бактерии родов Salmonella, Shigella, Campylobacter и Y.enterocolitica. Подобные исследования представляют значительный практический и научный интерес. В Российской Федерации в настоящее время по официальной информации Роспотребнадзора 80% диарейных заболеваний остаются этиологически нерасшифрованными. Использование современных ДНК-технологий позволит повысить эффективность этиологической диагностики ОКИ.

По данным отечественной литературы сальмонеллезы и шигеллезы занимают ведущее место в структуре бактериальных кишечных инфекций в России [65]. Информация о кампилобактериозах и иерсиниозах практически

отсутствует, что обусловлено недостаточностью лабораторной диагностики этих заболеваний. Это связано как с объективными причинами (с уменьшением финансирования диагностических исследований), так и с проблемами методического характера. Поскольку бактерии рода Campylobacter являются труднонокультивируемыми микроорганизмами, выявление их бактериологическим методом - процедура сложная, трудоемкая и дорогостоящая.

S.4

Нами были исследованы 153 пробы фекалий от детей больных ОКЗ в возрасте от 3 мес. до 14 лет - пациентов Деской клинической инфекционной больницы №8 Нижнего Новгорода. Все пробы параллельно и одновременно исследовались бактериологическим методом и ПЦР с применением экспериментальных тест-систем для выявления бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolytica. Микробиологический анализ проб осуществляли специалисты бактериологической лаборатории инфекционной больницы №8. К сожалению, в этой лаборатории имелась возможность определять только бактерии родов Shigella и Salmonella. Результаты исследования представлены на рисунках 9 и 10

• Возбудитель не выявлен

• Shigella

■ Salmonella

■ Campylobacter

■ Yersinia

Рис. 9. Выявление бактериальных возбудителей ОКИ методом ПЦР у детей (данные в %)

• Возбудитель не выявлен

• Shigella

■ Salmonella

Рис. 10. Выявление бактериальных возбудителей ОКИ бактериологическим методом у детей (данные в %).

Методом ПЦР инфекционные агенты были обнаружены в 57 образцах клинического материала, что составило 37,3±3,9% от общего количества проанализированных проб. Случаев инфицирования несколькими инфекционными агентами не отмечалось. Наиболее часто выявлялись бактерии родов Salmonella и Shigella: в 45 (29,4±3,7%) и в 7 (4,5±1,7%) случаев соответственно. Бактерии рода Campylobacter были выявлены в 3-х пробах (1,9±1,1%), Yersinia enterocolitica в 2-х пробах (1,3±0,9%)

1.3%

При микробиологическом исследовании этиологический фактор ОКИ был установлен у 24 пациентов, что составило 15,7±2,9%. В 22 пробах (14,4±2,8%) были выявлены сальмонеллы; в 2 (1,3±0,9%) - шигеллы. Эффективность ПЦР-детекции сальмонелл была в 2 раза выше, чем бактериологического анализа, для шигелл этот показатель был выше - 3,5 раза. За счет обнаружения Campylobacter и Yersinia enterocolitica методом ПЦР количество ОКИ с установленным этиологическим агентом увеличилось на 3,2%. Во всех образцах, давших положительный результат в бактериологическом анализе, с помощью ПЦР также был выявлен аналогичный инфекционный агент.

12,1%

Использование ПЦР позволило повысить эффективность этиологической расшифровки ОКИ на 21,6 % (с 15,7±2,9% до 37,3±3,9%). Показано, что выявление этиологического агента ОКИ методом ПНР в 2,4 раза статистически достоверно выше, чем бактериологическим методом (г =

4,44)

Аналогичные исследования проведены на базе Клинической инфекционной больницы № 9 Нижнего Новгорода. Были исследованы 58 образцов фекалий от взрослых пациентов с клиническим диагнозом «ОКЗ». Методом ПЦР выявлялись 4 инфекционных агента, в бактериологическом исследовании - только бактерии родов Salmonella и Shigella. Результы представлены на рисунках 11 и 12. Методом ПЦР инфекционные агенты выявлены у 27 человек (48,3±6,6%), сальмонеллы - у 17 (29,3±6,0%), шигеллы - у 7(12,1±4,3%), кампилобактер у 4 (6,9±3,3%), иерсинии - у 2 (3,4±2,3%). У двух пациентов обнаружены ассоциации возбудителей: кампилобактер-иерсиния и шигелла-сальмонелла-кампилобактер. Такие варианты бактериальных ассоциаций крайне редки.

• Возбудитель не выявлен

• Shigella

■ Salmonella

■ Campylobacter

■ Yersinia

Рис. 11. Выявление бактериальных возбудителей ОКИ методом ПЦР у взрослых (данные в %)

• Возбудитель не выявлен

• Shigella

■ Salmonella

Рис. 12. Выявление бактериальных возбудителей ОКИ у взрослых бактериологическим методом (данные в %)

При бактериологическом исследовании положительные результаты получены в 11 случаях (19,0±5,2%). Сальмонеллы выделены от 9 человек (15,5±4,8%), шигеллы - от 2 (3,4±2,3%). Ассоциации не обнаружены. Эффективность выявления этиологических агентов методом ПЦР была в 2,5 раза достоверно выше, чем бактерологическим методом (1 = 3,48). Шигеллы ПЦР выявлялись в 3,5 раза чаще; сальмонеллы - в 1,9 раза чаще, по сравнению с бактериологическим методом.

Частота выявления бактериальных возбудителей ОКИ у взрослых больных оказалась выше, чем у детей (48,3±6,6% и 37,3±3,9% соответственно). Как правило, взрослые болеют бактериальными ОКИ реже, чем дети. Очевидно, высокая частота выявления инфекционных агентов, наличие ассоциаций возбудителей ОКИ в группе взрослых больных объясняется особенностями обследованного контингента. Существенную часть его составили лица без определенного места жительства и социально неадаптированные люди.

3,4%

Проведенные исследования свидетельствуют о существенном превосходстве комплексной ПЦР-детекции бактериальных возбудителей ОКИ по сравнению с микробиологическим методом по основному

показателю - эффективности выявления возбудителей ОКИ (в 2,4 раза - в группе детей, в 2,5 — в группе взрослых).

Кроме этого, комплексная ПЦР-детекция бактерий родов Salmonella, Shigella, Campylobacter и Y.enterocolitica технологичнее бактериологического анализа. Все четыре ГПДР тест-системы разработаны во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, что позволило проводить исследования в стандартных условиях: использовать единый метод обработки проб, общую схему приготовления рабочей реакционной смеси и постановки ПНР, и только две программы амплификации. За счет этого сокращена продолжительность исследования, упрощены манипуляции при проведении анализа и снижена его себестоимость.

Бактериологический анализ на бактерии родов Salmonella, Shigella, Campylobacter и Y.enterocolitica существенно сложнее и продолжительнее ПЦР. Унифицировать и стандартизировать условия проведения бактериологического анализа невозможно, поскольку только при работе с шигеллами и сальмонеллами используется сходный набор питательных сред. Условия культивирования и питательные потребности кампилобактеров и йерсиний существенно отличаются друг от друга и от аналогичных параметров шигелл и сальмонелл.

В настоящее время стоимость комплексного ПЦР-исследования одновременно на 4 инфекционных агента (Shigella, Salmonella, Campylobacter, Y.enterocolitica) на 15% ниже стоимости бактериологического исследования на Shigella и Salmonella.

Все это свидетельствует о перспективности использования комплексного ПЦР-исследования при проведении первичной индикации бактериальных возбудителей ОКИ. Метод ПЦР целесообразно использовать как при скрининговых обследованиях большого количества больных и контактных лиц, при групповой и вспышечной заболеваемости ОКИ, так и в клинической практике при исследованиях клинического материала от

одиночных пациентов, поступающих в инфекционные стационары при спорадической заболеваемости.