Глава 2. Материалы и методы исследований

Для выполнения поставленных задач проводились эксперименты по укоренению ремонтантной малины Бабье лето-2 при использовании различных концентраций и их сочетания фитогормонов и регуляторов роста растений.

2.1. Описание сорта Бабье лето-2

Ремонтантная малина сорта Бабье лето-2 – однолетняя, кустовая, селекции И. В. Казакова,  полученный от скрещивания сортов Оттом Близ и Бабье лето (рис. 1). Данный сорт – это улучшенный и дополненный вариант первого сорта. Бабье лето-2 – высокоурожайный сорт малины с сочными вкусными ягодами красивой рубиновой окраски. Ягоды  среднего размера (масса 3-3,5гр),  широко-тупоконические, хорошо отделяются от плодоложа. Ягоды кисло-сладкие, десертные, с нежной, сочной мякотью, пригодны для потребления в свежем  виде и всех видов переработки. Продуктивностью 2,0-2,5 кг с куста, или 12т/га, начало созревания ягод – в первой декаде августа, плодоношение продолжительное. Ягоды универсального значения. Отличается высокой толерантностью к основным грибковым болезням и устойчивостью к малинному клещу, почти полным созреванием урожая до наступления осенних заморозков. Куст среднерослый, слабороскидистый. Побегообразовательная способность умеренная (4-5 побегов).

Сорт Бабье лето-2 пользуется популярностью за обильное осеннее плодоношение, раннее созревание урожая и хорошее качество плодов. Рекомендуется для возделывания  в центрально-чернозёмном  регионе России.  Эта малина способна отдавать 80-90% потенциального урожая в условиях центра европейской части России. Ягоды среднего размера (масса 3-3,5 г), начинают созревать в первой декаде августа. Урожай – 2-2,5 кг с куста, побеги крепкие и не полегают под тяжестью урожая.

Рис. 1 – Плодоношение ремонтантной малины сорта Бабье лето-2

2.2. Состав питательной среды, применяемой для культивирования ремонтантной малины in vitro

Одно из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов состоит в соблюдении строгой стерильности. Тщательная стерилизация необходима, так как на искусственных питательных средах, предназначенных для культивирования растительных тканей и клеток, хорошо развиваются и микроорганизмы, что создает опасность для культивируемого материала. Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы, необходимые для работы.

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д.

Стерильные проростки выращивают с целью получения асептических растений и получения эксплантов in vitro.

В процессе культивирования стерильные культуры могут заражаться бактериями, грибами и другими организмами. Известны способы снижения контаминации путем предварительной промывки источников эксплантов, их стерилизации различными химическими препаратами и соблюдением стерильности при операциях введения эксплантов в стерильную культуру и пересадках для субкультивирования.

Известен способ, уменьшающий эараженность культур во время длительного культивирования, заключающийся во включении в питательные среды антибиотиков, в частности тетрациклина, что снижает выживаемость отдельных микроорганизмов, случайно попавших на поверхность питательной среды во время пересадок. Известны способы, препятствующие расселению клещей в культивационных помещениях и перезаражению культур, заключающиеся в фумигации лабораторных помещений и различных видах наружного применения химических препаратов (Высоцкий,1992).

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы, витамины, углеводы, фитогормоны. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, повышающие доступность железа для клеток в широких пределах рН.

Углеводы выступают необходимым компонентом питательных сред при культивировании изолированных клеток и тканей, так как они не способны к автотрофному питанию. Обычно в качестве источника углеводов используют сахарозу или глюкозу в концентрациях 20-40 г/л.

Регуляторы роста необходимы для дифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. В качестве источников ауксинов в питательных средах обычно используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 1-10 мг/л, а также индолилуксусную кислоту (ИУК) – 1-30 мг/л, и -нафтилуксусную кислоту (НУК) – 0,1-2 мг/л. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д.

Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар-полисахарид, получаемый из морских водорослей

При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге-Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге-Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. 

Для культивирования растений малины in vitro, а также для проведения экспериментов по укоренению пробирочных растений, применялась среда Мурасиге-Скуга (Murashige). Состав питательной среды указан в таблице № 1.

Таблица 1. Среда Мурасиге и Скуга, рН 5,6-5,8

Компоненты	Содержание, мг/л	Компоненты	Содержание, мг/л
NH4NO3	1650	Fe2SO4 7H2O	27,8
KNO3	1900	Na2-ЭДТА 2H2O	37,3
CaCl2 ^. 2H2O	440	Тиамин - HCl	0,1
MgSO4 ^. 4H2O	370	Пиридоксин - HCl	0,5
KH2PO4	170	Никотиновая кислота	0,5
MnSO4 ^.4H2O	22,3	Мезо-инозит	100
CoCl2 ^. 6H2O	0,025	Глицерин	2,0
ZnSO4 ^. 7H2O	8,6	ИУК	2,0
CuSO4 ^. 5H2O	0,025	Кинетин	0,2
Na2MoO4 ^. 2H2O	0,25	Сахароза	30.000
Kl	0,83

. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

2. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев, Наукова думка, 1980.

3. Валиханова Г.Ж.и др. Методическое руководство к практическим занятиям по культуре клеток растений. Алматы, КазГУ, 1983.

4. Валиханова Г.Ж.. Биотехнология растений. Алматы, Іонжиє, 1996.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

4. Шевелуха В.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высшая школа, 1998.

7. Биотехнология растений: культура клеток. М., ВО Агропромиздат, 1989.

8. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.Н., Прокофьев М.И.. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., ВО Агропромиздат, 1990.

9. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М., Наука, 1983.

10. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев, Наукова думка, 1984.

11. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М., Наука, 1988.

3. 12. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев, Наукова думка, 1990.

Общая сводная таблица

Гормон	Концентрация	Длина корня	Количество корней
ИМК	0,1	3,57	2,57
ИМК	0,5	4,75	2,4
ИМК	1	3,45	4,1
ИМК	1,5	2,87	4,4
ИМК	2	1,94	5,4
НУК	0,05	2,68	4
НУК	0,2	2,32	2,65
НУК	0,6	3,26	3,26
НУК	1	2,7	3,26
НУК	1,5	1,16	2,74
2,4 D	0,005	2,35	2,29
2,4 D	0,01	1,95	1,62
2,4 D	0,08	1,48	1,95
2,4 D	0,15	1,9	1,35
2,4 D	0,2	1,72	1,55
контроль		1,56	1,65

http://elibrary.ru/itembox_items.asp?id=216762

Полевой В.В. Фитогормоны. 1982.

7. Кулаева О.Н. Физиология растений. 1995, Кулаева О.Н. Физиология растений. 1962

т.42, с.661.

http://www.dissercat.com/content/mikroklonalnoe-razmnozhenie-selektsionnykh-form-remontantnoi-maliny-s-ispolzovaniem-novykh-r

http://www.dissercat.com/content/optimizatsiya-uslovii-ukoreneniya-zelenykh-cherenkov-kryzhovnika-i-barbarisa-v-plastikovykh-

Известно, что влияние экзогенных и эндогенных фитогормонов различно [12]. в этой связи хотелось бы подчеркнуть, что обработка фитогормонами всегда должна сопровождаться определением их эндогенного баланса. для цитокининов это особенно важно, поскольку в растения вносится синтетический аналог фитогормона. вместе с тем, как известно, действие отдельных групп фитогормонов взаимосвязано. между ними наблюдаются все типы взаимных влияний: от антагонизма до синергизма между тем исследований по влиянию экзогенных фитогормонов на их баланс недостаточно. Большинство работ проводилось на изолированных органах. При этом изучалось не содержание, а активность какого-либо одного гормона.

[12]. 12. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны. – М.: Наука, 1974. – 253 с.

http://www.vestnik-mgou.ru/mag/2010/estestv_nauki/2/st7.pdf

Это привлекает внимание ученых к исследованию их роли и механизма действия. К настоящему времени уже имеется детальная картина начальных этапов сигнализации ауксина. R. Napier (Великобритания) дал описание механизмов связывания ауксинов рецепторами TIR1 и ABP1. Ауксин-связывающий белок 1 (АВР1) был обнаружен более 30 лет назад. Затем было установлено, что АВР1 контролирует начальные этапы ответа клеток на ауксин, включая активацию и дезактивацию ионных каналов (К+, анионы) или транспортеров (Н+ - АТФаза). 

Н.Г. Холодный заложил основы науки о фитогормонах, еще когда был известен только один гормон ауксин. Но уже тогда он говорил о многогранности (“поливалентности”) действия этого фитогормона – возможности опосредовать различные эффекты в зависимости от концентрации и мишени действия, о локализации синтеза и о транспорте фитогормонов, о наличии большого разнообразия данных веществ, влияющих на различные процессы морфогенеза растений. Н.Г. Холодный впервые показал, что фитогормоны могут не только стимулировать, но и блокировать рост растений; впервые продемонстрировал морфогенетические эффекты фитогормонов и высказал идею о влиянии комплекса фитогормонов на процессы цветения. Н.Г. Холодный был убежден, что фитогормоны и их синтетические аналоги найдут широкое применение в сельскохозяйственном производстве. Последующее открытие комплекса гормонов растений и широкое применение их и их аналогов в современном растениеводстве полностью подтвердило правоту ученого. 

Методы микроразмножения основаны на подавлении апикального доминирования,

которое достигается либо удалением верхушечной почки, либо повышением содержания цитокининов в питательных средах.

Гормон	Концентрация	Количество растений	Vср.,мл	Vконц.
ИМК	0,1	20	40	0,8
ИМК	0,5	20	40	4
ИМК	1	20	40	8
ИМК	1,5	20	40	12
ИМК	2	20	40	12
НУК	0,05	20	40	0,4
НУК	0,2	20	40	1,6
НУК	0,6	20	40	4,8
НУК	1	20	40	8
НУК	1,5	20	40	12
2,4 D	0,005	20	40	0,1
2,4 D	0,01	20	40	0,2
2,4 D	0,08	20	40	1,6
2,4 D	0,15	20	40	3
2,4 D	0,2	20	40	4
контроль		20	40	-

27