Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

/ диссертация пцр

.pdf
Скачиваний:
25
Добавлен:
30.05.2015
Размер:
27.51 Mб
Скачать

1

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «НИЖЕГОРОДСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени академика И.Н.БЛОХИНОЙ

На правах рукописи

05201051003

МАЗЕПА

Владимир Николаевич fc.JUy

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов.

03.02.03микробиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант Профессор, д.м.н. Ефимов Е.И.

Нижний Новгород

2010

 

2

 

О Г Л А В Л Е Н ИЕ

Оглавление

2

Список сокращений

6

Введение

7

1. Обзор литературы

20

1.1Современные молекулярно-биологическиеметоды диагностики

инфекционных заболеваний

20

1.1.1. Молекулярное зондирование

21

1.1.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

23

1.1.3. Сложности, возникающие при использовании ПЦР

 

в практической диагностике

28

1.2. Современная лабораторная диагностика ряда актуальных

бактериальных и вирусных инфекций

29

1.2.1. Диагностика бактериальных ОКИ

29

1.2.2. Диагностика хеликобактерной инфекции

34

1.2.3. Диагностика парентеральных вирусных гепатитов

43

1.2.4. Диагностика НУГИ

54

1.3. Внедрение и использование ПЦР в практическом

здравоохранении

Российской Федерации

73

2. Собственные исследования

77

2.1. Материалы и методы

77

2.1.1. Материалы

79

2.1.2. Методы

80

2.2. Результаты собственных исследований

91

2.2.1.Формирование материальной базы для проведения исследований 91

2.2.1.1.Выбор приборов для проведения ПЦР

и фиксирования результатов

91

2.2.1.2. Сравнение вариантов выделения нуклеиновых кислот

 

из клинического материала

92

 

3

 

2.2.1.3. Разработка ПЦР тест-системдля выявления генов факторов

 

патогенности Enterobacteriaceae

93

2.2.1.4. Разработка ПЦР тест-системыдляэкспресс-детекции

 

шигелл и энтероинвазивных эшерихий

94

2.2.1.5. Адаптация отечественных ПЦР тест-системдля выявления

 

бактерий рода Salmonella к практическим исследованиям

105

2.2.1.6. Адаптация ПЦР тест-системыдля выявления

 

генов токсина и адгезинов V.cholerae

109

2.2.1.7. Адаптация ПЦР тест-системдля выявления H.pylori

110

2.2.1.8. Разработка полуколичественного варианта ПЦР детекции

 

H.pylori для контроля эффективности антихеликобактерной терапии

116

2.2.1.9. Адаптация ПЦР тест-системыдля выявления гена

 

вакуолизирующего

цитотоксина H.pylori VacA

116

2.2.1.10. Выбор и адаптация ПЦР тест систем для выявления

 

возбудителей вирусных гепатитов и НУГИ

118

2.2.1.11. Разработка полуколичественного варианта ПЦР

 

для детекции ВГВ иВГС

119

2.2.2. Значимые

направления использования молекулярно-биологических

методов в диагностике бактериальных ОКИ

122

2.2.2.1. Изучение распространенности генов факторов патогенности

бактериальных возбудителей

ОКИ с использованием молекулярно-

биологических методов

122

2.2.2.2. Использование ПЦР тест-системдля детекции бактерий родов Shigella и Salmonella всанитарно-эпидемиологическойи клинической

практике

127

2.2.2.3. Изучение эффективности панели отечественных ПНР тест систем для

выявления наиболее значимых бактериальных возбудителей

ОКИ в

Нижегородском регионе

137

4

2.2.2.4. Алгоритм использования метода ПЦР в диагностике бактериальных

ОКИ

143

2.2.3. ПЦР в диагностике хеликобактерной инфекции

 

и изучении ее возбудителя

146

2.2.3.1. Выявление H.pylori в различных типах

 

клинического материала

146

2.2.3.2. Сравнительный анализ результатов детекции Н. pylori,

полученных

традиционными и молекулярно-биологическимиметодами

149

2.2.3.3 Изучение распространенности H.pylori у больных с различными

формами гастродуоденальной патологии

154

2.2.3.4.Использование полуколичественного варианта ПЦР-детекции

H.pylori для оценки эффективности антихеликобактерной терапии

157

2.2.3.5 Использование ПЦР для определения резистентности H.pylori к

атибиотикам-макролидам

160

2.2.3.6. Изучение возможности использования метода ПНР для выявления

факторов патогенности H.pylori

160

2.2.3.7.Изучение гетерогенности нуклеотидных последовательностей

фрагментов гена CagA H.pylori методом гетеродуплексного анализа

164

2.2.3.8. Разработка алгоритма обследования больных с гастродуоденальной

патологией на инфицированность H.pylori методом ПЦР

168

2.2.4.Возможные направления использования ПЦР в диагностике

парентеральных вирусных гепатитов

171

2.2.4.1.Сопоставление результатов диагностики ВГВ и ВГС, полученных

 

методами ПЦР и ИФА

171

2.2.4.2. Активность вирусов при хронических ВГВ и ВГС, возрастные особенности хронических гепатитов В и С, репликация вирусных НК при

гепатитах смешанной этиологии

173

2.2.4.3.Изучение распространения ВГС ведущих генотипов в

Нижегородском регионе

180

5

2.2.4.4.Изучение вероятности вертикального пути передачи ВГС и

ВГВ

183

2.2.4.5. Оценка эффективности метода минипулов при обследовании

 

доноров

188

2.2.4.6. Разработка алгоритмов использования ПЦР для обследования

больных ВГС и ВГВ

 

 

190

2.2.5. ПНР в диагностике негонококковых урогенитальных инфекций

195

2.2.5.1. Место ПЦР в общей системе методов диагностики НУГИ

 

195

2.2.5.2 Сезонная динамика выявления возбудрттелей

НУГИ

у

женщин

репродуктивного возраста

 

 

200

2.2.5.3. Особенности распространения возбудителей НУГИ у женщин и

мужчин репродуктивного возраста

 

 

204

2.2.5.4. Особенности распространения возбудителей

НУГИ у

женщин и

мужчин с воспалительными процессами в органах мочеполовой системы и у

женщин с отягощенным акушерско-гинекологическиманамнезом

209

2.2.5.5.ПЦР-детекциявирусов папилломы человека, M.genitalium,

L.monocitogenes, T.gondii

218

2.2.5.6. Изучение распространенности и особенностей циркуляции возбудителей НУГИ среди новорожденных, детей разных возрастов и детей с

различными типами патологии

223

2.2.5.7. Оптимизация метода ПЦР с целью информативного и экономичного выявления возбудителей НУГИ. Разработка алгоритмов использования ПЦР

в диагностике НУГИ

231

Заключение

23 8

Выводы

260

Список источников литературы

262

Приложения

307

6

Список сокращений.

ВГВ — вирусный гепатит В ВГС — вирусный гепатит С ВГв - вирусный гепатит G BrD - вирусный гепатит D

ВКО - внутренний контрольный образец ВПГI/II - вирус простого герпеса I и II типов ВПЧ — вирус папилломы человека

ВПЧ ВКР - вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуно-ферментныйанализ ЛЦР — лигазная цепная реакция

НИФ - непрямая иммуно-флюоресценцияНК - нуклеиновая кислота

НУГИ — негонококковые урогенитальные инфекции ОАГА — отягощенный акушерско-гинекологическийанамнез ОКЗ — острое кишечное заболевание ОКИ - острая кишечная инфекция ОТ - обратная транскрипция

ПИФ - прямая иммуно-флюоресценцияПЦР — полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ХВГВ — хронический вирусный гепатит В

ХВГС — хронический вирусный гепатит С ЦМВ — цитомегаловирус

NASBA - транскрипционная амплификация

7

В В Е Д Е Н И Е

Актуальность проблемы.

На современном этапе для успешного выполнения приоритетных национальных проектов и правительственных программ в сфере здравоохранения, которые традиционно ориентированы на предупреждение распространения и ликвидацию актуальных и социально-значимыхинфекционных заболеваний, важное значение приобретает совершенствование методов их лабораторной диагностики.

Актуальной задачей является разработка и внедрение в практическую медицину и систему эпиднадзора технологий, отвечающих следующим требованиям: высокая чувствительность, прецизионная специфичность, информативность, объективность, экспрессность, высокая производительность, универсальность (выявление различных возбудителей в любом типе клинического материала), биобезопасность для исполнителей, возможность автоматизации процесса. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на выявлении уникальных фрагментов геномов инфекционных агентов, соответствует данным требованиям, существенно расширяет возможности диагностики, позволяет обнаруживать некультивируемые и труднокультивируемые формы микроорганизмов [16,89,161,278,281]. Универсальность метода ДНК-диагностикии автоматизация практически всех этапов анализа позволяют осуществлять одновременное выявление нескольких инфекционных агентов, способных вызывать определенный тип патологии, проводить скрининговые обследования различных контингентов населения в профилактических целях.

Несмотря на обилие публикаций, посвященных методу ПЦР и его использованию в диагностике отдельных нозологических форм, работы содержащие материалы комплексных ПЦР исследований инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей, достаточно редки. Данные о частоте выявления возбудителей зачастую противоречивы, а проблемы ПЦР обследования обширных контингентов одновременно на

8

несколько различных инфекционных агентов и определения роли и места молекулярно-биологическихметодов в общей системе лабораторной диагностики инфекционных заболеваний освещены недостаточно.

Широко распространенные социально значимые инфекционные заболевания, такие как острые кишечные и негонококковые урогенитальные инфекции, хеликобактериозы и вирусные гепатиты приносят значительный вред здоровью жителей России и экономический ущерб [34,35,65,90]. Кроме этого, хеликобактериозы и гепатиты существенно снижают продолжительность жизни, а негонококковые урогенитальные инфекции отрицательно влияют на репродуктивную функцию. Активизация и оптимизация внедрения современных технологий в диагностику этих инфекций способствует своевременному назначению этиотропной терапии, уменьшению продолжительности лечения и количества осложнений.

В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают вопросы выбора наиболее значимых направлений и объектов исследования, создания и подбора тест-системдляПЦР-диагностики,их апробации и адаптации к медицинской практике, разработки оптимальных алгоритмов применения как отдельных диагностикумов, так и сочетаний несколькихтест-системдля улучшения технологичности, повышения эффективности и уменьшения стоимости исследований.

Цель работы - оптимизировать и адаптировать собственные (экспериментальные) и коммерческие ГЩРтест-системык решению задач диагностики острых кишечных инфекций, хеликобактерной инфекции, негонококковых урогенитальных инфекций, вирусных гепатитов; разработать стратегию и тактику использования метода ГЩР для наиболее рационального и эффективного выявления возбудителей этих заболеваний.

Задачи исследования:

1. Провести оптимизацию методов ПЦР-диагностикидля выявления актуальных патогенов - возбудителей ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ.

9

2. Разработать алгоритмы диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ с использованием оптимизированных нами методов на основе отечественных ПНР тест-систем.

3. Апробировать и адаптировать к практической диагностике систему молекулярно-биологическихметодов выявления актуальных бактериальных возбудителей ОКИ - бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia,

Campylobacter и генов, ответственных за патогенность энтеробактерий.

4.Оценить возможности метода ПНР при изучении распространения бактерий Н. pylori у больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии, а также при внутривидовом типировании и выявлении генов факторов патогенности Н pylori.

5.Разработать экономичный вариант метода ПНР для оценки вирусной нагрузки у больных вирусными гепатитами В и С, изучить особенности репликации вирусов гепатитов В, С, D, G при моно- и смешанном инфицировании, определить эффективность и значимость вертикального пути передачи вирусов гепатитов В и С в Нижегородском регионе.

6.С помощью комплексного ПНР исследования получить новые знания о распространении и особенностях циркуляции наиболее значимых возбудителей НУГИ (U. lu^alyticum, М. hominis, С trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex MI) у взрослых и детей, и о возможной связи отдельных представителей НУГИ с формированием различных форм патологии.

7.На основе полученных новых знаний определить роль и место молекулярно-биологическихметодов в лабораторной диагностике НУГИ, ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов, провести апробацию разработанных алгоритмов их диагностики в практической медицине.

10

Научная новизна работы.

Впервые в Нижегородском регионе проведено освоение и внедрение в практическое здравоохранение и систему эпиднадзора метода ПЦР. На основе многолетних системных исследований группы возбудителей актуальных инфекционных заболеваний (ОКИ, хеликобактерная инфекция, НУГИ, вирусные гепатиты) получены новые данные о распространенности и особенностях циркуляции инфекционных агентов среди населения.

Разработаны оптимальные алгоритмы применения амплификационных методов для решения задач диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов, НУГИ. Определены роль и место данных технологий в общей системе диагностических исследований для наиболее рациональной и эффективной реализации последних.

Впервые разработаны экспериментальные лабораторные тест-системыдля выявления бактерий рода Shigella, и генов токсинов энтеробактерий (термолабильного - LT; термостабильного - ST; шигатоксина первого типа - VT1).

Впервые установлено, что использование ПЦР при первичном обследовании больных с подозрением на ОКИ позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим исследованием.

Впервые в РФ проведен многолетний мониторинг (18 лет) клинических изолятов энтеробактерий. Установлены особенности циркуляции в Нижнем Новгороде штаммов энтеробактерий, содержащих гены факторов патогенности. Наиболее распространены варианты, имеющие оперон инвазивности (Shigella ssp., E.coli). Показано, что циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий не характерна для Нижегородского региона. Выявлены единичные случаи обнаружения гена шигаподобного токсина первого типа у представителей Shigella ssp., Е. coli. Впервые выявлен факт наличия у Е. coli 0127 генетических структур, сходных по нуклеотидной последовательности с геном адгезии холерного вибриона.