Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Скачиваний:
53
Добавлен:
03.10.2013
Размер:
1.23 Mб
Скачать

142

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

Глава 20

Синтез и репарация ДНК

Резюме главы

В этой главе описываются реакции синтеза и репарации ДНК, протекающие в клетке. Особое внимание уделено регуляции инициации репликации ДНК у E.coli и ее сопоставлению с эукариотической системой. Рассматриваются проблемы, связанные с перекручиванием и недокручиванием спирали ДНК, и ферментные системы, участвующие в их устранении. Полимеразная реакция, в результате которой основания добавляются к растущей цепи, рассматривается вместе с репликативной вилкой, позволяющей копировать обе нити одновременно. Сравниваются механизмы репарации ДНК у про- и эукариотических систем. Роль теломерной ДНК рассматривается вместе с распространением транспозонов.

Цели урока

Основные различия между синтезом ДНК в бактериальной (E.coli) и эукариотической клеточных системах.

Полуконсервативная репликации ДНК.

Репликация у эукариот имеет сотни точек начала репликации и происходит в обоих направлениях.

Роль белков DnaA и DnaB (известных также как геликаза).

Взаимодействие между (+) и (-) сверхвитками ДНК.

Механизм релаксации (+) сверхвитков, образующихся при раскручивании ДНК под действием ферментов топоизомераз типа I и II.

Взаимосвязь между скручиванием и расплетанием цепей ДНК в нуклеосомах.

Ðîëü SSB-белка связывающегося с одноцепочечной ДНК белка (SSB - single strand binding protein).

Ðîëü ДНК-полимераз (Pol I, II и III).

Ðîëü ДНК-матрицы и праймера.

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

143

Основания добавляются к 3-концу праймера таким образом и рост новой цепи происходит в направлении 5′ → 3.

Роль РНК в инициации синтеза новой цепи.

Основные различия между ДНК- и РНК-полимеразами.

Взаимосвязь между направленностью действия двух соединенных вместе полимераз и репликацией двух цепей фрагмента ДНК.

Взаимосвязь между ведущей и отстающей цепями ДНК и движением репликативной вилки.

Присутствие фрагментов Оказаки на отстающей цепи ДНК.

Роль экзонуклеазной активности ДНКполимеразы I.

Природа коррекции (исправления ошибок).

Различие между высокой и низкой процессивностью.

Ðîëü ДНК-лигазы.

Роль белков Mut, S, L и Н и причина метилирования остатка аденина в GATC-последовательности родительской цепи.

Некоторые примеры химического повреждения ДНК.

Проблема дезаминирования и тот факт, что дезаминированный С - это U.

Роль механизма скользящего зажима (ядрышковый антиген пролиферирующих клеток; PCNA - proliferating cell nuclear antigen).

Значение того, что эукариотическая ДНК является линейной молекулой и 3-концы отстающей цепи полностью не реплицируются; роль фермента теломеразы.

Прогулка по главе

В момент клеточного деления хромосомы, содержащаяся в них ДНК должна ……………….(1). Репликация ДНК является как ………………..(2), поскольку каждая из двух родительских цепей служит …………….(3) для синтеза новой цепи. Для процесса репликации цепи необходимо разделить. В случае …………………(4) E.coli ДНК в точке начала репликации образуются две репликативные …………..(5), которые движутся в противоположных направлениях. Синтез происходит со скоростью около …………(6) копий пар оснований в секунду. После окончания синтеза новых цепей сцепленные кольца разделяются под действием фермента …………….……..(7) типа II. В эукариотических системах скорость репликации …………..(8); существует много (сотни)

………………(9) репликации и ……..………..(10) происходит в обоих направлениях. Каждый сегмент ДНК, репликация которого осуществляется под контролем единственной точки начала репликации, называется …………..(11). Точка начала репликации представляет собой специфическую последовательность оснований, особенно богатую А-Т-парами. Это облегчает разделение цепей, поскольку ……………….(12) -пары имеют только две водородные связи и не так прочно удерживаются вместе, как G-C-пары, имеющие три Н-связи. Связывание множества копий белка ………….…..(13) приводит к разделению цепей. Главный расплетающий белок,

144

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

 

 

известный как ………(14), в этом случае называется DnaB. Клеточный цикл в эукариотических клетках более сложен, чем у бактерий, и имеет ………………..(15) различных фазы; синтез ДНК происходит в течение ………..(16) фазы. Внешними митогенными сигналами для клеток животных часто служат факторы роста.

Ответы: (1) реплицироваться; (2) полуконсервативная; (3) матрицей; (4) кольцевой; (5) вилки; (6) 500; (7) топоизомеразы; (8) медленнее; (9) точек начала; (10) репликация; (11) репликон; (12) А-Т; (13) DnaA; (14) геликаза; (15) четыре; (16) S.

Сверхспирализация

Цепи ДНК, претерпевающие сверхспирализацию, могут быть .......……….…(1) ((+)-сверхвитки) или “недокручены” ((-)-сверхрвитки). Это происходит в результате того, что для разделения цепей ДНК необходимо …..………….(2), дуплекса, вызывающее “перекручивание” двойной спирали. Процесс уменьшения напряжения положительных сверхспиралей ………(3) репликативной вилкой неизбежно включает кратковременный ………………(4) полинуклеотидной цепи. Этот процесс катализирует ферменты …….………….(5) типов I и II. Фермент типа I ……………..(6) только одну из двух цепей, позволяя дуплексу на одной стороне разрыва вращаться относительно дуплекса на другой и снимать сверхспирализацию, с последующим восстановлением целостности цепи, включающим образование промежуточной ковалентной связи между ДНК и остатком

……………….(7) в молекуле фермента. У E.coli топоизомераза типа II, называемая также

…………………(8), решает проблему суперспирализации ДНК путем внесения ……….……….(9)

супервитков, нейтрализующих положительные супервитки. Механизм включает двухцепочечный разрез ДНК и последующий перенос двухцепочечной спирали ДНК через этот разрыв посредством протягивания одной дуплексной ДНК через ………….(10), сделанный во второй. Для протекания этого процесса требуется……..……….(11). Введение отрицательного сверхвитка эквивалентно

……………….(12) положительного супервитка.

 

Влияние на ДHK

 

 

 

 

Система

Òèï I

Òèï II

 

 

 

E.coli

.........................(13)

..........................(14)

 

 

 

Эукариоты

.........................(15)

..........................(16)

 

 

 

Равновесие между активностями гиразы и топоизомеразы I у E.coli поддерживает правильную степень сверхспирализации. Эукариотическая ДНК также находится в …………………(17) состоянии, но механизм его формирования не включает топоизомеразу; он связан с процессом «наматывания» ДНК вокруг ……..………….(18) хроматина, в ходе которого локальные положительные сверхвитки релаксируются, приводя таким образом к увеличению числа отрицательных супервитков.

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

145

 

 

Ответы: (1) “перекручена”; (2) вращение; (3) перед; (4) разрыв; (5) топоизомеразы; (6) разрывает;

(7) тирозина; (8) гиразой; (9) отрицательных; (10) пробел; (11) АТР; (12) расслаблению; (13) Релаксация (-)-сверхвитков; (14) Введение (-)-сверхвитков; (15) Расслабление обоих (+) и (-)- сверхвитков; (16) Расслабление (+)-сверхвитков; (17) недокрученном; (18) нуклеосом.

Инициация репликации

Ферменты ДНК ………………..(1) (Pol I, II и III) катализируют реакцию элонгации цепи ДНК с использованием в качестве субстратов дезоксирибонуклеозид…………….…………..(2) (dATP, dCTP, dGTP и dTTP). Для полимеразной реакции необходима………..……..(3) - фрагмент ДНК, с

которого будет происходить

копирование. Синтезируемый фрагмент ДНК комплементарен этой

матрице. Для инициации

необходим…………….(4) - олигорибонуклеотид, к которому

присоединяется растущая цепь. Наращивание длины праймера происходит по мере присоединения оснований к ……………….(5) концу, поэтому цепь удлиняется в направлении 5′ → 3. Это и обусловило правило записи последовательности ДНК, начиная с основания на 5-конце в направлении …………..(6). В инициации синтеза новой цепи участвует РНК (праймер). Напомним, что два главных отличия между РНК и ДНК состоят в наличии в РНК …………….(7) группы у 2- углерода и U вместо ……………..(8). Фермент РНК-полимераза отличается от ДНК-полимеразы тем, что он может ……..…………(9) синтез новых цепей в присутствии только .......…………..(10) (вместе с необходимыми нуклеотидтрифосфатами). Эту функцию выполняет фермент

…………….…………(11) и после того, как синтезируется небольшой фрагмент ……………….(12),

ДНК-полимераза начинает реакцию элонгации цепи. Репликативные ………………..(13) разделяют две цепи, поэтому по хромосоме могут продвигаться две ДНК-полимеразы. Белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК, (SSB), может связываться в любой точке вдоль одиночной цепи ДНК и таким образом помогать процессу расплетания спирали и предотвращать

......……….……………..(14) одноцепочечной формы. Эти две полимеразы объединены вместе и поэтому должны перемещаться в одном и том же направлении. Для того, чтобы синтез новой цепи происходил в 5′ → 3направлении, ……………………(15) должна читаться в направлении 3′ → 5, что приводит к синтезу новой …….…………(16) цепи и образованию дуплекса. Это означает, что при перемещении полимеразного комплекса по двум матричным цепям только одна из

………..……..(17) движется в правильном направлении относительно полярности одной из цепей ДНК. Цепь ДНК, имеющая правильную полярность, называется …….………(18) цепью. Другая цепь, репликация которой происходит прерывисто по мере продвижения полимеразного комплекса, называется ………………..(19) цепью. Репликация запаздывающей цепи инициируется под действием праймазы, которая синтезирует множество коротких праймеров, разделенных небольшими по длине последовательностями ДНК. Фрагменты ДНК, синтезирующиеся на этих праймерах отстающей цепи, называются фрагментами Оказаки.

146

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

Ответы: (1) полимеразы; (2) трифосфатов; (3) матрица; (4) праймер; (5) 3-; (6) 5′→ 3; (7) OH-;

(8) T; (9) инициировать; (10) матрицы; (11) праймаза; (12) РНК; (13) вилки; (14) повторный отжиг; (15) матрица; (16) антипараллельной; (17) полимераз; (18) лидирующей; (19) запаздывающей.

Заполните следующее

Полимеразная реакция

У E.coli фермент полимераза III удерживается на …………………(1) с помощью структуры типа зажима, образованной субъединицами белка с достаточно большим отверстием для прохождения молекулы ДНК. Как только ………….(2) расплетает двойную спираль ДНК и ………….…(3)

начинает строить короткие фрагменты РНК, разделенные короткими сегментами ДНК

……………..(4), матричная цепь делает короткую петлю в обратном направлении, направляя рост цепи в правильной полярности (3′ → 5для матрицы). Это позволяет наращивать обе цепи ДНК в направлении ………..………….(5) одновременно. Система петли продвигается вместе с полимеразами до тех пор, пока не синтезируется фрагмент Оказаки, после чего образуется новая петля. По мере продвижения полимеразной системы, фрагменты Оказаки отжигаются с матричной ДНК, оставаясь при этом разделенными ………………(6) на стыках ДНК/РНК фрагментов. ДНКполимераза I (Pol I) превращает эти отдельные фрагменты в непрерывную цепь ДНК путем

………………..(7) РНК, ………………..(8) ее ДНК и ……………….(9) вместе фрагментов ДНК. Последовательность этих событий такова. Сначала ДНК уже синтезированного фрагмента Оказаки элонгируется и перекрывает матрицу РНК следующего фрагмента. Эта элонгация ДНК происходит в правильном 5′ → 3направлении. Основания РНК, служащие праймером, вырезаются одно за другим с 5-конца праймера (5′ → 3……………....(10) активность) по мере того, как фермент Pol I перемещается по ДНК, элонгируя предварительно синтезированный фрагмент Оказаки. Этот

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

147

 

 

процесс продолжается до тех пор, пока не останется оснований …………..(11) между фрагментами новосинтезированной ДНК. Полимераза I способна также …….……………..(12) вновь синтезированную ДНК; это достигается путем вырезания отдельных оснований, неправильно спаренных с матричной цепью. Фермент Pol I остается в течение длительного времени связанным с цепью ДНК, что необходимо для завершения замещения РНК затравки, поэтому он имеет низкую

...…..………….(13). Разрыв, остающийся между фрагментами Оказаки, ликвидирует

…………..(14). Этот фермент принимает АМР (от АТР) и переносит его на 5- конец цепи ДНК, ……..………..(15), эту фосфатную группу, таким образом, что 3-гидроксил соседнего основания ДНК может вытеснить присоединенный АМР с образованием новой ………………………....(16) связи. …………………(17), пирофосфата PPi, освобождающегося на первом этапе реакции, является энергетическим двигателем реакции.

Ошибки в последовательности оснований во вновь синтезируемой ДНК ……………(18); их частота примерно составляет одну на 105-106 пар оснований. Фермент полимераза III также осуществляет корректирующую функцию, поэтому окончательная ошибка считывания составляет меньше одной на каждые ……………….(19) пар оснований. Второй механизм обеспечения точности репликации ДНК у E.coli включает три белка, названных Mut S, ………….(20) и Mut H. Процесс заключается в идентификации неправильно спаренных оснований, вырезании и замещении ошибочных оснований в новосинтезированной цепи. Основания вновь синтезируемой цепи отличаются от матрицы тем, что каждая ……….…………(21) последовательность родительской (или матричной) цепи ДНК содержит …………………..(22) группу, ковалентно присоединенную к остатку ……………….(23) этой последовательности. Новосинтезированная цепь ДНК …………….(24) этих метилированных аденинов. В случае неправильно спаренных оснований вновь синтезированная ДНК метится …………….(25) цепи у примыкающего участка GATC, не содержащего ……………(26) группы, и все основания между этим разрывом и ошибочной парой замещаются.

Ответы: (1) матрице; (2) хеликаза; (3) праймаза; (4) отстающая; (5) 5′ → 3; (6) разрывом; (7) удаления; (8) замещения; (9) соединения; (10) экзонуклеазная; (11) РНК; (12) корригировать; (13) процессивность; (14) ДНК-лигаза; (15) активируя; (16) фосфодиэфирной; (17) Гидролиз; (18) неизбежны; (19) 10+10; (20) Mut L; (21) GATC; (22) метильную; (23) аденина; (24) не содержит; (25) разрывом; (26) метильной.

148

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

Заполните следующее

Репарация ДНК

ДНК также чувствительна к …………..….(1) изменениям структуры или ……..…………(2) после того, как она уже синтезирована. Реакции, приводящие, например, к удалению основания [//////

………………..(3) и ………………….(4)], а также к дезаминированию цитозина и аденина, происходят ………..…..(5), но спонтанно и случайным образом. Повреждение ДНК может также иметь место в результате воздействия ……………….(6) радиации, свободных ……………(7)

кислорода, канцерогенов и …………………(8) света. При повреждении других молекул, таких как белки, они ………..……….(9), однако ДНК должна быть ……….………(10). Часто, когда повреждается только одна цепь дуплекса ДНК, другая может быть быстро репарирована. Существует множество различных типов механизмов репарации, включая …………..………(11)

репарацию, например, в том случае, когда под действием УФ света образуются тиминовые

………….(12); при этом происходит удаление аномальных связей с восстановлением исходной структуры оснований. …………………..(13) репарация нуклеотидов состоит в удалении

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

149

 

 

поврежденных или аномальных участков ДНК, ……………………….(14) двойную спираль. В этом процессе участвует ……………(15), которая удаляет основания из поврежденной цепи, а затем полимераза и ……………..(16) завершают репарацию. При ………………(17) репарации основания или репарации АР-сайта, из состава нуклеотида удаляется только основание, при этом АР (апуриновый или апиримидиновый) остаток сахара остается .......…………….(18) к цепи ДНК. Репарация АР-сайта включает этапы никирования (одноцепочечного разрыва), вырезания, замещения и “сшивания” цепи ДНК. Дезаминирование, происходящее естественным путем с небольшой, но заметной скоростью, превращает …………….(19) в урацил, а аденин в

………………(20). Эти аномальные основания должны быть удалены. Отличить …………..(21) остаток U и …………..(22) невозможно С . Основание U в составе РНК не создает много проблем, поскольку этот полинуклеотид существует более …………(23) промежуток времени, чем ДНК и поэтому ……………..(24) не репарируется.

Ответы: (1) химическим; (2) повреждению; (3) депуринизация; (4) депиримидирование; (5) медленно; (6) ионизирующей; (7) радикалов: (8) УФ; (9) разрушаются; (10) репарирована; (11) прямую; (12) димеры; (13) Эксцизионная; (14) искажающих; (15) эндонуклеаза; (16) лигаза; (17) эксцизионной; (18) присоединенным; (19) цитозин; (20) гипоксантин: (21) нормальный; (22) дезаминированный; (23) короткий; (24) РНК.

Дополнительные темы

Эукариотическая система, во многом сходная с системой E.coli, имеет своим характерные отличия. Эукариотическая система обладает …………..(1) ДНК-полимеразами, обозначаемыми греческими буквами. Механизм скользящего зажима называется …….…………….......……………….(2) (PCNA). Эукариотическая ДНК - ...……..(3) молекула, в то время как прокариотическая ..……..(4) - .......……………(5). Это различие обусловливает тот факт, что..………(6) концы линейных фрагментов ДНК при синтезе ……………..(7) цепи реплицируются ….(8) полностью, из-за того, что репликация 3-концевых участков включает образование фрагмента ……………(9). Поскольку

…………..(10) для синтеза фрагмента Оказаки является ……………..(11), которая затем удаляется, то несколько самых последних (или первых) оснований на 3-конце родительской цепи не

…………..…………..(12). Сегмент ДНК на 3-конце родительской цепи, называемый

………………….(13) ДНК, не несет информации; у человека он состоит из сотен повторяющихся последовательностей TTАGGG. Эта теломерная ДНК может быть ……….……………(14) к родительской ДНК, что необходимо для быстро ………………….……(15) клеток. Фермент, присоединяющий эти теломерные последовательности, называется …………..…..(16) и имеет уникальные характеристики. Он содержит в своем составе ………………..(17) и, действуя как

……………(18) транскриптаза, синтезирует ДНК на матрице …………….(19). Тот факт, что фермент обнаружен в …………….(20) клетках (которые постоянно и быстро делятся), но не в

……………..(21) клетках, позволяет предположить, что соматические клетки получают исходную

150 Глава 20: Синтез и репарация ДНК

“порцию” теломерной ДНК для обеспечения ……………….(22) клетки и ее потомства. Обнаружено, что некоторые …………(23) могут “прыгать” или перемещаться иным способом из одного участка хромосомы в другой или даже на соседнюю хромосому. Они называются

……………(24) а их «передвижение» катализирует фермент .......……..……..(25). Ген подобного типа, названный IS, ………..……………(26), был обнаружен у E.coli. Интересно, что этот ген кодирует …………………(27) транспозазу. Существуют различные модели, описывающие репликацию транспозона и встраивание его копий в какой-либо участок ДНК. Процесс, создающий множественные идентичные последовательности в геноме, приводит к …………..………..(28) рекомбинации.

Ответы: (1) пятью; (2) ядрышковым антигеном пролиферирующих клеток; (3) линейной; (4) ДНК;

(5) кольцевой; (6) 3; (7) запаздывающей; (8) не; (9) Оказаки; (10) праймером; (11) РНК; (12) реплицируются; (13) теломерной; (14) присоединена; (15) делящихся; (16) теломеразой; (17) матрицу; (18) обратная; (19) РНК; (20) зародышевых; (21) соматических; (22) жизненного цикла; (23) гены; (24) транспозонами; (25) транспозаза; (26) инсерционной последовательностю; (27) фермент; (28) гомологичной.

Обзор вопросов в конце главы 20

Репликон - участок ДНК, копирующийся с единственной стартовой точки начала репликации.

Топоология имеет дело с полной трехмерной структурой и относительными конфигурациями.

Релаксация (+) супервитков и введение (-) супервитков оказывают одинаковый эффект.

Главное различие между топоизомеразами I и II состоит в том, что фермент типа I разрезает

только одну цепь ДНК, а типа II - обе цепи.

Закручивание ДНК вокруг нуклеосомы добавляет отрицательные супервитки.

Для синтеза ДНК необходимы все четыре дезоксинуклеотидтрифосфата.

Спаривание оснований А-U аналогично спариванию А-Т; U встречается в РНК,а Т - в ДНК. Структурное различие между основаниями U и Т состоит в присутствии метильной группы в Т. Продолжая аналогию, цитозин отличается от урацила тем, что у С имеется аминогруппа, а у U - кислород в одном и том же положении. Химическая реакция, в ходе которой удаляется аминогруппа цитозина и образуется основание урацил, происходит в ДНК медленно, но с постоянной скоростью. Присутствие урацила в ДНК, не являющегося ее нормальным компонентом, указывает на дезаминирование цитозина. Урацил является природным компонентом РНК.

Праймер необходим для присоединения к молекуле ДНК новых оснований. Последние добавляются к свободному 3-ОН концу сахара рибозы, поэтому наращивание цепи происходит в направлении 5′ → 3.

Субстратами полимеразной реакции для удлинения цепи ДНК служат свободные молекулы

Глава 20: Синтез и репарация ДНК

151

 

 

нуклеозидтрифосфатов.

Процессивность есть мера того, как долго фермент полимераза остается связанным с ДНКматрицей и реплицирует ДНК.

Полимераза I обладает тремя различными ферментативными активностями. Полимераза I присоединяется к разрыву между следующими друг за другом фрагментами Оказаки и наращивает нуклеотиды. Фермент также удаляет основания РНК-матрицы следующего фрагмента Оказаки, пока этот вновь синтезированный фрагмент не перекроет предыдущий,

синтезированный ранее. Кроме того, экзонуклеазная активность необходима для удаления ошибочно спаренных оснований.

Правильное спаривание с матрицей, поступающего нуклеотидтрифосфата подразумевает добавление к растущей цепи основания, соответствующего спариванию Уотсона-Крика. В случае ошибка и неправильного формирования Н-связей, механизм коррекции предусматривает разрыв ковалентных фосфодиэфирных связей, удерживающих неправильное основание присоединенным к растущей цепи.

Проблемой, близкой к ошибочному спариванию оснований, является определение того, какое же из двух оснований должно быть удалено, а какое (правильное) должно быть использовано в качестве матрицы в процессе исправления ошибки. Наиболее хорошо этот механизм изучен у E.coli и называется метил-зависимым путем исправления ошибок. В его основе лежит метилирование остатков аденина в последовательности GATC на ДНК. Поскольку исправление вновь синтезируемой цепи ДНК происходит до ее метилирования, то в новой цепи с неправильной последовательностью оснований остатки метилированных аденинов отсутствуют.

УФ-облучение может вызывать образование ковалентного димера между двумя соседними остатками тимина. Эта мутация может быть исправлена при помощи специальной реакции, ликвидирующей димеризацию или удаляющей и замещающей два основания.

3-Конец запаздывающей цепи ДНК содержит фрагмент РНК, используемый в качестве праймера. Эта РНК не остается надолго связанной с ДНК, поскольку затем она замещается вновь синтезированым фрагментом ДНК.

Теломерная ДНК присоединяется потому, что основания на 3-конце запаздывающей цепи ДНК не копируются и утрачиваются в процессе деления клеток. Эти основания не являются необходимыми, поскольку их последовательность не несет информации.

Дополнительные вопросы к главе 20

1.С какой скоростью синтезируется ДНК у E.coli?

2.Какова роль фермента топоизомеразы типа II у E.coli?

3.Какова частота ошибок в последовательности новосинтезированной и окончательно образованной ДНК? Чем обусловлено это различие?

Соседние файлы в папке Джефферсон - Сборник упражнений и задач - 2000