2.2 Микроскопический метод

К микроскопическому методу прибегают в том случае, если макроскопический метод не дал должных результатов. Метод заключается в исследовании под микроскопом спороношений возбудителей или пораженных тканей растений.

Микроскопический анализ ценен тем, что позволяет обнаруживать характерные и безусловно точные признаки, присущие возбудителям (грибы, бактерии, вирусы), например, у грибов форму и цвет спор, форму сумок, наличие парафиз и др. Для практиков этот метод хорош в большей мере тем, что с его помощью можно установить наличие возбудителя в тканях растения, когда нет явных признаков поражения. При исследовании пораженных растительных тканей с целью обнаружения бесцветной или слабоокрашенной грибницы используют дифференцированное окрашивание. Так, для диагностирования инфекционного полегания производят окрашивание КМпО₄. С этой целью берут кусочек стебелька в области корневой шейки, размачивают его в капле воды и раскатывают до образования тонкой полоски ткани, затем наносят на эту полоску каплю 3-5 % раствора марганцевокислого калия. Через 2-3 минуты препарат промывают водой и рассматривают под микроскопом. В случае инфекционного характера болезни клетки тканей будут заполнены гифами гриба бурого цвета. При неинфекционном полегании в клетках просматривается сжавшаяся плазма.

При диагностировании шютте обыкновенного сосны на ранних стадиях развития продольные срезы хвои погружают на несколько минут в этиловый спирт, затем споласкивают водой и помещают в состав 1% раствора анилинового синего и молочной кислоты (1:1). После этого срезы подогревают до парообразования, краситель удаляют с помощью фильтровальной бумаги, а срез нагревают в молочной кислоте. При этом гифы гриба становятся синими или темно-голубыми и хорошо выделяются на светлом фоне тканей хвои.

Дифференцированную окраску грибов применяют также и при микроскопическом исследовании тканей древесины, пораженной дереворазрушающими грибами. Так, В. Рипачек рекомендует с целью окрашивания грибных гиф погружать срезы древесины в дистиллированную воду, к которой добавляют несколько капель 10% раствора азотнокислого серебра. После такой обработки гифы окрашиваются в темно-бурый цвет, а древесина приобретает лишь светло-коричневый оттенок.

По способу С.И. Ванина тонкие срезы пораженной древесины на предметном стекле обрабатывают 10 % раствором азотнокислого серебра, подогревают до кипения, затем смывают несколькими каплями воды и обрабатывают 10% раствором едкого калия (КОН). Снова доводят до кипения, отмывают в воде и рассматривают под микроскопом. Препарат окрашивается в бурый цвет, гифы становятся более темными, древесина – светлее.

При диагностике болезней бактериальной этиологии широко используют окраску по Грамму и другие методы окрашивания препаратов.

2.3 Микологический метод

Микологический метод используется в том случае, когда спороношения возбудителей отсутствуют, а по особенностям грибницы невозможно установить вид возбудителя. Поэтому метод заключается в выделении гриба из пораженных частей растений, изоляции его и выращивании на искусственной или естественной среде. Микологический метод может быть осуществлен двумя способами:

• влажной камеры,

• чистой культуры.

Способ влажной камеры основан на способности грибницы, находящейся внутри тканей растения во влажных условиях прорастать наружу и образовывать спороношения. Влажную камеру можно изготовить из чашки Петри, на дно которой кладут кружок фильтровальной бумаги, равный по диаметру дну чашки. Влажную камеру стерилизуют в сушильном шкафу. Чашки можно также стерилизовать кипятком или спиртом. Фильтровальная бумага смачивается дистиллированной или охлажденной кипяченой водой. Для устройства влажной камеры можно использовать мелкие тарелки, блюдца и куски оконного стекла. Объекты исследования (хвою, листья, кусочки древесины и пр.) после стерилизации раскладывают на дно влажной камеры, которые помещают в термостат или оставляют в помещении при температуре 20-25⁰С. Способ влажной камеры благодаря своей простоте находит широкое применение при диагностировании многих болезней: инфекционного полегания, шютте, поражения древесины синевой и т.д.

Способ чистой культуры более сложен и требует определенных навыков. Способ дает возможность выделить патогена из больного растения, изолировать от посторонних микроорганизмов и вырастить в чистом виде до появления спороношений или хорошо выраженных культуральных признаков. Для получения чистой культуры и поддержания ее в состоянии жизнеспособности используют питательные среды (искусственные или естественные, твердые или жидкие). Чаще всего используют агаризованные среды разного состава, предварительно разлитые в горячем виде в колбы, чашки или пробирки. Рецепты приготовления питательных сред приводятся в специальных пособиях по технике и методам фитопатологических исследований. Перед использованием питательные среды стерилизуют в автоклавах или в аппарате Коха. Вообще использование способа чистой культуры требует неукоснительного соблюдения условий стерильности на всех этапах работы (подготовка посуды, питательной среды и растительных объектов, выделение чистых культур).

Выделение чистых культур грибов из различных сред обитания имеет свои особенности. Так, возбудителей некрозно-раковых болезней, трахеомикозов, гнилей выделяют из пораженных тканей путем посева простерилизованных кусочков коры или древесины на питательные среды или из спор и мицелия, полученных во влажной камере.

Подробнее эти вопросы можно посмотреть в специальной литературе, приведенной в библиографическом списке.