Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Активные формы кислорода.docx
Скачиваний:
110
Добавлен:
10.06.2015
Размер:
321.13 Кб
Скачать
  1. Активные формы кислорода – классификация, свойства, функции.

В случае классического рецепторного сигналинга в ответ на взаимодействие лиганда с рецептором в клетке продуцируется диффундирующий вторичный мессенджер, который передает сигнал путем взаимодействия со своей мишенью. Подобный механизм одновременно способствует и распространению сигнала в пространстве за счет быстрой диффузии мессенджера, и амплификации сигнала, так как многие вторичные мессенджеры продуцируются ферментативным путем в большом количестве в ответ на стимул. Как правило, вторичные мессенджеры – это маленькие диффундирующие молекулы, которые способны быстро активировать белки-эффекторы (например, протеинкиназы, фосфатазы, ионные каналы) путем связывания с ними или их химической модификации.

Наиболее хорошо изученными вторичными мессенджерами являются циклические нуклеотиды (cAMP, cGMP), разнообразные липиды (инозитфосфаты, эйкозаноиды) и ионы (Са2+, Zn2+).

Исторически сложилось мнение, что активные формы кислорода (АФК) являются побочными продуктами окислительного метаболизма и не имеют специфической функции. Однако открытие участия АФК в регуляции многих сигнальных путей позволило предполагать, что их внутриклеточная продукция – это ответ клеток на окружающие стимулы.

Основным свойством вторичного мессенджера является специфичность по отношению к эффектору, участвующему в сигнальном пути. Специфичность действия АФК может достигаться как за счет кинетики реакций, осуществляемых ими, так и за счет пространственных отношений между мессенджером и мишенью.

Супероксидный анион-радикал (далее супероксид) O2–окисляет тиолы до тиил-радикала, который далее может инициировать радикальную цепную реакцию. Однакоконстанта скорости этой реакции относительно небольшая (~ 103 M-1 с-1, pH 7.4). В действительности, окисление тиолов супероксидом скорее представляет собой реакцию с гидроперекисным радикалом НO2•(протонированной формой O2–, pKa для О2 – 4.7), чем с самим O2–. При рН 7.0 константа скорости реакции окисления тиолов супероксидом становится незначительной по сравнению с константами скорости ферментативных реакций для цитоплазматических и митохондриальных супероксиддисмутаз (более 109 M-1 с-1).

Супероксид, продуцируемый различными изоформами NADPH-оксидазы (Nox1, Nox2 и др.), имеет возможность принять участие в сигналинге, однако внутри клетки супероксид под действием супероксиддисмутаз мгновенно дисмутирует в Н2О2. Таким образом, наиболее вероятная сигнальная роль супероксида in vivo –это быть предшественником Н2О2.

Существует группа белков, претендующих на роль внутриклеточных сенсоров супероксида, а именно некоторые Fe2S2-содержащие белки, в которых один из ионов железа, составляющих кластер, обращен в водную фазу (Fe2S2-белки). Такой ион может легко подвергаться окислению супероксидом, что вызывает разрушение кластера Fe2S2*и, как следствие, изменение конформации белка. Наиболее изученными «рецепторами» супероксида подобного рода являются белки SoxR из Escherichia coli и аконитазы. В условиях окислительного стресса Fe2S2*-содержащий белок SoxR в цитоплазме E.coli подвергается окислению супероксидом, в результате чего кластерное соединение теряет целостность. Белок, изменив

конформацию, запускает транскрипцию ряда генов, в том числе гена супероксиддисмутазы.

Подобным образом окисляется и железо кластера Fe4S4* аконитаз (другое название цитоплазматической аконитазы – IRP1, iron regulatory protein). IRP1 с разрушенным кластером приобретает способность связываться с РНК, содержащей участок IRE (iron responsive element), и подавлять трансляцию ряда белков, в число которых ферритины, митохондриальная аконитаза и транскрипционный фактор HIF-2α.

По сути, механизм супероксидопосредованного переключения функций белков, в составе которых обнаружены кластерные соединения типа Fe2S2*, может оказаться универсальным путем передачи сигналов, связанных с энергетическими функциями клетки, поскольку многие белки-хелаторы ионов металлов переменной валентности задействованы в

транспорте электронов от окисляемых субстратов к конечным акцепторам.

Гидроксил-радикал OH•крайне реакционноспособен и не обладает специфичностью в реакциях практически ни с одной из органических молекул. Гидроксил-радикал образуется в качестве вторичного продукта свободнорадикальных реакций с участием супероксида и пероксида водорода. Поэтому эта молекула не рассматривается в качестве мессенджера.

Синглетный кислород (O2) продуцируется в клетках неферментативным путем, поэтому пока нет никаких данных о времени и месте его специфической продукции – характерных критериев вторичного мессенджера. Кроме того, до сих пор не обнаружено ни одного физиологического процесса окисления с участием синглетного кислорода, что также делает маловероятным его рассмотрение в качестве сигнальной молекулы.

Пероксид водорода – единственный из АФК, благодаря контролируемым

ферментативным процессам своей продукции и деградации, обеспечивающим специфичность времени и места присутствия H2O2, претендует на звание вторичного мессенджера. Важным свойством вторичного мессенджера является его способность контролировать активность ферментов, вовлеченных в передачу сигнала внутри клетки. H2O2 способна регулировать активность сигнальных белков через их окислительную модификацию, используя в качестве мишеней сульфгидрильные группы белковых молекул.

2. Пероксид водорода – основная сигнальная молекула, характеристика.

Продукция пероксида водорода. Около 80% перекиси водорода, появляющегося в очаге воспаления, образуется в клетке в результате реакции дисмутации супероксида (уравнение 1), генерируемого NADPH-оксидазами (Nox).

2O2– + 2H+ - H2O2+ O2(1)

Использование цитотоксичной молекулы H2O2 в качестве сигнала представляет собой очевидный риск для клетки, поэтому не удивительно, что продукция Н2О2 NADPH-оксидазами в высокой степени регулируется. Активация NADPH-оксидаз осуществляется через контролируемую многостадийную сборку активного комплекса на мембране. Процесс сборки

запускается в ответ на стимуляцию клеток, например, факторами роста и цитокинами. Пероксид водорода, продуцируемый внеклеточно, может проникать в клетку и также вносить вклад в редокс-сигналинг.

Топология его продукции. NADPH-оксидазы переносят электроны из цитоплазмы в компартменты, топологически эквивалентные внеклеточному пространству (просвет эндосом, люмен эндоплазматического ретикулума) и собственно во внеклеточную среду. Там и образуется супероксид – предшественник Н2О2.

Так, группой Джона Энгельгардта показано, что супероксид транспортируется в цитоплазму через анионные каналы. С другой стороны, реакция дисмутации достаточно эффективна и в отсутствие супероксиддисмутаз, причем скорость реакции возрастает при снижении рН. Поэтому для поздних эндосом, в которых рН смещен в сторону кислых значений, можно ожидать образования Н2О2 в люмене с последующей

диффузией в цитоплазму. И хотя Н2О2 может свободно диффундировать через мембраны in vitro, в клетке изменения в составе липидов и белков мембран, а также присутствие каналов для Н2О2 (например, аквапоринов) могут регулировать проницаемость мембран для Н2О2 и возможность его взаимодействия со специфичными белками-мишенями.

Механизм передачи сигнала с помощью Н2О2. Основным механизмом, благодаря которому Н2О2 может выполнять сигнальную функцию, является специфичная, обратимая модификация некоторых аминокислотных остатков в белках. В основном к таким остаткам относятся цистеины, однако и другие аминокислоты могут подвергаться окислению Н2О2. Пероксид водорода действует как сигнальная молекула путем прямого взаимодействия с аминокислотными остатками белка-мишени или опосредованно, с привлечением пероксидаз. В одних случаях продукты таких реакций ингибируют функцию белка, блокируя важные каталитические аминокислотные остатки, например, цистеины в активных центрах

тирозинфосфатаз. В других –модификации в белке-мишени могут привести к изменению его конформации или изменениям во взаимодействии с другими белками и таким образом способствовать активации или ингибированию функции модифицируемого белка или связанных с ним белков.

Одним из наиболее важных факторов, влияющих на возможность белка

взаимодействовать с Н2О2 и, в результате, принимать участие в редокс-сигналинге, является скорость реакции окисления белка Н2О2. Так как Н2О2 взаимодействует с SH-группами остатков цистеина, то их конформационная доступность и степень депротонирования являются лимитирующими факторами, определяющими их реакционную способность. Благодаря этим

двум факторам действие Н2О2 является специфичным, что и наблюдается в процессе редокс-сигналинга. Доступность аминокислотного остатка зависит от структуры белка. Белки, участвующие в редокс-сигналинге, содержат тиолы, которые доступны для тех сигналов, которые они должны «чувствовать». Степень ионизация тиола (уравнение 2), зависит от величины рН и присутствия вблизи цистеиновых остатков положительно заряженных

аминокислотных остатков, которые стабилизируют отрицательно заряженный тиол и таким образом снижают значение его рKа.

PrSH ⇄ PrS–+ H+ Pr –белок (от protein) (2)

Для обычных тиольных групп белков среднее значение рKа (8.0 – 8.5) выше величины значения рН биологических систем, что исключает взаимодействие этих групп с Н2О2 в физиологических концентрациях. Большинство белков-сенсоров Н2О2 имеют остаток цистеина с низким значением рKа. Дополнительной особенностью, благодаря которой может быть увеличена скорость реакции Н2О2 с тиолом белка, является присутствие аминокислотных остатков, стабилизирующих переходное состояние окисляемого остатка. Подобное аминокислотное окружение, обспечивающее более высокую скорость реакции с Н2О2, встречается в активных центрах ферментов-антиоксидантов, например, у тиоловых пероксидаз, которые предназначены для деградации Н2О2. Другие редокс-чувствительные белки,

участвующие в сигналинге, например,бактериальный транскрипционный фактор OxyR, могут также иметь такие аминокислотные остатки, стабилизирующие переходное состояние.

Реакция Н2О2 с тиольными группами белков приводит к образованию

цистеинсульфеновой кислоты (уравнение 3).

PrS–+ H2O2 - PrSOH + HO– (3)

Сульфенаты белков OxyR и Orp1 неустойчивы и часто превращаются в другие производные. Сульфенаты могут быть в дальнейшем окислены Н2О2 до более высокой степени окисления: сульфиновой и сульфоновой кислоты (уравнения 4 и 5).

PrSOH+ H2O2 - PrSO2H+ H2O (4)

PrSO2H + H2O2 - PrSO3H + H2O(5)

В отличие от сульфеновой кислоты, сульфиновая и сульфоновая кислоты более стабильны, чем сульфеновая, и с трудом поддаются восстановлению in vivo. Образование сульфиновой кислоты играет важную роль в процессе редокс-регуляции пероксиредоксинов и, возможно, других белков, где эта модификация приводит к ингибированию функций белка, если затрагивает ключевой каталитический остаток Cys. Сульфиновая кислота в пероксиредоксинах далее может быть медленно восстановлена обратно в сульфеновую кислоту с помощью семейства белков сестринов и сульфиредоксинов при участии ATP.

С другой стороны, образование сульфоновой кислоты считается необратимой реакцией, так как до сих пор не известны системы, восстанавливающие ее in vivo. Помимо превращения в соединения с более высокими степенями окисления, сульфенаты могут также реагировать с низкомолекулярными тиолами с образованием смешанных дисульфидов (уравнение 6); с другими остатками Cys с образованием межцепочечных дисульфидных связей (уравнение 7), а также взаимодействовать с амидными группами боковой

цепи белка с образованием циклических сульфаниламидов (уравнение 8).

PrSOH + RS– - PrS-SR + HO– (6)

PrSOH + PrS– - PrS-SPr + HO– (7)

Pr –белок (от protein)

R –углеводородный радикал.

Если присутствует конформационно доступная тиольная группа, предпочтительным, как правило, является формирование внутрицепочечной дисульфидной связи, т.к. локальная концентрация атакующего тиола в таком случае является высокой. В других случаях первоначально образованный сульфенат может образовать смешанный дисульфид с тиоловыми кофакторами (глутатион, коэнзим А, тиоредоксин). Ввиду высокого содержания глутатиона у большинства клеток, образование смешанного дисульфида с глутатионом – наиболее часто наблюдаемая модификация, которая может регулировать активность многих белков.

Кроме прямого механизма модификации остатков полипептидной цепи белка с образованием цистеинсульфенатов, Н2О2 может также играть роль редокс-сигнала через окисление глутатиона и тиоредоксина – универсальных переносчиков восстановительных эквивалентов в клетке, поддерживающих «дисульфидный» гомеостаз. Глутатион и тиоредоксин имеют высокие внутриклеточные концентрации и поддерживаются в восстановленном

состоянии с помощью NADPH-зависимых редуктаз. Реакция дисульфидного обмена (уравнение 9) может в равной степени происходить, например, с глутатионом с образованием глутатионилированого белка или с образованием глутатиондисульфида.

PrS-SPr + RS– - PrS-SR +PrS–

R –углеводородный радикал (9)

Дисульфид глутатиона и смешанные дисульфиды, образованные таким образом, могут взаимодействовать с тиолом белка через реакцию тиол-дисульфидного обмена. Реакция тиол-дисульфидного обмена между глутатиондисульфидом и SH-группой белка in vivo проходит достаточно медленно, однако эта реакция может катализироваться глутаредоксином.

В процессе редокс-сигналинга важными условиями модификаций белков,

индуцированных пероксидом водорода, является их обратимость, а также контроль над процессом обратного восстановления сульфената или сульфината до тиола. Все вышеописанные модификации, кроме образования сульфоновой кислоты, являются обратимыми in vivo, поскольку существуют системы, контролирующие восстановление продуктов. В большинстве случаев такие модификации обратимы благодар реакции тиол-дисульфидного обмена с участием восстановленной формы глутатиона или тиоредоксина. Таким образом, редокс-статус пар Trx(SH)2/TrxSS и GSH/GSSG является важным фактором, влияющим на модификации. Восстановление сульфинатов белков опосредовано сестринами и сульфиридоксином. Процесс является АТP-зависимым и, следовательно, связанным с энергетическим статусом клетки. Итак, Н2О2 может модифицировать белки несколькими способами и таким путем изменять их функции. Вид, степень и продолжительность модификации тиольных групп белков зависит от значения их рКа и от их доступности, а также от энергетического и редокс-статуса клетки, в особенности от редокс-пар Trx(SH)2/TrxSSи GSH/GSSG.

КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ СИГНАЛА ЗА СЧЕТ КИНЕТИЧЕСКИХ И

ДИФФУЗИОННЫХ ОГРАНИЧЕНИЙ.

При физиологических значениях pH и достижимой внутри клеток концентрации H2O2 константа скорости реакции окисления остатков цистеина в активном центре фосфатазы PTP-1B в концентрации 0.1 мкM составляет 20 M–1с–1, для фосфатазы Cdc25B(cell cycle–activating phosphatase 25B) с тем же значением концентрации – в несколько раз больше –160 M–1с–1. Для GSH в концентрации 2 мM эта величина составляет 0.89 M–1 с–1. Все представители семейства передоксинов (Prx1 – Prx6) характеризуются исключительно высокой скоростью реакции с Н2О2. Для Prx2 эта константа равна 2 × 107 M–1 с–1, и, поскольку Prx2находится в

клетке в избытке (~20 мкМ), то способен вступать в реакцию практически со всем произведенным в ней Н2О2. GSH конкурирует лишь за незначительную часть Н2О2, а SH-группы остатков цистеинов протеинтирозинфосфатаз не конкурентоспособны даже для GSH. Таким образом, только низкое значение pKa тиольных групп остатков цистеина не обеспечивает их высокую реакционную способность. Даже учитывая то, что РТР и другие

белки с существенными остатками Cys являются мишенями Н2О2 в ходе сигналинга, они не конкурентоспособны для белков-антиоксидантов с точки зрения кинетики. Подобный анализ кинетики реакций предполагает, что все они осуществляются в гомогенном растворе, с неограниченной диффузией субстратов и ферментов. Однако существует механизм, который позволяет менее реакционноспособным субстратам взаимодействовать с Н2О2

в присутствии более конкурентоспособных участников. Такой механизм основан на высокой степени неоднородности реакционной смеси (в данном случае –цитоплазмы клетки). Если Н2О2 может сначала полностью окислить высоко реакционноспособную мишень в ограниченной области клетки, то далее он способен прореагировать здесь же с менее реакционноспособным субстратом, например с фосфатазой. Этот принцип является основой гипотезы «шлюза» («floodgate»). Согласно этой гипотезе, при высокой концентрации Н2О2происходит переокисление цистеина в активном центре Prx с образованием сульфиновой кислоты (уравнение 4), и, как следствие, его инактивация. Благодаря этому Н2О2 получает возможность далее взаимодействовать с другими своими белками-мишенями. Реакция восстановления Prx после переокисления – энергетически зависима и

катализируется ферментом сульфиредоксином. В основу гипотезы «шлюза» положено предположение о том, что низкие концентрации Н2О2 эффективно нейтрализуются Prx, а высокие концентрации Н2О2 приводят к локальной инактивации пероксиредоксинов, что способствует далее окислению сигнальных белков-мишеней.

Согласно этой гипотезе, диффузионное расстояние, т.е. расстояние, которое окислитель преодолевает до взаимодействия с мишенью, должно быть относительно небольшим по сравнению с диаметром клетки (в среднем 10–20 мкм). Восстановленный глутатион в концентрации, соответствующей внутриклеточной, не способен ограничить диффузию Н2О2 в пределах диаметра клетки. Присутствие же большого количества высоко реакционноспособных пероксиредоксинов является достаточным условием для ограничения диффузии Н2О2 в пределах нескольких микрон. Поэтому для эффективного окисления белка-мишени необходимо его прямое взаимодействие с комплексом, продуцирующим Н2О2. Возможностью повысить вероятность прохождения реакции между Н2О2 и его мишенью является локализация белка-мишени и источника Н2О2(Nox) в пределах одного клеточного компартмента.

3. Источники активных форм кислорода в организме человека.

Главным источником АФК в организме человека и животных служат клетки-фагоциты: гранулоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы.Мембраны фагоцитов содержат ферментативный комплекс (НАДФН-оксидазу), который окисляет НАДФН до НАДФ+ за счет восстановления О2 до супероксидного радикала: НАДФН + 2O2 > НАДФ+ + 2 * – O 2 В фагоцитах комплекс НАДФН-оксидаза обеспечивает «окислительный взрыв» — быстрое избыточное образование – O 2 в ходе стимуляции неспецифической защиты организма для разрушения бактерий.

Фагоцит выделяет в окружающую сре-ду АФК и ряд ферментов, среди которых миелопероксидаза катализирует реакцию образования гипохлорита из аниона хлора и перекиси водорода. Кроме того, в присутствии ионов железа происходит образование * ОН радикала из перекиси водорода и гипохлорита. Активированные фагоциты для борьбы с чужеродными клетками образуют ряд АФК, которые при взаимодействии друг с другом и с другими молекулами образуют также синглетный кислород О2.

АФК генерируются в ходе различных процессов в организме. О2 образуется и в реакциях фотоокисления в присутствии фотосенсибилизаторов: флавины, гематопорфирин и др., а также при дисмутации супероксидных радикалов. В присутствии металлов с переменной валентностью эти продукты запускают цепные реакции окислительной деградации биомолекул с образованием липидных радикалов, пероксилов и гидропероксидов. АФК вызывает также окисление нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК и белков.

Электрон - транспортная цепь митохондрий служит важным источником АФК. Эта последовательность ферментов, объединенных в четыре крупных комплекса, осуществляет перенос электронов от NADPH к кислороду, восстанавливая его до воды. Белки цепи содержат кофакторы,

способные окисляться и восстанавливаться.

NADPH - оксидазы.Практически все клетки млекопитающих содержат ферментативные комплексы NADPH&оксидаз (NOX), единственная функция которых – образование супероксиданиона. Комплексы NOX производят путем переноса электрона с внутриклеточного NADPH на внеклеточный кислород. Электрон при этом пересекает мембрану, поэтому накапливается вне клетки.

4. Антиоксидантная система: ферменты, белки и небелковые антиоксиданты.

Деградация Н2О2.

Как и большинство АФК, пероксид водородатоксичен для клеток, и

поэтому его концентрация in vivoстрого регулируется. Множество ферментативных и неферментативных антиоксидантных систем внутри клетки защищают ее от токсичного действия Н2О2. Многие ферментативные антиоксидантные системы также принимают участие в сигнальных путях, контролируя и регулируя передачу сигнала. Основные белки, участвующие

в деградации Н2О2 –это каталазы, пероксиредоксины и глутатионпероксидазы.

Каталазы –это гемсодержащие ферменты, которые разлагают Н2О2непосредственно до воды и кислорода (уравнение 10):

2H2O2 - 2H2O + O2(10)

Каталазы есть у большинства аэробных клеток. Эти ферменты вносят значительный вклад в деградацию Н2О2, защищая организм от окислительного стресса, а также ограничивают участие Н2О2в сигналинге. В эукариотических клетках каталазы локализуются в пероксисомах и считаются ключевыми ферментами, осуществляющими элиминацию «нежелательных» АФК. Величина Кm каталазы по пероксиду водорода имеет миллимолярную размерность. Поэтому этот фермент эффективен при деградации высоких концентраций оксиданта.

Пероксиредоксины (далее Prx) – это семейство белков, катализирующих восстановление Н2О2 и алкилгидропероксидов до воды и спирта. Для этого процесса пероксиредоксины используют восстанавливающие эквиваленты, предоставляемые тиоредоксином, тиоредоксинредуктазой (TR) и NADPH(уравнение 11):

По строению активного центра выделяют три группы пероксиредоксинов: типичные 2Cys-Prx, атипичные 2Cys-Prx и 1Cys-Prx. Выделяемые таким образом группы различаются количеством и консервативностью расположения цистеиновых остатков. У млекопитающих, как и у большинства эукариот, представители типичных 2Cys-Prx взаимодействуют с Н2О2 с образованием сульфеновой кислоты, которая затем быстро преобразуется в внутрицепочечный дисульфид. Иногда в присутствии Н2О2 сульфеновая кислота взаимодействует со второй молекулой Н2О2 и окисляется до сульфиновой кислоты, что таким образом инактивирует фермент. Участие пероксиредоксинов в регуляции концентрации Н2О2 позволяет предположить, что переокисление может служить важным механизмом, благодаря которому в некоторых случаях Н2О2 имеет возможность избежать деградации и принять участие в сигнальных каскадах. В дальнейшем, роль этого механизма в редокс-сигналинге была подтверждена благодаря открытию сульфиредоксинов и сестринов, способных восстанавливать сульфиновую кислоту пероксиредоксинов до тиола. Кроме того, экспрессия генов этих белков

регулируется в ответ на окислительный стресс. Пероксиредоксины локализуются почти во всех компартментах эукариотических клеток. Физиологический диапазон концентраций пероксида водорода, с которыми способны справиться пероксиредоксины составляет 1-10 мкM. Превышение этих концентраций вызывает переокисление и инактивацию пероксиредоксинов, что может иметь и защитную функцию. Дело в том, что восстановление пероксиредоксинов требует постоянного расхода NADPH. При окислительном стрессе пероксиредоксины становятся основным субстратом для тиоредоксина, быстро истощая пул NADPH. Переокисленный пероксиредоксин перестает быть субстратом тиоредоксина. Клетка перестает тратить NADPH на борьбу с оксидантом, сохраняя ценный субстрат для восстановления других белков, так в борьбе с пероксидом водорода подключается каталаза, имеющая высокое сродство к пероксиду и использующая одну молекулу Н2О2 для восстановления другой.

Глутатионпероксидазы, которые совмещают процесс восстановления Н2О2 до воды с окислением глутатиона до глутатиондисульфида (уравнение 12):

H2O2+ 2GSH - GSSG + 2H2O (12)

Это пероксидазы, многие из которых содержат в активном центре остаток

селеноцистеина, составляют группу, имеющую как минимум четыре изоформы. Глутатионпероксидазы широко представлены в тканях животных, а также в некоторых водорослях и грибах, но отсутствуют у высших растений и бактерий. Глутатионпероксидазы специфичны к глутатиону как к электрон-донору и могут взаимодействовать с другими пероксидами. Как представители ферментов, деградирующих Н2О2, глутатионпероксидазы

контролируют сигналинг, опосредованный Н2О2, а также могут осуществлять редокс-сигналинг путем окисления глутатиона, который далее модифицирует белки через реакцию тиол-дисульфидного обмена.