u_manual

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток, имеющих высокую хлебопекарную активность. Использование метода флотирования обеспечивает надежность непрерывного выделения дрожжей из культуральной жидкости, сокращает число сепараторов и, соответственно, эксплутационные расходы.

Фильтрация. В этом методе используется принцип задержки биомассы на пористой фильтрующей перегородке. В настоящее время используются разные фильтры: барабанные, дисковые, ленточные, тарелочные, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы различной конструкции, мембранные фильтры. Диаметр пор может превышать размеры клеток, однако при этом эффективность фильтрации практически не снижается, так как по мере прохождения жидкости диаметр капиллярных каналов сужается из-за прилипания частиц к стенкам. По мере утолщения слоя биомассы на фильтре скорость протока жидкости падает. Для фильтров непрерывного действия, рассчитанных на длительное действие, предусматривают системы автоматического удаления слоя биомассы, забивающего поры. Биомассу сдувают с поверхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. Такой способ удаления биомассы характерен для барабанного вакуум-фильтра.

Существуют также фильтры, предназначенные для однократного или многократного периодического использования. Среди них выделяют мембранные фильтры, через которые возможно проводить фильтрацию очень разбавленных растворов. Однако проблемой использования таких фильтров является их закупорка клетками, белками, коллоидными частицами. Приемы сдувания или срезания для этих фильтров не приемлемы, так как они быстро разрушаются. Одним из путей преодоления этих проблем является покрытие мембран гидрофильным слоем. В настоящее время создана целая отрасль по производству мембранных фильтров и существуют огромное количество фирм, которые поставляют фильтры для всех задач биотехнологии.

Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды, зависят от природы продуцента. Например, дрожжи рода Candida, служащие источником кормового белка, плохо флотируются и фильтруются. Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются, причем в несколько ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному приему прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов и удобрений. Конечный продукт удается получить в активной форме (от выделения его из культуральной жидкости отказались в принципе): содержимое реактора выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих жизнеспособность конечного продукта.

Физическое осаждение. При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осажда-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

281

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

ется добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно.

Центрифугирование. Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость. Центрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем вышеперечисленные методы сепарации. Поэтому оно оправдывает себя, если, во-первых, суспензия фильтруется медленно, вовторых, необходимо максимально освободить культуральную жидкость от частиц, в-третьих, необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодический режим. Центрифугирование и фильтрация могут проходить одновременно, этот процесс реализован в фильтрационных центрифугах. Наиболее перспективны для осаждения – центрифуги-сепараторы, в которых биомасса осаждается на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой вставки.

Если продукт содержится в культуральной жидкости, то эта жидкость далее подвергается переработке. В производствах, где целевым продуктом являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных вод. Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.

6.1.3. Методыразрушенияклеток

Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы.

К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замора- живание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким снижением давления). Физические способы разрушения клеток более экономичные, чем химические и химико-ферментативные. В то же время этим способам дезинтеграции клеток присуща неизбирательность: обработка может влиять на качество получаемого продукта.

Химические и химико-ферментативные методы более избирательны.

Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Клетки грамотрицательных бактерий обрабатывают лизоцимом в присутствии этилендиаминтерауксусной кислоты или других детергентов,

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

282

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

клетки дрожжей – зимолиазой улитки или ферментами грибов, актиномицетов. Можно использовать автолиз клеток при лимитировании по определенному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагом.

За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточных стенок. Для этого используют те же методы фильтрации и центрифугирования. Однако применяют более высокоскоростное центрифугирование или фильтры с меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессов клеточные стенки отбрасывают как балласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта.

6.1.4. Отделениеиочисткапродукта

Выделение целевого продукта из культуральной жидкость или из гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или адсорбции.

Осаждение может быть физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических веществ). Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50 %-й этанол осаждает 80 % протеазы и 3-5 % амилазы, 70 %-й спирт осаждает 98 % амилазы.

Высаливание – механизм тот же, что и при действии органических веществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.

Экстракция – процесс избирательного извлечения одного или нескольких растворимых компонентов из твердых тел и растворов с помощью жидкого растворителя – экстрагента. Различают твердо-жидкостную и жид- ко-жидкостную типы экстракции. При твердо-жидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидко-жидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Жидко-жидкостную экстракцию органическими растворителями часто применяют для извлечения из культуральной среды антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов. Витамин В12 экстрагируют фенолом, высокоспецифичным экстрагентом является бензиловый спирт. Такие фосфолипиды как фосфатидилэтанол и фосфатидилхолин извлекаются хлороформом.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

283

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

Эффективность экстракции может быть повышена за счет повторной экстракции свежим экстрагентом, выбором оптимального растворителя, нагреванием экстрагирующего агента или экстрагируемой жидкости, понижением давления в аппарате для экстракции. Экстракция хлороформом используется при выделении из бактериальной биомассы полигидроксиалканоатов (ПГА). Существует несколько подходов для извлечения ПГА из клеток. Сырую биомассу, собранную центрифугированием, заливают 20 объемами хлороформа и оставляют на 15–20 ч в ёмкости при комнатной температуре при периодическом перемешивании. Далее разделяют биомассу и хлороформ с полимером в делительной воронке, нижний слой хлороформа собирают, а остаток биомассы еще трижды экстрагируют хлороформом для усиления полноты экстракции. Второй подход, используемый в лабораторных условиях: предварительно лиофилизированная биомасса закладывается в патрон аппарата «Сокслет» и полимер экстрагируется хлороформом в течение нескольких часов. В колбу заливается экстрагент, обычно органический растворитель. При нагревании колбы растворитель испаряется, его пары поднимаются вверх, конденсируются на холодильнике, и растворитель попадает в патрон с пробой. После заполнения патрона до определенного объема растворитель с экстрагируемым веществом сливается в колбу, и процесс многократно повторяется.

Во многих случаях процесс нагревания может быть губительным для целевого продукта. Для предотвращения этого используется криоэкстракция, которая осуществляется растворителями, кипящими при низких температурах и находящимися при комнатной температуре в газообразном состоянии. Для экстракции неполярных соединений используют жидкий пропан или бутан. При последующем осторожном нагревании до 0 °С растворитель улетучивается, и остается продукт в чистом виде.

Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент – твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: катионит – карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); анионит – диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму.

6.1.5. Методытонкойочистки иразделенияпрепаратов

Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами. Наибольшее распространение получила хроматография. Хроматография (от греч. chroma, родительный падеж chromatos – цвет, краска и -графия) – фи- зико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. По технике выполнения хрома-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

284

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

тографию подразделяют на колоночную, когда разделение веществ проводится в специальных колонках, и плоскостную: тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии разделение проводится в тонком слое сорбента, в бумажной – на специальной бумаге.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее простых и эффективных экспресс-методов разделения и анализа веществ, не требующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10–20 мкг вещества с точностью до 5–7 %. В зависимости от природы подвижной фазы (ПФ), тонкослойная хроматография может быть адсорбционной и распределительной. Наиболее широко применим в ТСХ первый вариант разделения.

Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, силикагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку, закрепляется слой с помощью крахмала или гипса (иногда используют пластинки с незакрепленным слоем). Для хроматографирования могут использоваться готовые пластинки, выпускаемые промышленностью, размером 5х15 или 20х20 см. На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца наносят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3–5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит растворитель (ПФ) в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.

Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Например, разделение хлорорганических пестицидов на пластинке с силикагелем проводят в среде гексана. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хроматографировании аминокислот используют смесь н-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов – водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН. При хроматографировании растворитель движется снизу вверх (восходящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. После окончания хроматографического процесса пластинку вынимают из камеры, отмечают линию фронта растворителя (обычно около 10 см) и высушивают.

Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине после разделения. Неокрашенные соединения обнаруживают различными способами. Если пластину поместить в камеру с парами йода, то четко проявляются коричневые пятна для органических соединений с непредельными связями. Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее каким-либо реагентом, дающим с компонентами пробы окрашенные соединения. В состав нанесенного слоя в готовые пластины часто вводят люминофор. При облучении такой пластины ультрафиолетовым (УФ) светом она флуоресцирует, а разделенные компоненты пробы видны в виде темных пятен. Вещества, имеющие

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

285

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

собственную флуоресценцию, также обнаруживают в УФ-свете (например, пестициды).

Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по характеру окраски пятен, параметру удерживания Rf и с помощью стандартных веществ (свидетелей). Величина Rf рассчитывается из экспериментальных данных по уравнению

Rf = а/б,

(6.1)

где а – расстояние от стартовой линии до центра пятна; б – расстояние, пройденное за это же время растворителем.

При стандартных условиях величина Rf является постоянной величиной, характерной для данного соединения. Но практика показывает, насколько трудно создавать постоянство всех факторов, от которых зависит воспроизводимость значений Rf. На величину Rf влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю. Поэтому наряду с величиной Rf идентификацию проводят по «свидетелю». Стандартное вещество (свидетель), наличие которого предполагают в анализируемой смеси, наносят на линию стандарта рядом с исследуемой пробой. Таким образом, стандартное вещество хроматографируется в тех же условиях. После хроматографирования и детекции пятен сравнивают величины Rf определяемого вещества и «свидетеля». Количественное определение в ТХС может быть проведено непосредственно на пластинке или после удаления веществ с пластинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным способом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества.

Широкое распространение получил способ экстрагирования компонентов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. После получения хроматограммы производят ее обработку, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование подходящим растворителем. Полученный раствор анализируют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

286

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

Рис. 6.1. ТСХ липидов музейного штамма Botryococcus braunii Kutz No LB 807/1 Droop 1950 H-252 (слева) и изолята Botryococcus озера Шира (справа). Система растворителей: гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (85:15:1 по объему). С – стандарт, 0 – начало роста, I – 6 суток, II – 13 суток, III – 24 сутки, IV – 38 сутки. 1 – полярные липиды, 2 – диациглицерины, 3 – стерины, 4 – свободные жирные кислоты, 6 – триацилглицерины, 7 – МЭЖК в стандарте, 8 – эфиры стеринов, 9 – углеводороды,

X и Х1 – неидентифицированные фракции [3, 22]

В качестве иллюстрации метода приведена тонкослойная хроматограмма липидов углеводородсинтезирующих штаммов Botryococcus braunii Kutz, иллюстрирующая изменения состава липидов в процессе роста водоросли и изолята озера Шира (рис. 6.1).

Хроматография на бумаге. По механизму разделения различают распределительную, адсорбционную, осадочную и другие виды бумажной хроматографии (БХ). В распределительной жидкость-жидкостной хроматографии бумага, приготовленная из специальных сортов хлопка, выполняет роль носителя неподвижной жидкой фазы (НФ), в качестве которой часто выступает вода, адсорбированная парами бумаги. В таком случае гидрофильная бумага используется для нормально-фазовой хроматографии.

Растворителями – подвижной фазой (ПФ) - являются спирты (метанол, этанол, н-пропанол, бутанол), простые эфиры (этиловый, метиловый), кетоны (ацетон, ацетил-ацетон), эфиры органических кислот (метилацетат, этилацетат), пиридин, хлороформ. Чаще используются смеси растворителей. Для разделения некоторых органических веществ используют метод обращенных фаз.

В этом методе для придания бумаге гидрофобного характера ее импрегнируют (пропитывают) нафталином, парафином, раствором каучука, силиконом и др. Такая бумага служит носителем для неполярных растворителей в качестве НФ. В качестве ПФ применяют смеси кислот с низшими спиртами. Обращенно-фазовая бумажная хроматография используется, например, для разделения и идентификации полиненасыщенных жирных кислот при

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

287

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

изучении состава липидов, выделенных из животных и растительных тканей. Бумагу пропитывают 5 %-м раствором силикона, в качестве ПФ используют 85 %-й раствор уксусной кислоты. Разделение веществ в распределительной БХ осуществляется благодаря различию в скоростях движения компонентов при многократном повторении актов экстракции и сорбции. Скорость перемещения компонентов зависит от их коэффициентов распределения (как и в методе экстракции).

По направлению движения элюента (ПФ) различают восходящую, нисходящую и радиальную (круговую) хроматографию. Если элюент движется по бумаге вверх, метод называют восходящей бумажной хроматографией; при его движении сверху вниз – нисходящей бумажной хроматографией. Очень быстро можно осуществить хроматографический анализ методом радиальной бумажной хроматографии, в котором используется бумажный круг с фитилем, опущенным в элюент. Иногда при сложном составе пробы не удается разделить ее компоненты с помощью одного растворителя. Тогда применяют двумерную хроматографию. В угол квадратного листа хроматографической бумаги наносят раствор пробы и хроматографируют сначала в одном элюенте, затем, повернув хроматограмму на 90 град, – в другом. Первый элюент производит предварительное разделение компонентов пробы, второй

– окончательное.

Для проведения хроматографии на бумаге используют стеклянные герметизированные камеры. Внутри камеры в верхней (нисходящий вариант) или нижней ее части (восходящий вариант) помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Радиальную хроматографию можно осуществить в чашке Петри. Детекцию зон, идентификацию и количественное определение в БХ проводят так же, как и в методе тонкослойной хроматографии. Методом распределительной жидкостной бумажной хроматографии успешно анализируют смеси катионов в неорганическом качественном анализе, смеси аминокислот и других органических кислот, пептидов, пестицидов, фенолов, красителей, синтетических поверхностно-активных веществ.

Колоночная хроматография. В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями. В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые, можно делить продукты согласно их заряду (ионообменная хроматография), гидрофобности (гидрофобная хроматография), размеру (хроматография гель-фильтрацией) или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография).

Ионообменная хроматография. Ионообменная хроматография (ИХ) является разновидностью жидкостной хроматографии и в аппаратурном оформлении ничем не отличается от других видов жидкостной колоночной хроматографии.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

288

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1.Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

Воснове ионообменной хроматографии лежит процесс обмена между ионами анализируемого раствора (ПФ) и подвижными ионами того же знака ионообменника (НФ) (рис. 6.2).

Разделяемая смесь

Смесь с выче-

том адсорбированных ионов

а

б

Рис. 6.2. Катионообменная хроматография (схематизировано: изображено поверхностное электростатическое взаимодействие с частицами): а, б – две стадии процесса

В качестве ионообменников или ионитов обычно используют синтетические полимерные вещества, называемые ионообменными смолами. Они состоят из матрицы и активных групп, содержащих подвижные ионы. В зависимости от знака обмениваемых ионов различают катиониты и аниониты. Катиониты содержат кислотные группы различной силы, такие как сульфогруппы, карбоксильные, оксифенильные. Аниониты имеют в своем составе основные группы, например алифатические или ароматические аминогруппы различной степени замещенности (вплоть до четвертичных). Иониты могут находиться в Н-форме и ОН-форме, а также в солевой форме. В Н-форме катиониты и ОН-форме аниониты содержат способные к обмену ионы водорода и гидроксила соответственно, в солевых формах ионы водорода заменены катионами металла, анионы гидроксила – анионами кислот. В зависимости от силы кислотных и основных групп в ионитах различают сильнокислотные (R-SO3Н) и с лабокислотные (R-СООН) катиониты; сильноосновные (R-N(СН3)3ОН) и слабоосновные (R-NН3ОН). Сильнокислотные и сильноосновные иониты способны к ионному обмену в широком диапазоне рН.

Процесс ионного обмена протекает стехиометрично. Например: R-SO3H + Na+ = R-SO3Na + H+

R(NН3)3ОН + Сl- = R(NН3)3Сl + ОН-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

289

ГЛАВА 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ

6.1. Методы выделения и очистки клеточных макромолекул для получения целевого биотехнологического продукта

Это ионообменное равновесие характеризуется константой ионного обмена:

[H+][RSO

Na]

[OH−][R(NH

3

) Cl]

KH+Na+ =

+

3

;

KH+Na+ =

−

3

.

(6.2)

[Na

][RSO3H]

[Cl

][R(NH3)3OH]

На основании констант ионного обмена построены ряды сродства ионов к данному иониту, позволяющие предвидеть возможности ионообменных разделений. В зависимости от сродства к фиксированным ионам неподвижной фазы разделяемые ионы перемещаются вдоль хроматографической колонки с различными скоростями; чем выше сродство, тем больше объем удерживания компонента. При разделении органических кислот и оснований важную роль играет степень их диссоциации. Для двух веществ, имеющих разные константы обмена, рассчитывают фактор разделения или коэффициент распределения, который характеризует селективность ионита:

fа/ b= KA/KB,

(6.3)

где fa/b – фактор разделения; KA, KB – константы ионного обмена веществ А и В. Чем больше фактор разделения, тем сильнее ионит удерживает вещество А. Например, константы ионного обмена солей железа (III) и кобальта (II) на сильнокислотном катионите марки КУ-2 составляют 3726 и 286 соответственно, тогда fFe3/Co2+ = 13. Таким образом, можно сделать вывод о том, что катионит КУ-2 более селективен к ионам железа (III).

Важной количественной характеристикой ионитов является их обменная емкость. Полная обменная емкость определяется количеством эквивалентов ионов, обмениваемых одним граммом сухого ионита. Чем больше обменная емкость, тем большую пробу можно ввести в колонку с ионитом. При подготовке ионитов к работе их переводят в соответствующую форму. Так, для перевода катионита в Н-форму через колонку с набухшим ионитом пропускают раствор сильной кислоты, избыток которой отмывают водой. Затем медленно пропускают раствор смеси ионов. Каждый катион задерживается на ионите согласно своей сорбируемости. Далее пропускают подходящий элюент. Например, катионы щелочных металлов легко элюируются 0,1 М HCl. При этом ионы водорода обмениваются на сорбированные катионы, которые вместе с раствором выходят из колонки в соответствии с константами ионного обмена. На выходе из колонки фракции собирают в отдельные сосуды и определяют содержание любым подходящим методом.

Иониты применяются для деионизации (обессоливания) воды, очистки сахарных сиропов от минеральных солей; в препаративной химии – для концентрирования растворов; для определения ионов железа (III), меди и свинца в вине; кальция и магния в молоке; различных металлов в биологических жидкостях. Кроме того, ионный обмен используют для перевода ионов в форму, удобную для количественного определения. Ионообменную хроматографию применяют для разделения фенолов, карбоновых кислот, аминокислот, аминосахаров, пуриновых, пиримидиновых и других оснований. Часто

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

290