стоматИностр2012 / Модуль1РУС / Практическая работа №13

Методическая разработка

по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии

Автор: Т.Ю. Крушинская Утверждено на заседании кафедры

"___" _______________ 200__г.,

протокол №_______

Тема: СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ (II занятие)

Актуальность темы. Постановка основной серологической реакции (РА), которая изучалась на прошлом занятии, возможна только с корпускулярным антигеном, которым выступает целая микробная клетка. Однако антигенные свойства могут иметь отдельные компоненты микробной клетки, которые высвобождаются при ее лизисе, синтезированные бактериями токсины, протеины вирусных частиц и животных тканей. Эти растворимые антигены (и антитела к ним) могут быть выявлены в реакциях преципитации (РП) или связывание комплемента (РСК); выявление микробных токсинов возможное также в реакции нейтрализации (РН). По современным оценкам ВООЗ реакция связывания комплемента остается в числе достоверных и чувствительных методов определения как антигенов, так и антител. Существует много модификаций РСК: в геле, в микрообъеме, на холоде, с использованием различных эритроцитов. РП применяется не только для диагностики инфекционных болезней, а и с целью установления видовой принадлежности животных белков - для определения доброкачественности пищевых продуктов и в судебной медицине. Реакция иммобилизации применяется не так часто, но она является чувствительным и надежным методом в диагностике болезней, вызванных подвижными микроорганизмами (холера, спирохетозы).

Изучение форм иммунного ответа и его механизмов необходимо для понимания нормальных и патологических реакций организма человека на вещества, которые несут признака генетической чужеродности, что происходит при инфекционных, аллергических и онкологических заболеваниях, при трансплантации и вакцинации.

Цель (общая): уметь трактовать основные механизмы формирования иммунного ответа организма человека; ставить реакции преципитации и связывание комплемента для диагностики инфекционных заболеваний для использования этих знаний-умений в комплексе диагностических мероприятий на следующих кафедрах.

Конкретные цели - уметь:

1. Трактовать механизмы первичного и вторичного иммунного ответа.

2. Объяснять природу иммунологической толерантности.

3. Объяснять средства кооперации иммунокомпетентных клеток и регуляции иммунного ответа.

4. Ставить реакцию кольцепреципитации для выявления микробных антигенов.

5. Интерпретировать результаты реакций двойной иммунной диффузии, нейтрализации токсинов, иммобилизации микроорганизмов.

6. Ставить реакцию связывания комплемента с целью серодиагностики инфекционного заболевания

Исходный уровень знаний – умений:

1. Объяснять свойства настоящих и коллоидных растворов (кафедра химии)

2. Трактовать структуру сложных белков (кафедра биохимии)

3. Готовить серийные разведения растворов (кафедра биохимии)

4. Объяснять сущность гуморальной регуляции физиологических процессов (кафедра физиологии)

5. Объяснять морфологические особенности и функции макрофагов и лимфоцитов (кафедра гистологии)

Для того, чтобы вы могли уяснить, отвечает ли выходной уровень Ваших знаний-умений необходимому, предлагаем выполнить несколько задач:

Задача 1. Серологические реакции, как правило, идут в присутствии электролитов. Что будет происходить с коллоидной системой, если полностью изъять из нее все присутствующие там электролиты?

Задача 2. По химической природе антитела являются сложными белками. Укажите основную структурную особенность сложных белков: а)имеют большую молекулярную массу; б)имеют разветвленную структуру молекулы; в)состоят из нескольких полипептидных цепочек; г)содержат определенную группу небелковой природы; д)имеют в своем составе L и D формы аминокислот.

Задача 3. Для проведения серологической реакции были приготовлены серийные разведения сыворотки больного от 1:100 до 1:800. Сколько нативной сыворотки содержится в разведении 1: 200, если общий объем жидкости в пробирке составляет 1 мл?

Задача 4. Что выступает носителем информации при гуморальной регуляции физиологических процессов: а) биологически-активное вещество; б) поверхностные рецепторы клеток; в) нервный импульс; г) раствор электролита

Задача 5. Какие клетки обеспечивают защиту организма от инфекций, но не способны к фагоцитозу? а) нейтрофилы; б)лимфоциты; в) ретикулоциты лимфоузлов; г)клетки нейроглии; д) эндотелиальные клетки сосудов; е)Купферовские клетки печени. Которые из указанных клеток вообще не связаны с иммунологической реактивностью?

Информацию для пополнения знаний-умений можно найти в следующих учебниках:

1.Равич-Щербо М.И., Новиков В.В. Физическая и коллоидная химия. М.: Высшая школа.- 1975.

2.Березов Т.Т., Коровкин В.Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина.- 1998.

3.Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. Гистология, цитология и эмбриология.- М.: Медицина.- 1999.

4. Филимонов В.И. Нормальная физиология.- Киев: Здоровье.- 1994.

Теоретические вопросы, на основе которых возможное выполнение целевых видов деятельности:

1. Взаимодействие трех видов иммунокомпетентных клеток при первичном иммунном ответе.

2. Механизм вторичного иммунного ответа. Клетки иммунологической памяти.

3. Качественные и количественные отличия первичного и вторичного иммунных ответов.

4. Понятие об иммунологической толерантности. Врожденная и приобретенная толерантность.

5. Регуляция иммунного ответа. Понятие о медиаторах иммунной системы.

6. Механизм и сфера применения реакции преципитации.

7. Механизм РСК.

8. Сущность и особенности постановки реакций иммобилизации микроорганизмов и нейтрализации токсинов.

Литература для усвоения знаний-умений по данной теме:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. Л.Б.Борисова, А.М.Смирновой. М.: Медицина,1994. С. 196-200, 235-237, 238.

2. Творко М.С. Иммунология.-Тернополь: Укрмедкнига, 1999.-142 с.

3. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. /Под ред. Л.Б.Борисова. М.: Медицина, 1984. С. 112-122.

4.Ройт А. Основы иммунологии.- М.: Мир, 1991.

5. Вейсман И.Л. и др. Введение в иммунологию.- М.: Высшая школа, 1983. -160с.

6.Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования/ под ред.М.О.Биргера.- М.: Медицина, 1982.- с. 141-153.

Ориентировочная основа действия при выполнении практической работы.

1.Выявить возбудитель менингита в ликворе с помощью реакции кольцепреципитации.

1)В узкие пробирки внести по 0,2- 0,3 мл преципитирующий менингококковой сыворотки.

2)По стенке пробирки наслоить 0,1-0,2 мл раствора антигена - исследуемого ликвора, в котором менингококки легко подвергаются аутолизу, распадаясь на отдельные антигены. Обратить внимание на то, чтобы сыворотка и раствор антигена не смешивались

3)Реакцию учитывают через 1-3 мин. по появлению преципитата в виде белого кольца. Результат занести в протокол.

2. Определить токсигенность выделенного штамма возбудителя дифтерии. (Определение токсигенности проводится по демонстрационным образцам. При работе с патогенными культурами нужно четко придерживаться правил безопасности.)

1)На слой агара в чашке Петри поместить полоску фильтровальной бумаги, смоченную антитоксической сывороткой, антитела которой диффундируют в гель.

2)На некотором расстоянии от полоски бумаги подсеять исследуемые штаммы C.dіphtherіae и контрольные штаммы, которые выделяют в среду экзотоксин.

3)Результат учитывают через несколько суток по появлению дуг преципитата в месте встречи токсина (антиген) с антитоксином (антитела).

4)Схематично отобразить в протоколе результат опыта, сделать вывод о токсигенности выделенных штаммов.

3.Поставить РСК с целью серологической диагностики.

1)Определить титр и рабочую дозу комплемента: приготовить разведение свежей сыворотки морской свинки от 1:10 до 1:40. К 0,2 мл каждого разведения комплемента прибавить по 0,4 мл гемолитической системы. Инкубировать при 37⁰ С. Через 30 мин. определить титр комплемента - наибольшее его разведения, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочую дозу комплемента определяют на 25% больше титра.

2) Основной опыт проводят по схеме:

реактивы	основной опыт	контроль антигена	контроль сыворотки
первая фаза
сыворотка больного	0,25мл	-	0,25мл
антиген	0,25мл	0,25мл	-
комплемент	0,25мл	0,25мл	0,25мл
физиологический раствор	-	0,25мл	0,25мл
термостат, 37^0С, 30 мин.
вторая фаза
гемолитическая система	0,5мл	0,5мл	0,5мл
термостат, 37^0С, 45 мин.

Для постановки основного опыта сыворотки больных и контрольную сыворотку инактивируют нагреванием на протяжении 30 мин. при 56⁰С.

3)В исследуемой пробирке смешивают по 0,25 мл сыворотки больного, раствора антигена и комплемента в рабочей дозе; ставят также контроль сыворотки (вместо антигена - 0,25 мл физ. р-ра) и контроль антигена (вместо сыворотки - 0,25 мл физ. р-ра).Пробирки выдерживают в термостате 30 мин.

4) В каждую пробирку прибавить по 0,5 мл гемолитической системы и выдержать в термостате 45 мин. Учет результатов: ++++ - отсутствие гемолиза, +++ -гемолиз 25%, ++ -50%, + - 75%, полный гемолиз эритроцитов - отрицательная реакция (-).

4. Ознакомиться по таблицам с методикой постановки и учета реакции нейтрализации (РН) микробных токсинов; выбрать из предложенного набора биопрепаратов те, что могут быть использованы в этой реакции. В протоколе отметить, какой патологический материал исследуют в РН, какие биологические объекты при этом используются, какие изменения в них происходят.

5. Ознакомиться по таблицам с методикой постановки реакции иммобилизации микроорганизмов. В протоколе отметить, какие диагностические биопрепараты необходимые для выявления бактерий и для выявления антител в этой реакции, какое оборудование используется для ее учета, как отображается положительный и отрицательный результат.

После ознакомления с теоретическими вопросами и ходом проведения эксперимента вам предлагается выполнить следующие учебные задачи.

1. В лабораторию судебно-медицинской экспертизы доставлена одежда гражданина Н., который пропал без вести. На одежде заметны бурые пятна, напоминающие следы крови. Какую реакцию можно использовать для подтверждения этого предположения? Какой результат будет наблюдаться, если предположение подтвердится?

2. При добавлении гемолитической (индикаторной) системы в пробирки, где содержится смесь сыворотки больного с бактериальным диагностикумом (основная система), в них произошел гемолиз. О какой реакции речь идет в данном случае?

3. При постановке РСК в пробирке с исследуемой сывороткой больного в системе образовался комплекс "антиген + антитело + комплемент", но внешний вид раствора не изменился. Каким образом можно выявить этот комплекс?

4. При постановке РСК с сывороткой больного с подозрением на токсоплазмоз, она оказалась отрицательной во всех разведениях. Как вы визуально определите отрицательную РСК? О чем она свидетельствует? Какие реактивы были использованы для постановки этой реакции?

5. Есть подозрение, что в партии мясных консервов содержится ботулинический токсин. С помощью каких серологических реакций его можно выявить? Какие реактивы и оборудование необходимы? Какой результат будет наблюдаться, если подозрение подтвердится?

6. В бактериологической лаборатории исследуется сыворотка гражданина Н. с подозрением на сифилис. В качестве диагностикума были использованы живые трепонемы, а результат фиксировался с помощью темнопольного микроскопа. Какая серологическая реакция была поставлена? Что покажет микроскопия в случае отрицательной реакции?

Приложение 2

Образец протокола:

Задание 1.Выявление менингококковых антигенов в спинномозговой жидкости больного.

№ пробирки	состав реагентов	результат
1	преципитирующая менингококковая сыворотка + спинномозговая жидкость больного №1
2	преципитирующая менингококковая сыворотка + спинномозговая жидкость больного №2
3	преципитирующая менингококковая сыворотка + гомологический преципитиноген
4	преципитирующая менингококковая сыворотка + контрольный экстракт без антигена
5	преципитирующая менингококковая сыворотка + физиологический раствор
6	нормальная сыворотка + спинномозговая жидкость больного №1
7	нормальная сыворотка + спинномозговая жидкость больного №2
8	нормальная сыворотка + контрольный экстракт без антигена

Вывод: реакция положительная у больного № ____, это означает _________________ ____________________________________ .

Задание 2. Определение токсигенности штаммов дифтерийной палочки

методом двойной иммунной диффузии в геле.

Условные обозначения: Рис.1

Вывод: токсигенными являются штаммы №№ ________________ .

Задание 3. Серологическая диагностика в РСК.

а) определение титра и рабочей дозы комплемента.

содержание комплемента (мл)	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5
результат (“+” это гемолиз)

Титр комплемента ________, рабочая доза (на 25% больше титра)___________ .

б) исследование сывороток больных

опыт		контроль
сыворотка №1	сыворотка №2	сыворотка №1	сыворотка №2	антиген

Вывод: РСК положительная у больного № ______ .

Задание 4. Применение РН для выявления микробных токсинов.

Исследуемый материал __________________________________________

Используемые биологические объекты _________________________________

Положительный результат _____________________________________________

Диагностические биопрепараты для РН _______________________________

_________________________________________________________________

Задание 5. Применение реакции иммобилизации микроорганизмов.

Биопрепараты, которые применяются для выявления:

а) микроорганизмов ______________________________________________

б) антител в сыворотке больного ___________________________________

Оборудование, необходимое для учета результата __________________

______________________________________________________________

Положительный результат __________________________________________

Отрицательный результат ___________________________________________

Дата ___________ Подпись преподавателя ___________________

Приложение1