стоматИностр2012 / Модуль1РУС / Практическая работа №5_2

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 6

Тема: Физиология микроорганизмов. Выделение и идентификация чистых культур анаэробных бактерий.

Актуальность темы: При размножении на плотных питательных средах бактерии образуют на поверхности среды и внутри нее типу для каждого микробного вида колонии. Колонии могут быть выпуклыми или плоскими, с ровными или неровными краями, с шершавой или гладкой поверхностью и иметь разную окраску: от белого до черного. Все эти особенности (культуральные свойства) учитывают при идентификации бактерий, а также при отборе колоний для получения чистых культур. Чтобы знать, как получить чистую культуру того или другого микроорганизма, надо внимательно ознакомиться с практической частью данного раздела.

Общая цель - уметь:

а) выбирать пригодные среды для анаэробов;

б) учитывать культуральные и биохимические признаки анаэробов.

Конкретные цели - уметь

1. Посеять микроорганизмы на плотные и жидкие питательные среды.

2. Объяснять виды размножения клеток разных микроорганизмов.

3. Трактовать статистические закономерности роста бактерийной культуры на жидкой питательной среде.

4. Характеризовать виды диссоциации колоний бактерий на плотных питательных средах и особенности разных форм колоний.

5. Использовать специальные методы культивирования анаэробных бактерий (питательные среды для облигатных анаэробов, анаэробные боксы).

6. Объяснять особенности культивирования риккетсий, хламидий, спирохет в связи с их биохимическими свойствами.

Исходный уровень знаний - умений:

1. Описать виды размножения разных клеток ( животных, растительных) ( кафедра биологии)

2. Оценить роль генетического аппарата для размножения и сохранение видов клеток ( кафедра биологии)

3. Пояснить роль нуклеиновых кислот в размножении клеток (кафедра биохимии)

4. Оценить роль фосфора, азота и серы в обеспечении роста и размножения клеток (кафедра биохимии)

Для того, чтобы вы могли уяснить, отвечает ли исходный уровень Ваших знаний-умений необходимому, предлагаем выполнить ряд задач

Задача 1. Чем характеризуется дыхание аэроба?

Задача 2. Чем характеризуется анаэробное дыхание?

Задача 3. В каком процессе дыхания принимают участие цитохромы?

Задача 4. В какой среде живут анаэробы?

Информацию для пополнения знаний-умений можно найти в следующих учебниках:

1. Березов Т.Т., Коровкин В.Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина.- 1998.

Теоретический вопрос, на основе которых возможное выполнение целевых видов деятельности:

1. Рост и размножения микроорганизмов.

2. Простое деление. Фрагментация. Периодическая культура. Фазы развития микроорганизмов в жидкой среде в периодической культуре.

3. Методы культивирования микроорганизмов.

4. Ассоциации микроорганизмов и чистые культуры.

5. Колонии микроорганизмов, особенности их формирования, свойства.

6. Пигменты микроорганизмов.

7. Беспрерывное культивирование, его значение в биотехнологии (получение ферментов, белков, антибиотиков).

8. Методы культивирования анаэробных бактерий (питательные среды для облигатных анаэробов, анаэробные боксы).

9. Особенности культивирования риккетсий, хламидий, спирохет.

10. Значение бактериологического (культурального) метода в диагностике инфекционных заболеваний.

Литература для усвоения знаний-умений по данной теме:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под ред. Л.Б.Борисова, А.М.Смирновой. М.: Медицина,1994. с. 145-149,151-159, 170-180.

2. Лекционный материал из физиологии бактерий.

3. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. /Под ред. Л.Б.Борисова. М.: Медицина, 1984. с. 96-104.

4. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под ред. О.В. Бухарина-М.Медицина.-2002.-с. 32-40

5. Скала Л.З., Нехорошева Н.Г., Лукин И.Н., Груднина С.А. Практические аспекты современной клинической микробиологии.-М.-2004.-с. 9-18

6. Пирог Т.П. Общая микробиология: Учебник для студентов высших учебных заведений.- Л.; НУХТ,2004.-459 с.

Содержание обучения должен обеспечить достижение целей обучения, чему оказывает содействие граф логической структуры темы: „Физиология микроорганизмов ” (приложение 1).

Ориентировочная основа действия при выполнении практической работы.

1. По таблицам и демонстрационным образцам выучить основные типы питательных сред. Приложи записать в протокол, указать сферу их применения. Рассмотреть рост разных бактерийных культур на плотных и жидких питательных средах.

2. Ознакомиться с техникой приготавливания питательных сред. Определить рн МПБ. Кратко описать необходимое оборудование и полученный результат. Рассчитать количество агар-агара для приготавливания плотной и полуредкой среды.

3. На демонстрационных материалах изучить метод выделения чистой культуры анаэробных бактерий, питательные среды и аппаратуру, которые используют для культивирования анаэробов. Краткую характеристику сред и оборудование занести в протокол. Рассмотреть прибор - анаэростат и ознакомиться с принципом его работы.

Анаэростат — прибор для создания бескислородной среды — является толстостенной металлической емкостью для расположения чашек Петри или пробирок. Система газоотводных трубок и вакуумметр позволяет откачивать из емкости воздушную смесь, одновременно замещая ее инертным газом (гелием) и замерять давление (малый. 2.4, бы).

Ознакомиться с условиями создания анаэробиоза в эксикаторе (свечка, тиогликолевая кислота).

Эксикатор - толстостенная стеклянная емкость с притертой крышкой и подставкой для чашек Петре. На дно эксикатору относится свечка, которая горит, или наливается кислота (химический редуцент кислорода), потом крышка притирается .

Рассмотреть чашку с культивированием аэробов и анаэробов (способ Фортнера). В чашку Петри на поверхность питательного агара, разделенного пополам посреди чашки, проводят посев: на одной половине - аэробов, на другой - анаэробов. Чашку герметизируют парафином и помещают в термостат. При остаточном кислороде растут аэробы, после его утилизации начинают расти анаэробы.

Рассмотреть и выучить состав специальных сред для культивирования анаэробов.

Среда Китта-Тароцци — это питательный бульон с глюкозой и кусочками свежих органов животных. Глюкоза и кусочки органов обладают редукцирующей способностью. Среду сверху заливают слоем стерильного масла. Среда контроля стерильности (СКС) — 0,3 %-и агар с добавлением тиогликолевой кислоты (редуцент О₂), посев уколом.

Среда Вильсона-Блэра - это высокий столбик питательного агара с добавлением солей натрия и железа, посев уколом. Анаэробы образуют черные колонии в глубине столбика за счет химической реакции с солями металлов.

4. В препараторской освоить методы приготовления и стерилизации чашек, пробирок, пипеток. Приготовить МПА и среда Эндо или Чапека.

После ознакомления с теоретическими вопросами и ходом проведения эксперимента вам предлагается выполнить следующие учебные задачи.

Основные процессы, которые являются составляющими физиологии микроорганизмов

- Питание, дыхание, размножение, изменчивость

Группы бактерий по типу дыхания

1. Облигатные аэробы

2. Облигатные анаэробы

3.Факультативно-анаеробни микроорганизмы

4. Микроаэрофилы

Питательные среды для культивирования облигатных анаэробов

• Китта-Тароцци, Вильсона-Блэра, СКС

Группы бактерий по способности утилизировать углерод и азот

• Аутотрофы

• Гетеротрофы

Классификация групп гетеротрофов

• Сапрофиты и паразиты

Классификация групп паразитов

• Облигатные и факультативные

Облигатные паразиты (определение)

• Микроорганизмы, полностью лишенные способности жить вне клеток живого организма (вирусы, риккетсии, хламидии)

Условия культивирования бактерий

1. Питательная среда

2. Оптимальная температура

3. Условия аэробов или анаэробов

4. Время культивирования

Типы питательных сред по назначению

1. Простые

2. Элективные

3. Дифференциально-Диагностические

Способ размножения у бактерий

• Поперечное деление

Колония (определение)

• Потомство одной клетки при размножении на твердой питательной среде

Чистая культура (определение)

• Популяция микроорганизмов, которая состоит из особей одного вида

Принципы выделения чистых культур бактерий

1. Механическое разъединение микроорганизмов при посеве

2. Использование биологических свойств бактерий

Этапы бактериологического метода диагностики

- Выделение чистой культуры

- Идентификация чистой культуры

Приложение 1

Жизненные функции микроорганизмов: питание, дыхание, рост и размножение - изучает физиология. В основе физиологических функций лежит беспрерывный обмен веществ (метаболизм). Суть обмена веществ составляют два противоположных, но взаимосвязанных процессы: ассимиляция (анаболизм) и диссимиляция (катаболизм).

Ассимиляция - это усвоение питательных веществ и использование их для синтеза клеточных структур.

При процессах диссимиляции питательные вещества расщепляются и окисляются, при этом выделяется энергия, необходимая для жизни микробной клетки. Все процессы синтеза и распада питательных веществ осуществляются при участии ферментов. В микроорганизмах происходит интенсивный обмен веществ, через сутки 1 микробная клетка может переработать питательных веществ в 30-40 раз больше ее массы.

Микробная клетка использует питательные субстраты для синтеза составных частей своего тела, ферментов, пигментов, рост.

Рост - это увеличение размеров отдельной особи.

Размножение - способность организма к воспроизведению.

Основным средством размножения у бактерий есть поперечное деление, которое происходит в разных плоскостях с формированием разнообразных объединений, клеток (грозди, цепочки, налеты и т.д.). У бактерийных клеток делению предшествует удвоение материнской ДНК. Каждая дочерняя клетка получает копию материнской ДНК. Процесс деления считается законченным, когда цитоплазма дочерних клеток разделена перегородкой. Клетки с перегородкой деления расходятся в результате действия ферментов, которые разрушают сердцевину перегородки.

Скорость размножения бактерий разная и зависит от вида микроба, возраста культуры, питательной среды, температуры.

При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается несколько фаз роста культур:

1. Фаза итоговая (латентная) - микробы адаптируются к питательной среде, увеличивается размер клеток. До конца этой фазы начинается размножение бактерий.

2. Фаза логарифмического инкубационного роста - идет интенсивное деление клеток. Длится эта фаза около 5 часов. При оптимальных условиях бактерийная клетка может делиться каждые 15-30 минут.

3. Стационарная фаза - число бактерий, которые снова появились, равное числу отмерших. Продолжительность этой фазы выражается в часах и колеблется от вида микроорганизмов.

4. Фаза отмирания - характеризуется гибелью клеток в условиях истощения питательной среды и накопление в ней продуктов метаболизма микроорганизмов.

Если питательная среда, в которой культивируются микроорганизмы, будет обновляться, то можно поддерживать фазу логарифмического роста.

Приложение 2.

Образец протокола:

Задание 1. Знакомство с разными питательными средами для выделения аэробов:

Таблица 1

Среды	Примеры микроорганизмов	Название среды
Элективные
дифференциально-диагностические
Основные

Задание 2. Техника приготовления питательных сред.

а) рн МПБ определяется по помощи ______________________________________

проверка показала рН __________, что означает МПБ (пригодный/непригодный) для использования. рН можно исправить ___________________

б) для приготовления плотного (5%) питательного МПА на _________ чашек Петри ( по 20 мл на чашку) нужно ___________ г агар-агара, и ____________мл МПБ

в) для приготовления полужидкого (0,5%) среды Гиса на _________пробирок ( по 2 мл на пробирку) нужно г агар-агара, и ___________мл пептоновой воды

Задание 3. Выделение чистой культуры анаэробов:

а) Таблица 2. Среды и методы культивирования анаэробов

Метод, среда	Условия создания анаэробиоза
Физический
Химический
Биологический
Китта-Тароцци
Вильсона-Блэра
Врублевского
Высокий столбик агара

б) условия посева анаэробов_______________________________________________

в) признака роста, вид колоний ____________________________________________

Дата ___________ Подпись преподавателя _________________