вирусология шпоры / метод флюоресцирующих антител и его использование в вирусологии

Принцип метода флюоресцирующих антител (МФА) основан на визуальном учете специфического взаимодействия флуюоресцирующих антител с гомологичным антигеном.

Образующийся при этом комплекс антиген — антитело, меченный флюорохромом, легко обнаружить по характерному свечению в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа.

Этот метод как однофазная серологическая реакция включает лишь первую специфическую фазу; этим он отличается от РА и РП, состоящих из специфической и неспецифической фаз.

Преимущества МФА: 1) экспресс-метод — быстрое получение результатов; 2) довольно высокая чувствительность и универсальность применения для обнаружения различных антигенов (бактериальных, вирусных, риккетсиозных и др.); 3) простота постановки.

К недостаткам МФА следует отнести необходимость специального оборудования — люминесцентного микроскопа, который не всегда имеется в районных ветеринарных лабораториях.

Практическое использование. МФА в первую очередь следует применять при особо опасных инфекциях (сибирская язва, сап, мелиоидоз), а также для диагностики медленно развивающихся и трудно культивируемых микроорганизмов (возбудителя туберкулеза и паратуберкулеза).

При сапе МФА является одним из наиболее чувствительных, специфических и достоверных методов быстрого обнаружения возбудителя (в течение 1…2 ч). Для его выявления используют иммуноглобулины диагностические флюоресцирующие сапные моноклональные мышиные сухие. Препарат окрашивает только бактерии сапа, не окрашивая возбудителя мелиоидоза. Чувствительность метода в зависимости от объекта исследования составляет 5 ∙ 10⁴…5 ∙ 10⁶ м. т./мл.

Прямую модификацию используют для диагностики сибирской язвы, бруцеллеза, туляремии, псевдотуберкулеза и т. д. Непрямую методику также с успехом применяют для индикации сибирской язвы, мелиоидоза, туляремии и т. д.

При изучении роли мяса как фактора передачи иерсиниозной инфекции оказалось, что непрямой вариант МФА в 2 раза эффективнее по сравнению с культуральным при выявлении Y. enterocolitica в мясе и мясных продуктах: чувствительность метода составляла 1 ∙ 10⁴ м. т./мл (И. С. Киселева, 2005).

Люминесцентный метод применяют для обнаружения возбудителя туберкулеза в исследуемом материале. Для этого мазки из патологического исследуемого материала хорошо высушивают при осторожном подогревании, фиксируют 10…15 мин в жидкости Никифорова. Затем мазки окрашивают флюорохромными красителями, приготовленными по одной из следующих прописей:

I. 1. Аурамин 0 — 0,5 г

2. Родамин 0 — 0,05 г

3. Дистиллированная вода — 1000 мл

II. 1. Акридин оранжевый — 0,1 г

2. Дистиллированная вода — 1000 мл

Окрашивание производят через фильтровальную бумагу при легком подогревании в течение 15 мин. Затем осторожно промывают мазок водопроводной водой, дифференцируют 3%-м раствором солянокислого спирта (15 с), промывают дистиллированной водой. После гашения фона 0,25%-м водным раствором метиленового синего или водным раствором кислого фуксина (1: 1000) в течение 30 с тщательно промывают препарат водой, высушивают и микроскопируют. Возбудитель туберкулеза светится обычно золотисто-оранжевым цветом на черном фоне (картина звездного неба), цитоплазма микобактерий плотная. Сапрофиты после гашения фона выглядят как серо-зеленые, изумрудно-зеленые или лимонно-золотистые палочки на светло-зеленом фоне.

В настоящее время в лабораториях, занимающихся диагностикой туберкулеза, люминесцентная микроскопия постепенно вытесняет методику окраски по Цилю—Нильсену.