Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

биофизике

.docx
Скачиваний:
70
Добавлен:
03.12.2015
Размер:
28.03 Кб
Скачать

метод замораживания-скалывания

Клетки замораживают при температуре жидкого азота (-196 С) и образовавшийся кубик льда подвергают скалыванию. Плоскость скола обычно проходит через гидрофобную сердцевину бислоя любой биологической мембраны, разделяя его на два монослоя. Открывающиеся при этом поверхности сколов затем оттеняют платиной и углеродом, органическое вещество удаляют и полученную в результате платиновую реплику рассматривают в электронный микроскоп.

Мембраны эритроцитов человека, обработанные в соответствии с этим методом, оказываются довольно хаотично усеянными маленькими крупинками примерно одинакового размера (около 7,5 нм), называемыми внутримембранными частицами .

Во время замораживания-скалывания молекулы белка полосы 3 не расщепляются из-за того, что значительная доля их массы располагается внутри бислоя. Большая часть полипептидной цепи белка полосы 3 выступает не с наружной, а c цитоплазматической стороны бислоя, поэтому следовало бы ожидать, что при использовании метода замораживания-скалывания молекулы этого белка чаще будут оставаться во внутренней половине замороженного бислоя. Это объяснило бы преимущественную локализацию внутримембранных частиц на внутренней половине мембраны эритроцитов ( Р ).

С другой стороны, такой белок, как гликофорин , при скалывании мог бы или разорваться или выдернуть свой короткий С-концевой хвост из замороженного внутреннего монослоя. В любом случае, выступающая на поверхности скола молекула гликофорина не будет иметь достаточную массу, чтобы выглядеть как внутримембранная частица.

В настоящее время удалось реконструировать функционирующую систему мембранного транспорта в искусственных бислоях с помощью нескольких выделенных транспортных белков , в том числе и белка, содержащегося в полосе 3. Все изучавшиеся до сих пор транспортные белки можно было увидеть на сколах в электронный микроскоп как частицы. Поскольку это в основном те транспортные белки, которые в пределах бислоя имеют достаточную массу, чтобы отчетливо выделяться на фоне окружающих фосфолипидов , то, вероятно, большинство внутримембранных частиц представляет собой белки, выполняющие определенные транспортные функции.

Электро́нный микроско́п

 (ЭМ) — прибор, позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до 106 раз, благодаря использованию, в отличие от оптического микроскопа, вместо светового потока пучка электронов с энергиями 200 эВ ÷ 400  кэВ и более (например, просвечивающие электронные микроскопы высокого разрешения с ускоряющим напряжением 1 МВ).

Разрешающая способность электронного микроскопа в 1 000÷10 000 раз превосходит разрешение традиционного светового микроскопа и для лучших современных приборов может быть меньше одного ангстрема. Для получения изображения в электронном микроскопе используются специальные магнитные линзы, управляющие движением электронов в колонне прибора при помощимагнитного поля.

Виды электронных микроскопов

Просвечивающая электронная микроскопия

Основная статья:  Просвечивающий электронный микроскоп

В просвечивающем электронном микроскопе используется высокоэнергетический электронный пучок для формирования изображения. Электронный пучок создается посредством катода (вольфрамового, LaB6, Шоттки или холодной полевой эмиссии). Полученный электронный пучок ускоряется обычно до 80-200 кэВ (используются различные напряжения от 20кэВ до 1МэВ), фокусируется системой магнитных линз (иногда электростатических линз), проходит через образец так, что часть электронов рассеивается на образце, а часть — нет. Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фото-пластинке или CCD-камере.

Разрешение ПЭМ лимитируется в основном сферической аберрацией. Некоторые современные ПЭМ имеют корректоры сферической аберрации.

Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100нм) и неустойчивость(разложение) образцов под пучком.

Просвечивающая растровая(сканирующая) электронная микроскопия (ПРЭМ)[

Основная статья: Просвечивающий растровый электронный микроскоп

Один из типов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), однако есть приборы работающие исключительно в режиме ПРЭМ. Пучок электронов пропускается через относительно тонкий образец, но, в отличие от обычной просвечивающей электронной микроскопии, электронный пучок фокусируется в точку, которая перемещается по образцу по растру.

Растровая (сканирующая) электронная микроскопия[

Основная статья: Растровый электронный микроскоп

В основе лежит телевизионный принцип развертки тонкого пучка электронов по поверхности образца.

Недостатки

Электронные микроскопы дороги в производстве и обслуживании, но общая и эксплуатационная стоимость конфокального оптического микроскопа сравнима с базовыми электронными микроскопами. Микроскопы высокого разрешения должны содержаться в стабильных (без вибраций) помещениях и без внешних электромагнитных полей.

В большинстве случаев образцы должны наблюдаться под вакуумом, так как молекулы атмосферы иначе будут рассеивать электроны. Впрочем существуют методики, позволяющие частично обойти данное ограничение.

Сферы применения электронных микроскопов[

Полупроводники и хранение данных

Редактирование схем

Метрология 3D

Анализ дефектов

Анализ неисправностей

Биология и биологические науки

Криобиология

Локализация белков

Электронная томография

Клеточная томография

Крио-электронная микроскопия

Вирусология

Стеклование

Научные исследования

Квалификация материалов

Подготовка материалов и образцов

Создание нанопрототипов

Нанометрология

Тестирование и снятие характеристик устройств

Исследования микроструктуры металлов

Промышленность

Создание изображений высокого разрешения

Снятие микрохарактеристик 2D и 3D

Макрообразцы для нанометрической метрологии

Обнаружение и снятие параметров частиц

Электронная литография

Динамические эксперименты с материалами

Подготовка образцов

Судебная экспертиза

Добыча и анализ полезных ископаемых

Химия/Нефтехимия

Экстракция мембранных белков и липидов.

Экстра́кция — метод извлечения вещества из раствора или сухой смеси с помощью подходящего растворителя. Для извлечения из смеси применяются растворители, не смешивающейся с этой смесью. Экстракция может быть разовой или непрерывной.

Реконструкция мембранных белков.

Поскольку выделение интегральных белков обычно сопряжено с разрушением мембраны, во многих случаях необходимо убедиться, что в процессе выделения и очистки белка его функциональная активность не оказалась нарушенной или утраченной. Для этого, в частности, можно попытаться провести реконструкцию,

т.е. встроить очищенный белок обратно в мембрану. Функциональную активность некоторых мембранных белков, таких, как ионные каналы или транспортные белки, можно охарактеризовать и измерить только в реконструированных мембранных системах.

Солюбилизация мембранных белков.

В зависимости от задачи, которая стоит перед исследователем, мембрана может быть подвергнута мягкой или жесткой обработке. 

При мягких условиях обработки используют как растворы с низкой ионной силой (например, 0,1-1 мМ ЭДТА, который удаляет двухвалентные катионы), так и буферы с высокой ионной силой, содержащие NaCl и КСl в концентрации более 1 М, с добавлением ЭДТА или без нее

Солюбилизация белков с помощью детергентов была с большим успехом использована для изучения главных белков, присутствующих в различных мембранах. В типичном случае мембраны сначала прогревают до 1ОО С в 1%-ном растворе сильного детергента ДСН , который разрушает все нековалентные белок-белковые и белок-липидные взаимодействия и полностью денатурирует белки. Полученный раствор наносят затем на полиакриламидный гель, содержащий ДСН, и подвергают электрофорезу в сильном электрическом поле в течение нескольких часов. Количество отрицательно заряженного ДСН, связавшегося с белком, пропорционально массе полипептида, вследствии чего суммарный отрицательный заряд детергента значительно превышает собственный заряд белка. Поэтому каждый отдельный белок перемещается в электрическом поле со скоростью, определяемой в конечном счете его молекулярной массой: чем крупнее белок, тем в большей степени он задерживается сложной сетью молекул полиакриламида, составляющих гель, и, следовательно, тем медленнее он движется. Если после электрофореза произвести окрашивание белков в геле, используя краситель, связывающийся с белком, например кумасси синий, то главные белки образца можно увидеть как индивидуальные полосы в геле. В дальнейшем для изучения мембранных белков стал применяться метод двумерного электрофореза..

Флуоресцентные зонды

Флуоресценция нашла широкое применение в различных прикладных биологических и биомедицинских исследованиях. Это физическое явление, суть которого заключается в кратковременном поглощении кванта света флюорофором (веществом, способным флуоресцировать) с последующей быстрой эмиссией другого кванта, который имеет свойства, отличные от исходного

Флуоресцентные зонды и метки являются удобным инструментом для исследования биологических мембран и мембранных ферментов. Использование зондов разной природы, способных связываться с белками или встраиваться в различные области липидного бислоя, а также меток, ковалентно реагирующих с функциональными группами белков или липидов, позволяет получить ценную информацию о состоянии и подвижности белка в мембране, состоянии липидного матрикса, характере белок-белковых и белок-липидных взаимодействий.

ЯМР

Я́дерный магни́тный резона́нс (ЯМР) — резонансное поглощение или излучение электромагнитной энергии веществом, содержащим ядра с ненулевым спином во внешнем магнитном поле, на частоте ν (называемой частотой ЯМР), обусловленное переориентацией магнитных моментов ядер.

ЭПР

ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС (ЭПР, электронный спиновый резонанс), явление резонансного поглощения электромагн. излучения парамагн. частицами, помещенными в постоянное магн. поле; один из методов радиоспектроскопии. Используется для изучения систем с ненулевым электронным спиновым магн. моментом (т. е. обладающих одним или неск. неспаренными электронами): атомов, своб. радикалов в газовой, жидкой и твердой фазах, точечных дефектов в твердых телах, систем в триплетном состоянии, ионов переходных металлов.