Отделяемое из нижних отделов дыхательных путей

Отделяемое из нижних отделов дыхательных путей

Показания к проведению исследования: воспалительные заболевания нижних отделов дыхательных путей. Диагностика инфекционных заболеваний: пневмококковой инфекции, сибирской язвы, чумы, туберкулеза.

Взятие исследуемого материала: перед сбором мокроты больному предлагают почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой. Предпочтительным является исследование утренней порции мокроты. Мокроту собирают в стерильную широкогорлую склянку. Удобно использовать для этих целей "карманные плевательницы". Так как маленькие дети не умеют отхаркивать мокроту и заглатывают её, для диагностики туберкулеза, у них исследуют промывные воды желудка.

Исследование промывных вод бронхов проводят при отсутствии или скудности мокроты. Это связано не только с технической сложностью взятия этого вида материала, но и с меньшей диагностической ценностью результата, из-за его значительного разбавления (концентрация микроорганизмов в промывных водах в 10-1000 раз меньше чем в мокроте). Простейший метод взятия трахеобронхиального смыва следующий: гортанным шприцем с помощью аппарата Боброва в трахею вводят около 10 мл стерильного физиологического раствора, и после возникновения кашля собирают откашлянный трахеобронхиальный смыв. У маленьких детей через катетер вводят в трахею 5-10 мл физиологического раствора и затем отсасывают трахеобронхиальный смыв [9].

Бронхиальные смывы могут быть получены при бронхоскопии. В этом случае не рекомендуется вводить в бронх более 5 мл физиологического раствора.

Наиболее достоверные результаты достигаются при взятии материала непосредственно из очага инфильтрации или абсцесса с помощью проводимой под рентгенологическим контролем трансторокальной пункции. По мнению Л.А.Вишняковой и соавт. [9], "тяжесть данной манипуляции компенсируется значительно более точным определением этиологии и этиотропной терапии заболевания".

Методы исследования. Для приготовления мазка из мокроты, распределенной тонким слоем по дну чашки Петри, с помощью двух игл или пинцета выбирают слизистые либо гнойные комочки и переносят их на середину предметного стекла. Затем берут второе стекло и накладывают поверх первого. Комочки мокроты растирают между двумя стеклами до тех пор, пока не получится достаточно тонкий мазок. При этом, во избежание инфицирования рук работающего, и на первом и на втором стеклах мазки не должны занимать более 1/2-2/3 поверхности. Препараты высушивают и фиксируют над пламенем. Один из мазков окрашивают по Граму, второй микроскопируют неокрашенным, для выявления друз актиномицетов или мицелия грибов.

При микроскопии мазка необходимо обратить внимание на наличие и характер клеточных элементов. Хотя их оценка - задача, решаемая при клиническом анализе мокроты, но их выявление позволяет бактериологу проверить правильность взятия материала и составить представление о характере патологических изменений. Для воспалительных процессов в нижних отделах дыхательного тракта характерно наличие гранулоцитов. Присутствие в материале большого количества эпителиальных клеток, особенно в сочетании с отсутствием гранулоцитов, свидетельствует о том, что материал был взят неправильно (с примесью слюны). В этом случае исследование следует повторить. Для острой инфекции характерно наличие в мокроте 1-2 видов бактерий, расположенных вблизи гранулоцитов. Микроорганизмы - контаминанты мокроты, попавшие в нее из ротовой полости, напротив, чаще расположены вблизи эпителиальных клеток.

Микроскопической оценке правильности взятия материала многие микробиологи придают чрезвычайно большое значение. Американским руководством по клинической микробиологии [81] рекомендовано применение для этих целей одной из специально разработанных количественных шкал оценки. Использование каждой из них предполагает микроскопию окрашенного по Граму мазка из гнойной части мокроты под малым увеличением (объектив х10). При использовании шкалы Barlett просматривают 20-30 полей зрения, давая каждому оценку путем суммирования баллов из таблицы 7. Затем рассчитывают средний балл: складывают все начисленные баллы и делят сумму на количество просмотренных полей. Если полученный результат равен 0 или менее вероятность воспаления мала или мокрота вероятно контаминирована в ротовой полости. Такие образцы не подлежат бактериологическому исследованию, и взятие мокроты должно быть повторено.

При оценке мокроты по Murray Washington принадлежность образца к определенной группе устанавливается по таблице 8. При этом бактериологическому исследованию подлежат только образцы принадлежащие к 4-5 группе.

Таблица 8

Схема Barlett оценки правильности взятия мокроты (цитируется по [81])

Тип клеток и их количество в поле зрения при микроскопии с объективом х10		Балл
Нейтрофилы	<10	0
	10-25	+1
	>25	+2
Присутствие слизи		+1
Эпителиальные клетки	10-25	-1
	>25	-2

Таблица 8

Схема Murray Washington оценки правильности взятия мокроты (цитируется по [81])

Группа	Количество в поле зрения при микроскопии с объективом х10
	Эпителиальных клеток	Лейкоцитов
1	25	10
2	25	10-25
3	25	25
4	10-25	25
5	<10	25

По морфологическим и тинкториальным признакам при микроскопии мазка, окрашенного по Граму, можно ориентировочно идентифицировать следующие микроорганизмы, часто присутствующие в мокроте:

• скопления грамположительных кокков - Staphylococcus spp.; Micrococcus spp.;

• цепочки грамположительных кокков - Streptococcus spp.;

• ланцетовидные грамположительные диплококки, окруженные капсулой - S.pneumoniae;

• грамотрицательные диплококки - Neisseria spp.;

• грамотрицательные палочки - Enterobacteriaceae; Pseudomonas spp., Haemophilus spp.; неспорообразующие анаэробы и др.;

• грамотрицательные палочки с закругленными концами, окруженные капсулой - Klebsiella spp.;

• мелкие полиморфные грамотрицательные палочки в виде скоплений - Haemophylus spp.;

• обрывки тонкого несептированного ветвящегося мицелия фиолетового цвета, споры темно-фиолетового цвета и друзы розового цвета - Actinomyces spp.

При бактериоскопическом исследовании диагностически значимым является обнаружение 3 и более пневмотропных микроорганизмов в большинстве полей зрения. Анализ результатов микроскопии мазка мокроты в сочетании с клинико-рентгенологическими особенностями течения заболевания, позволяет поставить ранний клинико-бактериологический диагноз у 86% больных острой пневмонией и у 90% больных пневмококковой пневмонией [68], или, по крайней мере, облегчает выбор антибиотика на основании преобладания грамположительной или грамотрицательной флоры [45]. П.О. Вязицкий и соавт. [11] рекомендуют следующую схему для выбора антибактериальных препаратов в зависимости от результатов микроскопического исследования мокроты:

• грамположительные диплококки с капсулой или кокки, расположенные в виде цепочек - пенициллин или эритромицин;

• грамположительные стафилококки - оксациллин + гентамицин или цепорин + гентамицин;

• грамотрицательные палочки - гентамицин.

По мнению упомянутых авторов, "при обнаружении грамположительных кокков, отнесенных по своим свойствам к пневмококкам или стрептококкам, больному назначается пенициллин (при аллергии к препаратам группы пенициллина - эритромицин), и дальнейшее бактериологическое исследование не проводится". Такой подход позволяет повысить эффективность лечения, за счет выбора адекватной терапии уже в первые часы после поступления больного и разгрузить лаборатории, освободив их от ненужных и трудоемких исследований, т.к. в 50-80% случаев исследование мокроты можно будет закончить микроскопией мазка по Граму. По нашему мнению вышеизложенная точка зрения в настоящее время должна быть пересмотрена с учетом все более широкого распространения пенициллинрезистентных пневмококков, что не всегда позволяет выбрать адекватную схему лечения без бактериологического исследования. Так, исследование, проведенное в США, показало, что в 1993-94 гг. распространенность пенициллинрезистентных штаммов Streptococcus pneumoniae составила 3,2%, тогда как в 1979-87 гг. резистентные штаммы не выявлялись вовсе. Неуклонно нарастает число таких штаммов и в Европе [46].

Особо необходимо подчеркнуть важность бактериоскопического исследования мокроты при деструктивных пневмонитах (абсцесс легкого, гангрена легкого). По мнению Н.В.Путова и Ю.Н.Левашова [54] опытный микробиолог на основании морфологии микроорганизмов, выявляемых при бактериоскопии, может высказать более точное суждение об этиологии процесса, чем это удается сделать при анализе результатов рутинного бактериологического метода. Это связано с тем, что посев на обычно применяемые на сегодняшний день в практических лабораториях среды, не всегда позволяет обнаружить облигатных анаэробов, имеющих исключительно большое значение при данной патологии. Кроме того результаты целенаправленного исследования на неспорообразующие облигатно анаэробные микроорганизмы можно получить лишь на 7-8 дни.

В качестве основного приема культурального исследования мокроты “Методическими указаниями по применению унифицированных микробиологических методов ...” [43] предусмотрен посев мокроты на 5% кровяной агар. При необходимости для первичного посева дополнительно могут быть использованы: среда ВНИИП, ЖСА, шоколадный агар, среды Эндо и Сабуро.

Существуют два принципиальных подхода к культуральному исследованию мокроты: качественный и количественный. При использовании качественного метода исследования мокроту выливают в чашку Петри и с помошью игл, пинцета и т.п. выбирают 2-3 гнойных комочка. Комочки мокроты трехкратно отмывают стерильным физиологическим раствором для удаления наслоившейся в верхних дыхательных путях и в полости рта микрофлоры. Затем их переносят на питательную среду и тщательно равномерно растирают шпателем по ее поверхности. Посевы инкубируют при 37 ^оС.

Промывные воды бронхов засевают аналогичным образом, но без предварительной отмывки гнойных комочков.

В основе количественного метода лежит высев на плотные питательные среды разведений, приготовленных из гомогенизата мокроты. Для этого к 1 мл мокроты добавляют 9 мл питательного бульона или 2% пептонной воды и гомогенизируют в банке со стеклянными бусами 20 минут^1[5] или путем растирания в ступке с кварцевым песком (в этом случае бульон добавляют небольшими порциями в процессе обработки).

Приготовленный гомогенат мокроты принимается за разведение материала 10^-1. Из него готовят ряд серийных десятикратных разведений до 10 ^-7 в бульоне или в пептонной воде. Каждое последовательное разведение готовят новой пипеткой!

Из “нечетных” разведений (10 ^-1;10 ^-3; 10^-5; 10^-7 ) засевают по 0,1 мл на чашки с 5% кровяным агаром и шоколадным агаром. Посевы рекомендуется инкубировать в эксикаторе “со свечой” при 37 ^оС в течение суток. Дополнительно можно провести посев на среды Эндо, Сабуро, ЖСА из исходного разведения 10^-1 . Количество микроорганизмов определяют в максимальном разведении, в котором еще удалось обнаружить рост микроорганизмов.

Сопоставление эффективности количественного и качественного методов исследования мокроты было проведено А.Н.Калюк и К.Н.Полянской [23]. По их мнению, оба метода достаточно информативны, а полученные с их помощью результаты тесно коррелируют друг с другом. В то же время исследование мокроты количественным методом без предварительной отмывки гнойных комочков снижает информативность исследования и может способствовать увеличению выделения пневмококков, вегетирующих на слизистых оболочках носоглотки. На необходимость отмывки мокроты указывают и Т.С.Агеева и соавт. [1], однако по их данным, напротив, рост пневмококков и гемофильных палочек, при посеве не отмытой мокроты ингибируется сопутствующей микрофлорой.

Для гомогенизации мокроты могут быть использованы химические методы. К ним относятся обработка мокроты муколитиками (ацетилцистеин, мукосальвин и др.) или ферментами (трипсин, хемотрипсин, панкреатин). По мнению Л.А.Вишняковой и соавт. [9], наиболее эффективным является применение ацетилцистеина. При этом в неметаллическом сосуде с помощью пипетки с грушей в течение 1-2 минут тщательно перемешивают равные объемы мокроты и 0,5% раствора ацетилцистеина. Применение ацетилцистеина особенно целесообразно для выделения Haemophilus influenzae, так как позволяет снизить ингибирующее действие муцина на гемофильные палочки.

Ферменты могут оказывать повреждающее действие на микроорганизмы, кроме того процесс гомогенизации мокроты с их помощью наиболее продолжителен по сравнению с другими химическими и механическими методами.

Описаны многочисленные модификации количественных методов посева мокроты. Ряд авторов использовал для этой цели различные модификации посева петлей на сектора с использованием калиброванной петли на 0,01 мл по аналогии с методом Gould, широко используемым при исследовании мочи [1, 58]. В.В.Акользин [2] предложил использовать калиброванные петли не только для посева, но и для приготовления разведений. Однако все эти методы не получили широкого распространения.

Оценка диагностической значимости полученных результатов.

Оценка результатов бактериологического исследования проводится на основании сочетанного анализа информации о видовом составе микрофлоры (по данным бактериоскопического и бактериологического исследований), численности отдельных видов микроорганизмов, стабильности их выделения во времени, клинических данных и результатов терапии.

В целом лидирующее положение в этиологии внебольничных пневмоний занимают пневмококки. Например, по данным, Л.А.Вишняковой и соавт. [10] 97,1% пневмоний у детей в возрасте от 1 месяца до 14 лет имели пневмококковую этиологию. При оценке результатов бактериологического исследования необходимо принимать во внимание господствующее значение определенных видов микроорганизмов в типичных клинических ситуациях. Так, крупозная пневмония вызывается пневмококками; лобарная пневмония чаще всего пневмококками, клебсиеллами, стафилококками; очаговые пневмонии - пневмококками, гемофильными палочками, энтеробактериями, синегнойными палочками [18]. Первичная атипичная пневмония чаще всего обусловлена микоплазмами, легионеллами или хламидиями; пневмония на фоне хронического бронхита - гемофильной палочкой, стрептококками; пневмония на фоне гриппа - стафилококками, пневмококками, гемофильными палочками; аспирационная пневмония - энтеробактериями, синегнойной палочкой, анаэробами; пневмония на фоне иммунодефицита - энтеробактериями, стафилококками [45]. Госпитальная пневмония у новорожденных (0-7 дней) чаще всего связана со Streptococcus spp., Escherichia coli, реже: Staphylococcus aureus, Chlamydia trachomatis, Pseudomonas spp. [70]. Острые бронхиты и бронхиолиты, вызываются, как правило, вирусами или микоплазмами, но со 2-3 дня заболевания осложнятся наслоением бактериальной инфекции (чаще всего обусловленной пневмококками или гемофильной палочкой) [5]. Бронхолегочная инфекция у больных муковисцидозом наиболее часто вызывается синегнойной палочкой [24]. Господствующая роль в этиологии острых инфекционных деструкций легких принадлежит несорообразующим анаэробам, стафилококкам [54].

Для ориентировочной оценки численности микроорганизмов в мокроте и их этиологической роли используется следующая схема:

I - очень скудный рост - рост единичных колоний (до 10);

II - скудный рост - рост 10 - 25 колоний;

III - умеренный рост - рост множества сосчитываемых колоний (не менее 50);

IV - обильный рост - сплошной рост не сосчитываемых колоний.

I и II степени роста свидетельствуют в пользу загрязнения или носительства, а III и IV - в пользу этиологической значимости данного микроорганизма [43].

Более сложную схему оценки этиологии инфекционного процесса предлагают Л.А.Вишнякова и соавт. [9]. Её применение подразумевает выполнение лабораторией количественного посева мокроты. Согласно данной схемы этиология острой пневмонии может быть определена на основании одного из следующих критериев:

Обнаружение монокультуры S.pneumoniae в крови или в плевральном эксудате.

Выделение пневмококка или гемофильной палочки в количестве 10⁶ кл./мл в мокроте или 10⁴ - в трахеобронхиальном смыве.

Выявление в течение заболевания при помощи реакции непрямой иммунофлуоресценции 4-кратного или более значительного изменения первоначального титра антипневмококковых антител или титра 1:320 для детей 0-3 лет или 1:640-1:1280 для взрослых больных.

При обследовании больных острой пневмонией на поздних сроках болезни и на фоне этиотропной антибактериальной терапии обнаружение в мокроте или трахеобронхиальных смывах низких концентраций (менее 10⁶ или 10⁴ кл./мл) пневмококка с последующим снижением их не менее чем в 100 раз или при одновременном выявлении антипневмококковых антител в титре 1:640.

При возникновении вторичного инфекционного процесса выделение в 2-3 последующих исследованиях с интервалом 2-5 дней одного и того же вида условно-патогенных бактерий в концентрации 10⁶ кл./мл в мокроте или 10⁴ кл/мл в трахеобронхиальном смыве в сочетании с выявлением местной или системно-иммунологической реакции организма на этот возбудитель.

Обнаружение пневмококкового антигена в крови, плевральном эксудате или моче.

Этиологию внебольничных пневмоний с помощью стандартных методов лабораторного исследования не удается установить в 30-50% случаев. По мнению А.И.Синопальникова и соавт. [59], это обусловлено рядом обстоятельств:

• примерно у 30% больных пневмонический кашель имеет не продуктивный характер;

• часть возбудителей (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumoniae и др.) не могут быть обнаружены с помощью рутинных методов (табл. 9);

• в ряде случаев трудно правильно отдифференцировать "резидентную" флору и возбудитель;

• не всегда удается получить мокроту, пригодную для бактериологического исследования (см. выше);

• часть больных получает антибиотики до начала бактериологического обследования.

Таблица 9

Некоторые специальные методы диагностики заболеваний, обусловленных отдельными пневмотропными микроорганизмами.

Микроорганизм	Специальные приемы выделения возбудителя или диагностики заболевания.
Mycobacterium spp.	Бактериоскопия мазков из обогащенной флотацией мокроты, окрашенных флюорохромом в люминесцентном микроскопе. Посев специальным образом обработанной мокроты на среду Левенштейна-Иенсена. Биопроба.
Chlamydia pneumoniae	Заражение культур клеток (редко). Серодиагностика
Mycoplasma pneumoniae,	Индикация АГ в ИФА, выделение на элективных средах, серодиагностика.
Legionella pneumoniae	Посев на специальные питательные среды и биопроба (редко). Серодиагностика.

 

В зарубежной практике при диагностике пневмоний часто используется исследование крови. Безусловно, обнаружение возбудителя в крови позволяет наиболее точно судить об этиологии процесса, однако, по данным Л.А.Вишняковой и соавт.[10], исследования крови эффективны лишь в первые 2-3 дня болезни и бывают положительными только у 10-25% больных.

1