Pavlovich-_obschy_praktikum

Приготовление свернутой сыворотки. Готовят среду из нормаль ной лошадиной или бычьей сыворотки, стерильно разливают в про бирки по 3 мл и пробирки укладывают наклонно в аппарате для свертывания. Стерилизацию проводят при температуре 80°С в течение 1 ч. Свернутая сыворотка должна содержать конденсационную воду и выборочно подвергаться проверке на стерильность в термос тате. При прорастании сред в контрольных пробирках остальные пробирки стерилизуют повторно по 2 ч при температуре 80°С еще двое суток.

Желчный бульон. К МПБ (рН 7,4) прибавляют 10 % бычьей желчи. Разливают среду в пробирки и флаконы, стерилизуют в течение 15 мин при 1 атм.

Пептонная вода. К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5г натрия хлорида, кипятят, охлаждают, подщелачивают до рН 8,0 - 8,2, разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют в течение 15 мин при 1 атм.

Дифференциально-диагностические питательные среды. Пред назначены для выявления протеолитических, сахаролитических гемолитических и других свойств микроорганизмов.

Протеолитические свойства микроорганизмов изучают на плот ных и жидких средах (мясо-пептонный желатин, свернутая сыворотка, МПБ или пептонная вода с использованием специальных индикаторов для обнаружения индола, сероводорода и аммиака), а так же на обезжиренном молоке.

Мясо-пептонный желатин (МПЖ). К МПБ добавляют 10 - 15 % на резанного желатина. После набухания желатин нагревают до полного расплавления, устанавливают рН 7,0 - 7,1. Среду осветляют прибавляя к 1 л один яичный белок, смешанный с двумя объемами воды, взбалтывают и подогревают текучим паром в течение 20 мин фильтруют в горячем виде, проверяют рН и разливают в пробирки или другую посуду. МПЖ стерилизуют текучим паром 3 суток под ряд по 30 мин и помещают в термостат для проверки стерильности.

Исследуемую культуру бактерий сеют уколом в столбик желатина, посевы оставляют при комнатной температуре и через несколько дней учитывают характер его разжижения.

Молоко отстаивают в холодильнике и снимают сливки. Обезжиренное молоко разливают в пробирки и стерилизуют текучим паром или при 0,5 атм в течение 30 мин. Сахаролитические свойства (спектр гликозидаз) исследуют на полужидких средах Гисса и на плотных дифференциально-диагностических средах Эндо, Левина и Плоскирева, выпускаемых в виде порошков, основой которых является питательный агар с разными углеводами и индикаторами. Готовят эти среды по прописи этикеток на банках. Среды Гисса разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм в течение 10 мин, остальные - после расплавления и непродолжительного кипячения заливают в чашки Петри.

При ферментации углеводов полужидких сред Гисса (глюкоза, мальтоза, лактоза,

сахароза, маннит) с образованием кислоты наблюдается изменение их цвета; выделяемый в полужидкую среду газ распределяется в виде пузырьков. В специально приготовленных жидких средах Гисса газ улавливается поплавками, представляющими собой перевернутые вверх донышком маленькие пробирки.

На. плотных пластинчатых средах Эндо. Левина, Плоскирева, в состав которых входит лактоза, дифференцируют кишечные палочки, ферментирующие лактозу и образующие вследствие этого цветные колонии, от лактозоотрицательных энтеробактерий, формирующих бесцветные колонии.

Для определения видовой принадлежности микроорганизмов применяют многокомпонентные среды, которые в сжатые сроки позволяют выявить несколько основных ферментных систем и отдифференцировать родственные микроорганизмы. В частности, для дифференциации энтеробактерий широко используется среда Клиглера, реже среда Олькеницкого.

Среда Олькеницкого. К 100 мл МПА прибавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины и 0,4 мл фенолового красного. Соль Мора и гипосульфит предварительно растворяют в дистиллированной воде. Углеводы и мочевину также растворяют в дистиллированной воде на водяной бане. Все ингредиенты хорошо перемешивают с МПА, фильтруют через стерильную марлю и устанавливают рН 7,2 - 7,4. Добавляют 0,4 мл индикатора (феноловый красный) и разливают в пробирки. Среду Олькеницкого можно приготовить из сухого МПА, расплавленного в 100 мл дистиллированной воды. В охлажденный МПА вносят все ингредиенты, разливают в пробирки, стерилизуют текучим паром 3 суток по 20 мин, затем скашивают. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

21

Среда Клиглера в отличие среды Олькеницкого не содержит сахарозы и мочевины. Эта сухая среда выпускается всеми мировыми производителями питательных сред и является стандартной средой для дифференциации энтеробактерий. Готовая среда имеет оранжевокрасный цвет.

Гемолитическую способность микроорганизмов изучают на кровяном агаре . Синтетические среды. Помимо натуральных, имеются синтетические среды с точным

составом входящих в них ингредиентов, что зачастую облегчает выделение микроорганизмов и дифференциацию прототрофов и ауксотрофов. Эти среды создаются с учетом питательных потребностей вида микроба, благодаря чему он лучше и быстрее растет, активно продуцирует экзотоксины, антибиотики и другие метаболиты. Эшерихии хорошо растут на синтетической среде, состоящей из NH4C1 (1,0 г), MgSO4 (0,13 г), КН2РО4

(3,0 г), Na2HPO4 (60,0 г) и воды (100 мл).

В практических лабораториях для культивирования туберкулезных микобактерий используют синтетическую среду Сотона. В 200 мл дистиллированной воды растворяют при подогревании 4 г аспарагина, 2 г лимонной кислоты, 0,5 г дигидрофосфата калия, 60 г глицерина. Смесь фильтруют, добавляют к ней 800 мл дистиллированной воды, доводят рН до 7,2 путем добавления аммиака, разливают по колбам и стерилизуют 20 мин при температуре 115 °С. Пробки пробирок с питательными средами заливают парафином.

Для поддержания перевиваемых клеток используют питательные среды 199, Игла и другие, содержащие полный набор веществ, необходимых для роста клеток вне организма (аминокислоты, углеводы, определенный солевой состав, рН, витамины).

Контрольные вопросы

1. Способы стерилизации. 2. Принципы автоклавирования. 3. Дробные методы стерилизации.

4. Пастеризация. 5. Фильтрация. 6. Основные ингредиенты простых питательных сред. Их приготовление. 7. Каким требованиям должны удовлетворять питательные среды? 8. Приготовление МПБ и МПА. 9. Дифференциально-диагностические питательные среды, их назначение.

10. Специальные питательные среды. 11. Элективные питательные среды, их применение. 12. Синтетические питательные среды.

Задания для самостоятельной работы

1.Приготовление МПБ и МПА, дифференциально-диагностических сред Эндо и Левина.

2.Изготовление кровяного агара, свернутой сыворотки, сахарного и сывороточного бульона.

3.Ознакомление с методами приготовления желчного бульона, пептонной воды. 4. Демонстрация стерилизационной аппаратуры: автоклав, сухожаровые шкафы и фильтр Зейтца.

Культивирование бактерий. Методы посева

Культивирование (выращивание) микробов, в частности бактерий, проводится на питательных средах. Посев бактерий на среды делают бактериальной петлей (иглой), шпателем, пастеровской или обычной градуированной пипеткой (см. рис. 2).

Выросшие на поверхности плотных сред изолированные макроскопические скопления биомасс, являющиеся продуктом размножения одной-единственной клетки, называются колониями. Колониии представляют собой чистую культуру бактерий, которую, накопив на средах, используют для определения видовой принадлежности микроорганизма.

Методы и техника посева материалов и культур микробов.

Посев бактериальной петлей на скошенную и жидкую среды:

1)пробирку с чистой культурой бактерий и пробирку со стерильной незасеянной средой берут в левую руку и держат пальцами в наклонном положении так, чтобы их содержимое не проливалось;

2)в правую руку, как писчее перо, берут петлю и в вертикальном положении стерилизуют в пламени горелки;

3)пробки из пробирок вынимают одновременно, зажимают их между мизинцем и ладонью правой руки и тотчас же обжигают края открытых пробирок;

4)прокаленную петлю вводят в пробирку, охлаждают, прикасаются к культуре бактерий, быстро переносят ее в пробирку с незасеянной средой, ополаскивая петлю в бульоне или же зигзагообразными движениями распределяют по скошенной поверхности агара (рис.14а);

22

5) петлю извлекают, обжигают края пробирок и закрывают их проведенными через пламя пробками, затем бактериальную петлю стерилизуют, пробирки надписывают и ставят в штатив.

Рис. 14. Посев материалов-культур: i - бактериальной петлей на скошенную среду; б - уколом в столбик среды

Посев градуированной или пастеровской пипеткой: пробирки держат под небольшим углом, градуированную или пастеровскую пипетку проводят через пламя и, сняв пробки, опускают в пробирку, затем насасывают определенное количество материала, переносят его в питательную среду и выдувают. Пробирки закрывают, а пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.

Посев уколом производят в полутвердые агаризованные среды и мясо-пептонный желатин, залитые в пробирки столбиком. Пробирки держат вверх дном, насквозь прокалывая среды иглой или петлей (рис. 14, б). Посев уколом в столбик применяют для выращивания анаэробных микробов, выявления протеолитических свойств, длительного хранения культур.

Посев в чашки Петри с плотной питательной средой осуществляют шпателем или бактериальной петлей.

Плотные питательные среды (МПА, Эндо, Левина, Плоскирева) разливают в чашки следующим образом. Флакон или пробирку с расплавленной средой берут в правую руку,

левой рукой вынимают пробку, обжигают горлышко флакона, большим и указательным пальцами левой руки слегка приподнимают крышку чашки Петри и, не касаясь краев крышки, вводят под нее горлышко флакона или пробирку, наливая 15 -20 мл среды. Быстро закрывают флакон и крышку. Чашку Петри слегка покачивают для равномерного распределения среды и оставляют до застывания. Затем переносят ее в термостат, переворачивают вверх дном, снимают крышку и подсушивают в таком положении 15-20 мин.

Посев шпателем. Шпатели готовят из стеклянных палочек толщиной 4-5 мм, согнутых в виде треугольника (см. рис. 2, в), заворачивают в бумагу и стерилизуют в сухожаровом шкафу. Их можно также стерилизовать, смачивая спиртом с последующим его сжиганием. Пластинчатые среды засевают шпателем, круговым движением распределяя по всей поверхности внесенную в центр чашки Петри каплю материала или взвеси микробов. Во время посева крышку чашки Петри поддерживают левой рукой, чашка остается слегка

приоткрытой (рис. 15).

Рис. 15. Посев микробиологическим

шпателем на МПА в чашках Петри

Далее тем же шпателем поочередно засевают вторую и третью чашки Петри, после чего шпатель погружают в банку с дезинфицирующим раствором. Чашки переворачивают, надписывают и ставят в термостат вверх дном, чтобы избежать размывания растущих колоний на среде капельками конденсационной воды, в большом количестве скапливающимися на внутренней поверхности крышки при обычном ее положении.

Посев бактериальной петлей. Исследуемую жидкость набирают петлей и, не прикасаясь к стенке пробирки, удаляют излишнее ее количество. Чашку Петри с агаризованной средой помещают на столе вверх дном. Донную часть чашки держат левой рукой вертикально, петледержатель - большим и указательным пальцами правой руки и легкими движениями

23

наносят параллельные штрихи по всему диаметру поверхности среды.

Выделение чистых культур бактерий

Чистая культура - это определенный вид микроорганизма, по наличию которого в организме больного человека и животного можно подтвердить поставленный диагноз инфекционного заболевания. Получение чистой культуры и умение установить ее видовую принадлежность в медицинской микробиологии имеют первостепенное значение.

При выполнении этой задачи следует иметь в виду, что в патологических материалах возбудитель заболевания, как правило, находится в ассоциации с банальной (посторонней) микрофлорой. Следовательно, для его изоляции гной, мокроту, осадки мочи, испражнения и прочие экскреты необходимо засеять так, чтобы получить колонии. С этой целью материалами засевают агаризованные среды в чашках Петри. После детального изучения выросшие колонии пересевают на скошенные и жидкие среды для накопления биомассы. В процессе накопления исследуются культуральные свойства чистой культуры (I этап идентификации вида).

Окончательное суждение о природе чистой культуры (вида) вы носят только после всестороннего изучения биохимических свойств, которые тесно переплетены с культуральными; серологии ческих реакций (действие специфических сывороток); фагочувствительности культуры и ее патогенности для экспериментальных животных (II заключительный этап идентификации вида). При этом следует учитывать некоторые различия в выборе метода получения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Выделение и изучение культуральных свойств аэробов и факультативно-анаэробных бактерий

Бактерии-аэробы и факультативно-анаэробных бактерии выращивают в обычных условиях кислородной среды. Схематично начальный этап исследования материала можно представить следующим образом.

Первый день исследования. Изучаемый материал микроскопируют и высевают на плотную среду в чашки Петри шпателем или бактериальной петлей (в отдельных случаях - в жидкую среду на копления). Посевы помещают в термостат на 18 - 24 ч при температуре

37ºС.

Второй день исследования. После суточного пребывания чашек Петри с посевами в термостате изучают специфические признаки выросших на поверхности питательной среды колоний.

1.Вначале рассматривают колонии невооруженным глазом со стороны дна чашки Петри

впроходящем свете. Если имеются два различных вида колоний, их нумеруют и описывают каждую в отдельности. В протоколе отмечают следующие данные: а) размеры колоний (крупная - 4 - 5 мм в диаметре и более, средняя - 2 - 4 мм мелкая - 1 - 2 мм, карликовая - менее 1 мм); б) форму очертаний (правильно или неправильно округлая, розеткообразная, ризоидная и др.); в) степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная прозрачная).

2.Далее колонии описывают в отраженном свете со стороны крышки, отмечая: а) цвет (бесцветная, пигментированная, цвет пигмента); б) поверхность (гладкая, блестящая, влажная или мор щинистая, матовая, сухая и др.); в) положение на питательной среде (возвышающаяся над средой, погруженная или сливающаяся со средой, плотно прилегающая к среде, уплощенная).

3.Приступают к микроскопическому изучению структуры колоний. Чашку Петри устанавливают вверх дном на предметном столике микроскопа, опускают конденсор и объективом х 8 изучают: а) характер краев (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые и

др.); б) структуру (гомогенная или аморфная, зернистая, волокнистая и др.).

Из колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Остаток колонии пересевают на скошенный агар для получения чистой культуры в достаточном количестве.

24

Пробирки с посевами помещают в термостат. на 18 - 24 ч при температуре 37 °С.

Техника посева колонии на скошенный агар. Дно чашки Петри с отмеченной колонией берут в левую руку. Бактериальную петлю держат ближе к концу петледержателя и фиксируют руку, опираясь мизинцем о борт чашки. Снимают петлей остаток отмеченной колонии, чашку Петри вкладывают в крышку и засевают скошенный агар.

Особенности выделения и изучения культуральных свойств облигатных-анаэробов

Условия культивирования. Бактерии -анаэробы выращивают при пониженном содержании кислорода, облигатные - при полном его отсутствии, что достигается путем посева материалов внутрь жидкой или полутвердой питательной среды.

По питательным потребностям наиболее пригодной для бактерий-анаэробов является среда Китта-Тароцци (среда накопления), состоящая из концентрированного МПБ, глюкозы и 0,15 % агара (рН 7,2 - 7,4). На дно пробирки для адсорбции кислорода помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1,0-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Перед посевом среду "регенерируют" (кипятят 10 -15 мин для удаления воздуха), затем быстро охлаждают, а после посева заливают стерильным вазелиновым маслом. Высевают материал в две пробирки со средой Китта-Тароцци, одну из них прогревают 30 мин при 80 °С для уничтожения вегетативных форм сопутствующей микрофлоры.

Посевы на поверхности плотных сред, разлитых в чашки Петри, культивируют в макроили микроанаэростате.

Макроанаэростат представляет собой двухстенный аппарат с герметически закрывающейся крышкой. Между стенками аппарата находится вода, источником тепла служит электричество, терморегулятор обеспечивает постоянную температуру. Посевы помещают в анаэростат после того, как температура в нем будет доведена до 37 °С, и герметически закрывают крышку. Анаэростат соединяют с вакуум-насосом и, выкачивая воздух, создают вакуум 3-5 мм. Посевы инкубируют в анаэростате обычно в течение 48 ч. В

современных макроанаэростатах небходимая атмосфера создается замещением воздуха инертными газами.

Имеются также портативные анаэростаты. Это небольшие металлические или прозрачные пластиковые коробки (цилиндры) с герметически закрывающейся крышкой, где необходимая атмосфера генерируется с помощью химических реактивов, а температура создается помещеним их в термостат.

Особенности выделения бактерий облигатных -анаэробов.

В первый день исследуемый материал микроскопируют и высевают в среду Кита Тароцци градуированной или пастеровской пипеткой, прогревают при 80 °С в течение 30 мин, заливают вазелиновым маслом и посевы помещают в термостат.

На второй день помутневшую (нередко вспенившуюся) среду накопления набирают пастеровской пипеткой, которую опускают через слой вазелинового масла до дна пробирки. Масло с поверхности стенок пипетки удаляют стерильной ватой при помощи пинцета над сосудом с дезинфицирующим раствором.

Полученную культуру микроскопируют и пересевают на плотные питательные среды. Изолированные колонии получают последовательным засевом шпателем бульонной культуры в три чашки Петри с кровяно-сахарным агаром (КА Цейсслера) . Чашки Петри помещают в анаэростат при температуре 37°С на 24-48 ч (метод Цейсслера) или культуру засевают в столбики расплавленных и остуженных сахарных агаров после предварительного разведения в изотонических растворах натрия хлорида пастеровской пипеткой с запаянным концом (метод Вейнберга).

На третьй сутки изучают выросшие на чашках Петри колонии, делают на них мазки, высевают на среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры. Колонии из столбиков агара извлекают пастеровской пипеткой, микроскопируют и тоже высевают на среду Китта-Тароцци.

Контрольные вопросы

1. Техника посева колоний бактериальной петлей на скошенный агар и жидкую среду. 2. Техника посева колоний петлей и шпателем на плотную среду в чашках Петри. 3. Понятие о чистой культуре. Этапы ее выделения и изучения. 4. Схема выделения чистой культуры аэробных бактерий. 5. Способы изучения колоний. 6. Какие условия необходимы для культивирования анаэробов? 7. Среда Китта—Тароцци и ее приготовление. 8. Методика выделения чистой культуры анаэробов.

25

Задания для самостоятельной работы

1. Выделение чистой культуры бактерий из материала: первый день — приготовление мазка, окраска водным фуксином и бактериоскопия, посев петлей в чашку Петри с МПА; второй день — изучение колоний на МПА в чашках Петри: а) приготовление из них мазков, окраска по Граму и микроскопия; в) отсев колоний на скошенный агар для накопления чистых культур. 2. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий: а) изучение аппаратуры для их выращивания; б) посев почвы на среду Китта— Тароцци для выделения анаэробных клостридий.

Изучение ферментативных свойств бактерий

Для идентификации выделенной чистой культуры бактерий, кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей, необходимо определить их ферментативные свойства.

Ферменты, расщепляющие углеводы, выявляют в жидких или полужидких средах Гисса с моно- и дисахаридами (глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза), полисахаридами (крахмал, гликоген, инулин), высшими спиртами (глицерин, маннит). Культуры в полужидкие среды высевают, прокалывая среду бактериальной петлей до дна пробирки. В процессе ферментации углеводов бактериями образуются альдегиды и кислоты, которые вызывают изменение цвета индикатора столбиков полужидкого агара, а при газообразовании - появление в них пузырьков. Различие в цветовых оттенках в нескольких пробирках со средой Гисса позволило называть его "пестрым" рядом.

Протеолитические ферменты у бактерий обнаруживают, засевая их уколом в столбик желатина. Выдерживают при комнатной температуре (20-22 °С) в течение нескольких дней, при этом регистрируют характер разжижения желатина (послойное, в виде гвоздя, (елочки и др.). Протеазы бактерий разжижают также уплотненную сыворотку. При посеве на молоко нередко растворяют сгустки казеина с образованием пептона, что придает ему желтоватый цвет (пептонизация молока).

Показателями более глубокого расщепления белка служат образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ бактерии засевают на МПБ или пептонную воду. Посевы выдерживают в термостате в течение 1-3 суток.

Для выявления индола используют узкие полоски фильтровальной бумаги, которые смачивают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают. Эту индикаторную бумагу помещают между стенкой пробирки и пробкой так, чтобы она свисала над засеянной средой. При выделении индола нижняя часть полоски бумаги вследствие соединения его со щавелевой кислотой приобретает розовый цвет (способ Мореля).

Наличия аммиака определяют по посинению свисающей лакмусовой бумаги. Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При взаимодействии последнего с сероводородом индикаторная бумага чернеет в результате образования сульфита свинца.

Для определения каталазы вносят в каплю 3% раствора пероксида водорода на поверхности стекла. При положительной реакции происходит бурное образование пузырьков газа.

Проба на цитохромоксидазу на взятый тампоном материал колонии суточной или 18часовой агаровой культуры наносят каплю 1 % раствора парадиэтилфенилен-диамина содяно кислого. При положительной пробе на оксидазу через 1 -3 мин культура или колония окрашивается в синий цвет.

С целью установить редуцирующую (восстанавливающую) способность бактерий

используют растворы метиленового синего, тионина, индигокармина, нейтрального красного, которые прибавляютк питательному бульону или агару. При наличии у бактерий peцидивирующей способности среда обесцвечивается. Наиболее часто используют среду Ротбергера (МПА с 1 % глюкозы и несколькими каплями насыщенного раствора нейтрального красного). При положительной реакции красный цвет агара переходит в желтый, желтозеленый, флюоресцирующий, при одновременной ферментации глюкозы происходит разрыв среды.

Для того чтобы составить ориентировочное представление о родовой принадлежности бактерий, обычно исследование ферментативных свойств проводят на коротком "пестром" ряде Гисса, который включает столбики полужидкого агара с глюкозой, лактозой

26

мальтозой, сахарозой, маннитом, и пептонную воду с индикаторными бумажками на индол и сероводород.

Контрольные вопросы

1. Среды Гисса ("пестрый" ряд). Почему ряд называется "пестрым"? 2. Субстраты исследования протеолитических свойств бактерий. 3. Методы обнаружения индола сероводорода, аммиака.

4. Рецидивирующая способность бактерий.

Задания для самостоятельной работы

1. Исследование чистой культуры аэробных бактерий на третьи сутки: а) изучение характера ее роста на скошенном агаре; б) приготовление мазков, окраска Граму и микроскопия (проверка чистоты выделенной культуры); в) посев выделенной культуры аэробных бактерий в короткий Пестрый" ряд. 2. Исследование ферментативных свойств бактерий кишечной группы на питательных средах Эндо, Плоекирева, Левина, Клиглера; демонстрация сред "пестрого ряда", измененных под влиянием эшерихий и сальмонелл. 3. Исследование чистой культуры анаэробных бактерий: а) изучение посева на среде Китта-Тароцци; б) приготовление мазков из выросшей культуры, окраска по Граму, бактериоскопия; в) посев методом последова тельного разведения.

Методы культивирования риккетсий.

Общие сведения. Риккетсии -это облигатные внутриклеточные бактерии. Их выращивают в специальных лабораториях в культурах клеток и тканях (8-14 сут) или в полости желточного мешка куриного эмбриона (6-8 сут.) при температуре 35 - 36 °С. Кроме того, они культивируются в организме кровососущих (вши, клещи).

Для выделения и дифференциации патогенных для человека видов риккетсий заражают подкожно и внутрибрюшинно самов морских свинок, у которых риккетсий, развиваясь в мезотелии влагалищных оболочек яичек, вызывают орхит (скротальный феномен). У белых мышей при интраназальном инфицировании развивается пневмония.

Методы культивирования вирусов

В отличие от риккетсий вирусы паразитируют на генетическом уровне как молекулы, процесс воспроизводства (репродукция) которых всецело обусловлен метаболизмом клетки-хозяина (культуры клеток, куриные эмбрионы, изредка животные).

Репродукция вирусов в культуре клеток. Культура клеток - это выращенные вне организма на специальных средах клетки различных тканей животных и человека, в том числе лейкоциты, сохраняющие присущий им обмен и восприимчивость к определенным вирусам.

Для выращивания клеток (тканей) применяют различные питательные среды (Игла или 199), содержащие полный набор необходимых веществ (аминокислоты, пурины, пиримидины, углеводы, витамины и др.) с добавлением бычьей сыворотки.

Имеется много клеток тканей и способов их культивирования, но в основном используют однослойные культуры трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Главное требование при работе с вирусами и культурами клеток - строгое соблюдение стерильности, которое достигается в асептических условиях вирусологического бокса.

Трипсинизирование культуры клеток ткани. Источником их получения являются обладающие большой потенцией роста опухолевые и эмбриональные ткани птиц (главным образом кур), экспериментальных животных, обезьян и человека. Чаще всего трипсинизированные культуры клеток готовят из абортированных 8 - 14-недельных плодов человека.

Подвергающуюся трипсинизации ткань измельчают ножницами на мелкие кусочки размером 2 - 4 мм и два-три раза отмывают от крови буферным раствором Хенкса, пока жидкость не станет почти прозрачной. Затем для разрушения межклеточного вещества кусочки ткани заливают подогретым до 32 - 37°С 0,25 % раствором трипсина, и в смесителе на электромагнитной мешалке перемешивают взвесь в течение 10-30 мин. Первую порцию трипсинизированных клеток удаляют. Подходящие для культивирования вирусов клетки получают после повторных трипсинизации. Далее содержащую клетки жидкость для отделения крупных комочков ткани и соединительнотканных волокон фильтруют через марлю, центрифугируют при 800 - 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок отмывают раствором Хенкса и разводят средой 199 (или Игла), чтобы

27

получить в 1 мл 100 000 - 400 000 клеток. Взвесь клеток разливают по 1 мл в пробирки или по 20 - 100 мл в стеклянные флаконы (матрацы), плотно закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при температуре 37 °С. Матрацы располагают в горизонтальном положении, а пробирки под углом 5 — 10° в специальных лотках. Прикрепляясь к стеклу, клетки начинают пролиферировать и спустя 3-5 суток образуют монослой. Для заражения вирусами отбирают лишь те пробирки и флаконы, в которых под малым увеличением микроскопа наблюдается хороший рост клеток.

Солевой раствор Хенкса содержит 80 г NaCl, 4 г КС1, 2 гMgSO4 х 7Н20, 1,4 г СаС12, 0,6 г

КН2РО4, 0,6 г Na2HPO4 х 2Н2О, 10 г глюкозы, 0,3 г фенолового красного и 1 л воды бидистиллированной.

Основной раствор хранят в холодильнике и перед употреблением разводят в 10 раз дистиллированной водой, разливают по 10 мл во флаконы, которые закрывают ватными пробками и стерилизуют текучим паром. Затем в каждый флакон наливают по 0,25 мл 1,4 % раствора NaHCO3 , закрывают резиновыми пробками и помещают в холодильник на 2 - 3 суток для растворения диоксида углерода.

Перевиваемые культуры клеток. К перевиваемым культурам клеток относятся стабильные линии клеток, полученные из нормальных тканей человека (амниона - А-0, А-1; почек - Rh, ППЧ; диплоидных клеток легкого или почек - ДКЧ), животных (сердца обезьян циномольгус - СОЦ, почек кролика - ПК) и злокачественных опухолей шейки матки - HeLa, гортани человека - НЕр-2, костного мозга - Д-6 и другие, которые поддерживаются путем последовательных пассажей много месяцев и даже лет. Эти клетки в течение 4-7 суток образуют в оптимальной среде сплошной монослой. Их рост контролируют ежедневным просмотром пробирок и флаконов при малом увеличении микроскопа.

Для заражения культур ткани вирусами питательную среду удаляют и вносят в каждый флакон по 0,1 - 0,2 мл исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для того, чтобы убить постороннюю микрофлору. После 30-60-минутного контакта с тканью введенный материал отсасывают пипеткой, наливают питательную среду и флаконы помещают в термостат.

Культивирование вирусов в развивающемся курином эмбрионе. Для культивирования вирусов обычно используют 7-15-дневные зародыши белых кур. Заражение производят на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, желточный мешок, в амниоти: ческую полость, в тело зародыша (рис. 16). Выбор метода заражений эмбрионов зависит от свойств вируса.

Перед заражением яйцо помещают в овоскоп: 1) определяют жизнеспособность эмбриона (живой - подвижен, видна пульсация сосудов и его местоположение); 2) отмечают границы воздушного мешка.

Наиболее распространен способ введения заразного материала на хорионаллантоисную оболочку. Для этого скорлупу над воздушным пространством обрабатывают спиртом и йодом. Сбоку от него выпиливают небольшие

отверстия в форме трех-четырехугольника, снимают скорлупу и слегка надрывают скорлупную оболочку. Вследствие давления воздуха хорионаллантоисная оболочка западает. На оболочку шприцем наносят 0,1-0,2 мл исследуемого материала. Прокалывая хорионаллантоисную оболочку и погружая иглу на 1 - 2 мм, тем же количеством материала заражают и аллантоисную полость. Отверстие закрывают стерильным покровным стеклом, прикрепляя его полузастывшим парафином.

Рис. 16. Способы заражения куриного эмбриона:

а — в аллантоисную полость; б — в амнион; в — в желточный мешок

Для введения материала в амниотическую полость над воздушным пространством срезают и снимают небольшой участок оболочки скорлупы. Сложенными браншами осторожно прокалывают хорионаллантоис, захватывают амниотическую оболочку, приподнимают и вводят в ее полость 0,05-0,10 мл материала и опускают. Отверстие в скорлупе закрывают стеклянным колпачком и заливают парафином.

28

Заражение в амниотическую полость можно производить и слепым способом. В овоскопе определяют местоположение эмбриона по его тени на скорлупе. В центре тупого конца яйца делают прокол, через который иглой шприца или пастеровской пипеткой с тонко оттянутым капилляром вносят исследуемый материал. Отверстие в скорлупе заливают парафином.

Более просто достигается заражение в желточный мешок. Яйцо помещают на подставку тупым конусом вправо. Иглой шприца прокалывают скорлупу над воздушным пространством, углубляя ее на 3-4 см. Попав в желточный мешок, вводят в него 0,2 - 1,0 мл

взвеси. Отверстие в скорлупе заливают парафином.

Зараженных эмбрионов помещают в термостат, в котором поддерживается определенная влажность. Время инкубации эмбрионов и температурный режим зависят от свойств исследуемого вируса.

Вскрытие эмбрионов. Яйцо помещают в подставку воздушным мешком кверху, дезинфицируют над ним скорлупу и удаляют ее ножницами.

Материал забирают в следующем порядке: 1) отсасывают аллантоисную, затем амниотическую жидкость; 2) разрезают хорионаллантоисную оболочку и содержимое всего яйца выливают в чашку Петри; 3) отделяют амниотическую оболочку, эмбрион, желточный мешок, захватив его за пупочный канатик; 4) последней извлекают хорионаллантоисную оболочку. При этом пытаются обнаружить макроскопические изменения на хорионаллантоисной и амниотической оболочках.

Наличие вирусов в жидкостях эмбриона определяют в электронном микроскопе, а чаще в различных реакциях с применением антивирусных сывороток.

Заражение вирусами лабораторных животных. К заражению животных с целью выделить вирусы прибегают в тех случаях, когда вирусы не вызывают цитопатического действия в культурах клеток и не размножаются в куриных эмбрионах (например, вирусы Коксаки), а также для изучения патогенеза и иммунитета вирусных инфекций.

Контрольныевопросы

1. Способы выращивания и дифференциации риккетсий. 2. Получение трипсинизированных культур клеток. 3. Перевиваемые культуры клеток. 4. Понятие о культуре клеток, об основных ингредиентах питательных сред, предназначенных для выращивания культур клеток. 5. Заражение культур ткани исследуемым материалом. 6. Методы заражения куриных эмбрионов вирусами. 7. С какой целью заражают лабораторных животных?

Заданиядля самостоятельной работы

1.Ознакомление с принципами культивирования клеток тканей, используемых в вирусологии. 2.Получение трипсинизированной однослойной культуры фибробластов. 3. Микроскопия и зарисовка препаратов различных видов культур клеток. 4. Заражение вирусосодержащим материалом куриных эмбрионов и их вскрытие.

Действие физических, химических и биологических факторов на микроорганизмы

Факторы внешней среды в зависимости от дозы, длины волны (УФ-лучи) и времени воздействия угнетают или, наоборот, стимулируют жизнедеятельность микроорганизмов.

Физические факторы. Высокая температура уничтожает микроорганизмы (см. методы стерилизации), высушивание тоже губитель для большинства из них. Такое же влияние на микроорганизмы оказывают и высокие дозы излучения. Ультрафиолетовые лучи обладают большим антимикробным действием, чем солнечные, и по бактерицидному эффекту в диапазоне длины волны 230-330 мкм превосходят даже ионизирующее излучение. В связи с этим они широко используются для дезинфекции воздуха в операционных, палатах родильных домов, больничных и лабораторных боксах.

Несколько меньшим микробоцидным действием обладает ультразвук. Практическое применение нашли ультразвуковые волны с частотой колебаний 20 000 Гц и более в секунду для консервации продуктов. Антибактериальное действие обнаружено и у аэроионов: большее - у отрицательно заряженных, меньшее - у несущих положительный заряд.

29

Химические вещества. В больших концентрациях ряд химических веществ используют как дезинфицирующие средства. К ним принадлежат мыла (детергенты), фенол, крезол и их производные, хлорамин, хлорная известь, формальдегид. Сублетальные дозы этих веществ вызывают изменчивость бактерий, а микродозы стимулируют бактериальный рост.

Биологические факторы. В природных условиях микроорганизмы находятся в ассоциациях и между ними складываются различные биоценотические взаимоотношения - от антагонизма до синергизма, в основе которых лежит способность одних из них продуцировать метаболиты-ингибиторы, а других - стимуляторы роста.

Бактерии-антагонисты и синергисты выделяются методом "скученных пластинок". С этой целью, например, густую взвесь почвы высевают на поверхность МПА в чашки Петри. На фоне скученного роста вокруг колоний антагонистов наблюдаются зоны задержки роста, вокруг синергистов - более пышный рост бактерий. Продукты метаболизма бактерийантагонистов (в частности, антибиотики почвенных видов актиномицетов) подавляют многие патогенные бактерии и широко применяются в лечении инфекционных заболеваний.

Активность выделенного антагониста определяют, засевая су точную бульонную культуру полоской вдоль всей середины чашки Петри с МПА. Спустя сутки после инкубирования в термостате, перпендикулярно к выросшей агаровой культуре подсевают тест-микробы (например, стафилококк, эшерихии) и чашки Петри снова помещают в термостат. Посев антагониста и тест-культур с одинаковым темпом роста производят одновременно. Учет результатов регистрируют на следующие сутки, измеряя зоны задержки роста тестбактерий. Контролем служат заведомо чувствительные и устойчивые штаммы одноименных бактерий.

30