Лагун, Жаворонок (2012)_Молек.выявл.антибиотикорезистентности

Лагун Л.В.1, Жаворонок СВ.2 1 Гомельский государственный медицинский университет, Гомель, Беларусь

белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Беларусь

Молекулярнотенетическая технология выявления резистентности энтеробактерий кбета-лактамным антибиотикам на основе геноиндикации бета-лактамаз расширенного спектра1

УДК 579.25:616.61 -002.3]:575

Поступила в редакцию 26.03.2012 г.

Контакты:

e-mail: [e-mail]

Резюме

В статье представлена информация о геноиндикации р-лактамаз расширенного спектра различных классов у возбудителей с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Бета-лактамазная активность расширенного спектра у клинических изолятов энтеробакте­ рий - возбудителей пиелонефритов - опосредована наличием генов CTX-M.

Наличие генов бета-лактамаз других типов (ТЕМ, SHV), как правило, не связано с расшире­ нием бета-лактамазной активности.

Ключевыеслова:(3-лактамазырасширенногоспектра,геноиндикация, возбудители пиело­ нефритов.

1Работа выполнена при поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследова­ ний в рамках гранта БРФФИ Б08М-128.

74

Оригинальные исследования / Молекулярная генетика Ш

• ВВЕДЕНИЕ

Энтеробактерии, главным образом Escherichia coli, а также Proteus	Неблагоприятное
mirabilis и Klepsiella pneumoniae, рассматриваются как возбудители	течение заболевания
ряда заболеваний внутренних органов, в том числе пиелонефрита, ши-	обычно связывается
роко распространенного среди взрослых и детей, характеризующегося	с недостаточной
большой длительностью течения, значительной потерей трудоспособ-	антибактериальной
ности и возможным неблагоприятным исходом [1-7].	эффективностью
В последнее время резистентность энтеробактерии к ряду антибио-	используемых
тиков, особенно р-лактамным, приобретает все большее распростра-	в ходе его лечения
нение. Продукция (3-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) - один из	препаратов.
наиболее распространенных и клинически значимых механизмов ре­
зистентности энтеробактерии к современным р-лактамным антибио­
тикам.
Термин «р-лактамазы расширенного спектра» (от англ. extended-
spectrum p-lactamases - ESBL) объединяет большое число бактери­
альных ферментов, которые отличаются способностью расщеплять
оксиимино-р-лактамы (цефалоспорины III-IV поколений и азтреонам),
наряду с пенициллинами и ранними цефалоспоринами, и проявляют
чувствительность к ингибиторам: клавулановой кислоте, сульбактаму и
тазобактаму [8,9].
Стандартные методы определения чувствительности бактерий к ан­
тимикробным препаратам не всегда позволяют выявить истинную ре­
зистентность БЛРС-продуцирующих энтеробактерии к антибиотикам.
Это служит основанием для использования более эффективных мето­
дов выявления устойчивости бактериальной флоры к антибиотикам.
Различные фенотипические методы, применяемые в настоящее время
для обнаружения продукции БЛРС, основаны на эффекте подавления
их активности в отношении оксиимино-р-лактамов в присутствии кла­
вулановой кислоты [10,11].
К сожалению, традиционные микробиологические методы не обе­
спечивают детекции БЛРС у 100% штаммов энтеробактерии. Ситуация
существенно затрудняется в достаточно часто встречающихся случаях
наличия у микроорганизмов нескольких детерминант устойчивости
одновременно.
Успех в решении этой задачи в значительной степени определяет­
ся использованием молекулярно-генетических методов исследования,
основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Их применение позволяет не только выявить наличие генов р-лактамаз,
но и определить классы БЛРС, выявить мутации в различных генах, свя­
занных с формированием антибиотикорезистентности [12-14].
Из изложенного следует, что оптимальная эффективная стратегия
борьбы с антибиотикорезистентностью может быть достигнута путем
отслеживания фенотипов антибиотикорезистентности клинических
изолятов, перекрестной проверки с целью скрининга качества те­
стирования, сбора сведений о генах, приводящих к определенному
фенотипу, оценки значимости этих фенотипов, определения тактики
рациональной и эффективной антибиотикопрофилактики и антибио-
тикотерапии.

«Лабораторная диагностика» № 2 (02), 2012

75

	Молекулярно-генетическая технология выявления резистентности энтеробактерий
	к бета-лактамным антибиотикам на основе геноиндикации бета-лактамаз расширенного спектра
	• ЦЕЛЬ
i	Разработать молекулярно-генетическую технологию определения
	генов антибиотикорезистентности энтеробактерий (БЛРС различных
J	классов - ТЕМ, ОХА, SHV, СТХ-М) у возбудителей пиелонефритов.
	• МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
	Исследование выполнено на материале 115 клинических изолятов
	энтеробактерий (70 - Escherichia coli, 35 - Proteus spp., 10 - Klebsiella
	pneumoniae), выделенных в 2005-2008 гг. из мочи госпитализирован­
	ных пациентов с острыми и хроническими пиелонефритами в Гомель­
	ской областной клинической больнице.
г	С использованием метода «двойных дисков» осуществлен феноти-
	пический скрининг продукции бета-лактамаз расширенного спектра
•	для исследуемых штаммов микроорганизмов с различными профилями
	резистентности к антибиотикам.
	Для выявления генов БЛРС различных классов (ТЕМ, ОХА, SHV,
	СТХ-М) проведена полимеразная цепная реакция с электрофоретиче-
Ь	ской детекцией продуктов амплификации. Определена групповая при­
	надлежность БЛРС классов ТЕМ и СТХ-М в мультиплексной ПЦР в реаль­

ном времени. Для тестирования отобраны 49 культур энтеробактерий с подтвержденным БЛРС-фенотипом (Е. coli - 29 штаммов, К. pneumo­ niae - 5 штаммов, Proteus spp. - 15 штаммов).

Выделение бактериальной ДНК

Три-четыре колонии из суточной культуры исследуемого микроор­ ганизма, выращенной на Мюллер-Хинтон агаре, переносили в центри­ фужную пробирку, содержащую 500 мкл стерильной деионизированной воды, и суспендировали с помощью шейкера. Микробные клетки осаж­ дали центрифугированием в течение 1 мин при 10 000 об/мин. Супернатант удаляли, добавляли 100 мкл ТЕ-буфера и ресуспендировали осадок шейкером. Пробирки инкубировали в твердотельном термостате в тече­ ние 20 мин при 99°С. После термостатирования образцы повторно под­ вергали центрифугированию в течение 1 мин при 10 000 об/мин. Супернатант в объеме 75 мкл переносили в полистироловые микропробирки и замораживали до проведения ПЦР.

Геноиндикация БЛРС класса ОХА

Определению ОХА-карбапенемаз с БЛРС-активностью (ОХА-23, ОХА-40, ОХА-58) было подвергнуто 49 культур энтеробактерий с под­ твержденным БЛРС-фенотипом.

Реакционную смесь для амплификации участков генов карбапенемаз групп ОХА-23, ОХА-40, ОХА-58 готовили в пересчете на необходимое количество реакций.

Использовали три пары праймеров:

• OXA-58-fwd (5'-GGGCTTGTGCTGAGCATAGT-3') и OXA-58-rev (5'-CGTAGAGCAATATCATCACCAGC-3');

• OXA-40-fwd (5'-GATGAAGCTCAAACACAGGGTG-3') и OXA-40-rev (5'-TTTCCATTAGCTTGCTCCACC-3');

• OXA-23-fwd (5'-TTTCTTTCTGGTTGTACGGTTCA-3') и OXA-23-rev (5'-CATTTCTGACCGCATTTCCA-3').

76

	Оригинальные исследования / Молекулярная генетика Ш
	В качестве контрольных штаммов использовали культуры микроор­	Отдельно вносили
ганизмов, полученные в НИИ антимикробной химиотерапии (Смоленск,		2 мкл образца ДНК
Российская Федерация):		исследуемых
•	A. baumanii RESORT 547 (позитивный контроль, ОХА-23);	и контрольных
•	A. baumanii RESORT 797 (позитивный контроль, ОХА-58);	штаммов (общий объем
•	Е. coli ATCC 25922 (негативный контроль).	реакции составлял
	Амплификация осуществлялась на термоциклере Rotor Gene 3000	25 мкл).

согласно протоколу. Для идентификации продуктов амплификации проводился анализ кривых плавления в режиме 72-94°С (ГС/10 с) с детекцией флуоресценции по SYBR Green I.

Сравнению подлежали кривые плавления опытных образцов с кри­ выми плавления позитивных контрольных штаммов.

Геноиндикация БЛРС класса ТЕМ

Для выявления бета-лактамаз класса ТЕМ с БЛРС-активностью вы­ полнялся анализ мутаций в позициях 104,164,237-240ТЕМ (3-лактамаз. Метод основан на амплификации 3 коротких (50-80 п.н.) фрагментов гена ЫаТЕМ, соответствующих областям кодонов 104, 164 и 237-240, с использованием 3 пар праймеров и 4 зондов, меченых различ­ ными флуорофорами (FAM, R6G, ROX, Су5). Идентификация мутаций в интересующих участках гена осуществлялась на основании оценки температур плавления (Тт) зондов. В качестве контрольных об­ разцов использовались штаммы с известными мутациями в генах ЫаТЕМ.

Реакционную смесь готовили в пересчете на необходимое коли­ чество реакций. Для постановки ПЦР вначале в пробирки помещали нижнюю смесь, затем поверх ее наносили каплю расплавленного вос­ ка и после его застывания - верхнюю смесь. После этого в каждую пробирку для постановки ПЦР добавляли 5 мкл образца ДНК иссле­ дуемых или контрольных штаммов. В качестве контрольных штаммов использовали культуры микроорганизмов, полученные в НИИ анти­ микробной химиотерапии (Смоленск, Российская Федерация):

•Е. coli 197 (позитивный контроль, ТЕМ-1 В);

•Е. coli J53.2 (позитивный контроль, ТЕМ-3:104К, 238S);

•Е. coli J53 (позитивный контроль, ТЕМ-10:164S, 240К);

•Е. coli J53 (позитивный контроль, ТЕМ-11:164Н);

•К. pneumoniae 3151 (позитивный контроль, ТЕМ-68:238S, 240К);

•Е. coli ATCC 25922 (негативный контроль).

Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Амплификацию проводили на термоциклере Rotor Gene 3000 в ва­

рианте «горячего старта».

Для идентификации продуктов амплификации анализировали кри­ вые плавления в режиме 45-80°С (ГС/10 с), с детекцией флуоресцен­ ции по FAM, R6G, ROX, Су5 в автоматическом режиме. Сравнивали кри­ вые плавления опытных образцов с кривыми плавления позитивных контрольных штаммов.

Данный метод позволяет идентифицировать одновременно все известные мутации (7 полиморфизмов в 5 кодонах), связанные с БЛРСактивностью ТЕМ, в одной пробирке за 2 часа.

«Лабораторная диагностика» № 2 (02), 2012

77

Молекулярно-генетическая технология выявления резистентности энтеробактерий к бета-лактамным антибиотикам на основе геноиндикации бета-лактамаз расширенного спектра

		Геноиндикация БЛРС класса SHV
		Амплификация с использованием пары праймеров SHV-1R и SHV-1F
	выполнялась на термоциклере Rotor Gene 3000, с последующей детекци­
	ей продуктов амплификации в гель-электрофорезе. Проводилось сопо­
	ставление ампликонов контрольных и опытных образцов ДНК по молеку­
	лярной массе. В качестве контролей использовали штаммы из коллекции
	НИИ антимикробной химиотерапии (Смоленск, Российская Федерация):
	•	Е. coll ATCC 25922 (негативный контроль);
	• К. pneumoniae ATCC 700603 (позитивный контроль, SHV-18);
	• Е. coli DH5a CTA-2 (позитивный контроль, SHV-2);
	•	Е. coli DH5a CTA-8 (позитивный контроль, SHV-8);
	•	Е. cloacae RESORT 555 (позитивный контроль, SHV-5).
		Для типирования БЛРС класса SHV использовалась мультиплексная
	ПЦР с последующей оценкой температур плавления зондов, позволя­
	ющая выявлять точечные мутации, придающие расширенный спектр
	бета-лактамазной активности в кодонах 179 и 238-240 Ыа5т/-генов. Диф­
	ференциация мутаций, соответствующих аминокислотным заменам в
Сравнению подлежали	кодонах D179-^G/N/A, G238^S/A и Е240^>К, осуществлялась с помо­
кривые плавления	щью двух зондов, меченых различными флуорофорами: R6G (кодон 179)
опытных образцов	и FAM (кодоны 238-240).
с кривыми плавления		Идентификация продуктов амплификации проводилась на основе
позитивных	анализа кривых плавления в режиме 45-85°С (ГС/10 с), с детекцией
контрольных штаммов.	флуоресценции по FAM и R6G в автоматическом режиме.

Геноиндикация БЛРС класса СТХ-М

В качестве контролей были использованы следующие штаммы микроорганизмов: Е. coli ТОРЮ/Sty (СТХ-М-5, позитивный контроль); Е. coli RESORT 1224 (СТХ-М-3, позитивный контроль); Е. coli RESORT 333 (СТХ-М-14, позитивный контроль); С. amalonaticus Rio-2 (CTX-M-8, пози­ тивный контроль); Е. coli ATCC 25922 (негативный контроль).

Для ПЦР-амплификации генов СТХ-М применялся общий для всех типов СТХ-М прямой праймер CTX-M-Fext и два обратных праймера: CTX-M(1-2)-Rnest, специфичный для генов СТХ-М-1- и СТХ-М-2-род- ственных ферментов, и CTX-M-R1c, специфичный для генов СТХ-М-8/25- и СТХ-М-9-родственных ферментов.

		Структура праймеров:
	•	CTX-M-Fext (5'-TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA-3');
	•	CTX-M-R1 с (5'-CCGCTGCCGGTCTTATC-3');
	•	CTX-M0 -2)-RNest (5'-TGATCTCAACGCGCTGATTTA-3').
		Реакционную смесь готовили в пересчете на необходимое коли­
	чество реакций. Вначале вносили в пробирки для ПЦР нижнюю смесь,
	затем поверх ее каплю расплавленного воска и после его застывания -
Общий объем смеси -	верхнюю смесь. После этого в каждую пробирку для ПЦР добавляли
25 мкл.	2,5 мкл образца ДНК исследуемых или контрольных штаммов.
		Амплификация была проведена на термоциклере Rotor Gene 3000 в
	варианте «горячего старта».
		Детекция продуктов амплификации ДНК контрольных и опытных
	штаммов выполнялась с использованием гель-электрофореза. Для
	определения групп СТХ-М генов было проведено сопоставление и диф-

ференцировка ампликонов контрольных и опытных образцов ДНК по молекулярным массам, приведенным в табл.

78

Оригинальные исследования / Молекулярная генетика 11

Таблица Размер ампликонов для генов СТХ-М различных кластеров

СТХ-М группа (кластер)	Длина ПЦР-продукта, п.н.
СТХ-М-1	97
СТХ-М-2	97
СТХ-М-8/25	518
СТХ-М-9	518

Дополнительно для дифференциации представителей генетиче­ ских кластеров СТХ-М-1 и СТХ-М-2, СТХ-М-8/25 и СТХ-М-9 выполнял­ ся анализ температур плавления ПЦР-продуктов (СТХ-М-1 - 82,8°С, СТХ-М-2 - 84,3°С, СТХ-М-8/25 - 89,3°С, СТХ-М-9 - 90,7°С) с детекцией флуоресценции по SYBR Green I.

• РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Геноиндикация БЛРС класса ОХА

Результаты определения ОХА-БЛРС представлены на рис. 1. Выяв­ лены гены БЛРС ОХА-23 (ампликон размером 723 пар нуклеотидов) и ОХА-58 (ампликон размером 723 пар нуклеотидов) у соответствующих контрольных штаммов A. baumanii. Ни в одном из представителей 49 ис­ следованных штаммов, как и в негативном контроле, Е. coli ATCC 25922 бета-лактамазы расширенного спектра класса ОХА обнаружены не были (ОХА-).

Из полученных результатов следует, что выявленная скрининговым фенотипическим методом БЛРС-активность исследуемых штаммов не была обусловлена наличием ОХА-генов.

Norm. Fluoro.	dF/dT
0,65 I	I

5	10	15	20	25	30	Cycle	Threshold ?5	8Q	g5	gQ	deg
			А						В
Рис. 1. Кривые амплификации (А) и плавления (В) участков генов ЫаОХА-23 (723 п.н.)
и ЫаОХА-58 (738 п.н.)
«Лабораторная диагностика» № 2 (02), 2012											79

Молекулярнотенетическая технология выявления резистентности энтеробактерий к бета-лактамным антибиотикам на основе геноиндикации бета-лактамаз расширенного спектра

Рис. 2. Анализ кривых плавления для идентификации БЛРС-мутаций в 164 позиции гена Ыа

Геноиндикация БЛРС класса ТЕМ

Результаты определения мутаций в 164 позиции гена ЫаТЕМ/ придаю­ щими БЛРС-активность, представлены на рис. 2.

При анализе кривых плавления выявлены нуклеотидные замены в этой позиции гена ЫаТЕМ только для контрольных штаммов Е. coli J53 (ТЕМ-10: 164S), Е. coli J53 (ТЕМ-11: 164Н). У 34 из 49 исследуемых штам­ мов также амплифицировался участок гена ЫаТЕМ/ однако нуклеотидных замен в 164 позиции, придающих БЛРС-активность, установлено не было (WT, дикий тип).

Результаты определения мутаций в 237-240 позициях гена ЫаТЕМ, придающих БЛРС-активность, представлены на рис. 3.

При анализе кривых плавления нуклеотидные замены в этой пози­ ции гена ЫаТЕМ выявлены только для трех контрольных штаммов: Е. coli J53.2 (ТЕМ-3:238S), Е. coli J53 (ТЕМ-10:240К), К. pneumoniae 3151 (ТЕМ-68: 238S, 240К).

У 38 из 49 исследуемых штаммов также амплифицировался данный участок гена ЫаТЕМ, однако нуклеотидных замен в позициях 237-240, придающих БЛРС-активность, выявлено не было (WT, дикий тип).

Результаты определения мутаций в 104 позиции гена ЫаТЕМ, придаю­

щими БЛРС-активность, представлены на рис. 4.
При анализе кривых плавления выявлены						нуклеотидные	заме­
ны в	этой	позиции гена	ЫаТЕМ	только для контрольного штамма
Е. coli	J53.2	(ТЕМ-3: 104К).	У 38	из 49	исследуемых штаммов		также
амплифицировался участок			гена	ЫаТЕМ,	однако	нуклеотидных	замен

в 104 позиции, придающих БЛРС-активность, выявлено не было (WT, ди­ кий тип).

80

Оригинальные исследования / Молекулярная генетика Ш

Рис. 3. Анализ кривых плавления для идентификации БЛРС-мутаций в 237-240 позициях гена ЫаТ[

Рис. 4. Анализ кривых плавления для идентификации БЛРС-мутаций в 104 позиции гена Ыат,

«Лабораторная диагностика» № 2 (02), 2012

81

Молекулярно-генетическая технология выявления резистентности энтеробактерий кбета-лактамным антибиотикам на основе геноиндикации бета-лактамаз расширенного спектра

Таким образом, выявленные у 38 исследуемых изолятов гены ЫаТЕМ не имели нуклеотидных замен, придающих расширенную бета-лакта- мазную активность (WT, дикий тип), что позволило отнести их к генети­

	ческой группе ТЕМ-1.
	Геноиндикация БЛРС класса SHV
	ПЦР-детекция бета-лактамаз SHV-типа осуществлена для 29 штам­
	мов Е. coli, 15 штаммов Proteus spp. и 5 штаммов К. pneumoniae, у кото­
	рых с помощью метода «двойных дисков» ранее был определен БЛРС-
	фенотип. Также в исследование включены 5 штаммов К. pneumoniae и
	15 штаммов E.coli без БЛРС-активности.
	У всех представителей позитивных контролей (Е. coli DH5a CTA-2,
	Е. coli DH5a CTA-8, E. cloacae RESORT 555) выявлен продукт амплифи­
	кации размером около 260 п.н. Аналогичный ампликон обнаружен и у
	всех опытных БЛРС-позитивных штаммов К. pneumoniae и 4-х штаммов
	К. pneumoniae без определяемой фенотипическими методами БЛРС-
	активности. У всех исследованных штаммов Proteus spp. и Е. coli (неза­
	висимо от наличия или отсутствия фенотипически определяемой БЛРС-
	активности) гены blaSHV не детектировались. Не выявлены продукты
	амплификации и в негативном контроле Е. coli ATCC 25922.
Большинство БЛРС	Проведенное исследование позволило установить наличие
класса SHV являются	Ыа5НУ-генов как у БЛРС-позитивных, так и БЛРС-негативных штаммов

производными SHV-1, К. pneumoniae. Данный факт можно объяснить присутствием у БЛРС-

детерминирующие	негативных штаммов плазмидно-кодируемой пенициллиназы SHV-1,
их гены отличаются	не обладающей расширенным спектром активности в отношении бета-
от гена blaSHV-1	лактамных антибиотиков. Большинство БЛРС класса SHV являются про-
единичными	изводными SHV-1, детерминирующие их гены отличаются от гена blaSHV-1
точечными мутациями	единичными точечными мутациями в 149,156,179, 238 и 240 позициях,
в 149,156,179,238	а единичные аминокислотные замены расширяют спектр ферментатив-
и 240 позициях,	ной активности.
а единичные	Анализ кривых плавления зондов не выявил точечных мутаций в
аминокислотные	анализируемых кодонах (179, 238-240) Ыа5НУ-генов исследуемых штам-
замены	мов клебсиелл (WT, дикий тип).
расширяют спектр	Таким образом, обнаруженные у 5 штаммов К. pneumoniae blaSHV-
ферментативной	гены относятся к генетической группе SHV-1 (плазмидно-кодируемые
активности.	пенициллиназы SHV-1, не обладающие расширенным спектром актив­
	ности в отношении бета-лактамных антибиотиков).
	Геноиндикация БЛРС класса СТХ-М
	У14 штаммов Е. coli, 8 штаммов P. mirabilis и 5 штаммов К. pneumoniae
	выявлен продукт амплификации длиной около 97 п.н. с температу­
	рой плавления около 82,8-83,0°С. Аналогичный ПЦР-продукт ампли-
	фицировался для позитивного контроля Е. coli RESORT 1224 (СТХ-М-3,
	генетическая группа СТХ-М-1). У 2 штаммов Е. coli обнаружен продукт
	амплификации длиной 518 п.н. с температурой плавления около 91 °С.
	Аналогичный ПЦР-продукт амплифицировался для позитивного кон­
	троля Е. coli RESORT 333 (СТХ-М-14, генетическая группа СТХ-М-9).
	У контрольного штамма энтеробактерий Е. coli ТОРЮ/Sty (СТХ-М-5,
	генетическая группа СТХ-М-2) выявлен продукт амплификации длиной
	97 п.н. с температурой плавления 84,5°С. Для штамма С. amalonaticus

82

Оригинальные исследования / Молекулярная генетика 11

Norm. Fluoro.

0,9						, . - " • " "
0,85						/
0,8					/
0,75
0,7						_
0,65	СТХ-М+
0,6
0,55						"
0,5			<
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25					стх-м-
0,2
0,15						1
0,1
	Threshold					t
0,05
	10	15	20			25

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

СТХ-М-1		СТХ-М-2
	/	_	СТХ-М-8
		А		СТХ-М-9
/		/ ^		f ч
//		\	/		^
/	1
1	'		/		^
1 /		^
			/		\
/		\			\
^Ц^—~" 1Г_1ГГ-С'Л			"* " *

/

Threshold	. — - _ _
	deg

Рис. 5. Кривые амплификации (А) и плавления (В) участков генов Ыас т х .м контрольных и опытных штаммов

Rio-2 (СТХ-М-8) характерен продукт амплификации длиной 518 п.н. с температурой плавления 89,5°С. Не выявлены продукты амплификации в негативном контроле Е. coli ATCC 25922 (рис. 5).

Проведенное исследование позволило установить присутствие Ыастх.м-генов двух генетических кластеров (СТХ-М-1 и СТХ-М-9) среди штаммов Е. coli, P. mirabilis и К. pneumoniae с подтвержденной фенотипической БЛРС-активностью.

• выводы

1.Показано, что определяемая скрининговым фенотипическим мето­ дом БЛРС-активность исследуемых штаммов не обусловлена нали­ чием ОХА-генов.

2.Выявлено присутствие Ыастх-генов двух генетических кластеров (СТХ-М-1 и СТХ-М-9) среди штаммов Е. coli, P. mirabilis и К. pneumoniae

сподтвержденной фенотипической БЛРС-активностью.

3.Обнаружение генов SHV и ТЕМ не является однозначным свидетель­ ством БЛРС-активности и требует анализа наличия точечных мута­ ций в позициях, увеличивающих спектр активности в отношении цефалоспоринов III-IV поколений.

4.Разработанная технология молекулярно-генетического исследова­ ния, базирующаяся на обнаружении нуклеотидных замен в генах SHV и ТЕМ с использованием зондовых методик и анализа кривых плавления, может быть использована в качестве подтверждающего метода в лабораториях молекулярной генетики для выявления рас­ ширенной бета-лактамазной активности, обусловливающей антибиотикорезистентность.

5.Полученные результаты исследования заслуживают повседневного использования как в работе лечебных учреждений и лабораторий клинической микробиологии, так и для проведения референтных исследований в лабораториях молекулярной генетики.

«Лабораторная диагностика» № 2 (02), 2012