Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

Семенихина и др. (2007)_Современ. методы микробиол. исследований

.pdf
Скачиваний:
40
Добавлен:
13.02.2016
Размер:
1.25 Mб
Скачать

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Учебно-методическое пособие для вузов

Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета

2007

Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 26 апреля 2007 г., протокол № 8

Составители: А.В. Семенихина, Т.И. Рахманова, Г.И. Нехаева, Т.Н. Попова

Научный редактор доц. М.Ю. Грабович

Практическое пособие подготовлено на кафедре аналитической и медицинской биохимии и микробиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Рекомендуется для студентов 3, 4 курсов дневного и 4, 5 курсов вечернего отделения биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Для специальности: 011600 (020201) – Биология

2

СОДЕРЖАНИЕ

 

Введение .............................................................................................................

3

Тема 1. Иммунологические методы в микробиологической диагностике ..

5

Тема 2. Молекулярно-генетические методы в микробиологической

 

диагностике .......................................................................................................

34

Литература .......................................................................................................

66

ВВЕДЕНИЕ

Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удастся ли обнаружить специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов. Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. Следовательно, для выявления микроорганизмов требуется рутинная практика культивирования, причем таким образом возможна идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК.

Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм или молекулу-мишень, чувствительный — обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для практического применения.

3

Таблица 1 Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных

заболеваний, вызванных паразитическими микроорганизмами

Метод

 

Преимущества

 

Недостатки

 

Mикроскопи-

 

Простота.

 

 

Трудоемкость,

 

 

ческое

 

Прямое

выявление

длительность.

 

 

исследование

 

паразитических

 

Низкая

 

 

 

 

 

микроорганизмов.

 

чувствительность.

 

 

 

Возможность

разграничения

Невозможность

 

 

 

микроорганизмов

по

разграничения

сходных

 

 

морфологическим признакам

микроорганизмов.

 

 

 

 

 

 

Необходимость высокой

 

 

 

 

 

квалификации

для

 

 

 

 

 

интерпретации

 

 

 

 

 

 

 

результатов

 

 

 

Культивирова-

Обнаружение

 

только

Длительность

 

анализа,

ние in vitro

и

жизнеспособных

 

высокаястоимость.

 

иммунизация

 

паразитических

 

Потеря

 

 

 

мышей

 

микроорганизмов.

 

жизнеспособности

в

 

 

Возможность

определения

организме

животного.

 

 

вирулентности

 

и

Невозможность

 

 

 

инфекционности

 

использования

разных

 

 

 

 

 

животных.

 

 

 

 

 

 

 

 

Использованиеживотных

Определение

 

Простота,

 

 

Не всегда специфичен.

 

антител

в

непродолжительность

 

Невозможность

 

сыворотке

 

анализа.

 

 

разграничения

острой

и

 

 

Возможность автоматизации.

латентной

 

форм

 

 

Возможность

тестирования

инфекции

 

 

 

 

 

большого числа образцов

 

 

 

 

Гибридизация

 

Быстрота,

высокие

Высокая

 

стоимость

и ПЦР

 

чувствительность

и

анализов,

 

 

 

 

 

специфичность.

 

многоэтапность.

 

 

 

Прямое

обнаружение

Невозможность

 

 

 

паразитических

 

 

различить

живые

и

 

 

микроорганизмов.

 

мертвые

 

 

 

 

 

Возможность

разграничения

микроорганизмы.

 

 

 

разныхвидов.

 

 

Возможность получения

 

 

Независимость результатов от

ложноположительных

и

 

 

предыдущихинфекций.

 

ложноотрицательных

 

 

 

Не требуют жизнеспособности

результатов

 

 

 

 

 

паразитов.

 

 

 

 

 

 

 

 

Возможностьавтоматизации

 

 

 

 

4

ТЕМА 1. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки и мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов. Применение данных систем возможно при условии, что анализируемый компонент должен обладать свойствами антигена, то есть способностью вызывать в организме человека или животных синтез особых белков – антител, с высокой специфичностью связывающих антиген.

В качестве антигена могут быть клетки микроорганизмов, вирусы, белки и полисахариды. Это полноценные антигены. Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности – антигенным детерминантам (эпитопам). Такие участки у белков включают не менее пяти аминокислотных остатков. Антигенные детерминанты разветвленных молекул полисахаридов представлены цепочками из четырех-шести остатков. Существуют также неполноценные антигены – гаптены. Антитела к гаптенам образуются лишь при их посадке на полимерную матрицу, в качестве которой используются белки, полимеры клеточных стенок бактерий, синтетические полиэлектролиты. Таким способом можно получить антитела к антибиотикам и другим лекарственным соединениям, стероидным и пептидным гормонам, витаминам, пестицидам и т. д. Гаптены представлены не только низкомолекулярными соединениями. Так, нуклеиновые кислоты сами по себе неиммуногенны. Однако антитела к нуклеиновым кислотам синтезируются, если они находятся в комплексе с белками. Антигенные детерминанты нуклеиновых кислот – три- и тетрануклеотиды.

Выделение и очистка антигена для создания диагностикума достаточно трудоемкий процесс. В настоящее время данные задачи решаются с помощью методов биотехнологии путем создания генноинженерных (трансгенных) бактерий или дрожжей, синтезирующих антиген в необходимых количествах.

Иммунный ответ на введение одного антигена сопровождается синтезом антител, различающихся по структуре и функциональному предназначению. Это иммуноглобулины (Ig) классов G, D, E, A, M, из которых первые три могут связать по две молекулы антигена, то есть двухвалентны, IgA – четырехили восьмивалентны, IgM – десятивалентны. С учетом того, что антиген, используемый для иммунизации животного, содержит не одну, а несколько антигенных

5

детерминант, можно представить, какое множество антител вырабатывается в организме на введение одного антигена. Такие антитела называются поликлональными. Они гетерогенны по сродству к антигенам. Их состав непостоянен и зависит от вида животного, его генетических особенностей и физиологического состояния.

Антитела получают в лабораторных условиях путем иммунизации следующих животных соответствующим антигеном: мыши, морские свинки, кролики, овцы, козы, лошади. Пригодны куры: антитела после иммунизации выделяют из желтков яиц.

Для очистки и стандартизации поликлональных антител используется аффинная хроматография. Сыворотка крови от иммунизированного животного пропускается через колонку с полисахаридным носителем, к которому ковалентно пришит антиген. Специфические антитела связываются антигеном, все другие белки, в том числе антитела с низким сродством к антигену, проходят через колонку, вслед за этим специфически связанные антитела смывают с колонки кислым или щелочным раствором: связь антигена с антителом нековалентна. Один цикл аффинной хроматографии позволяет очистить белки в 1000 раз и более.

Однако даже такой способ очистки не позволяет полностью избавиться от гетерогенности препарата антител. Антитела с одной специфичностью, реагирующие с единственной антигенной детерминантой (моноклональные), получают методами клеточной инженерии путем гибридизации иммунокомпетентных B-лимфоцитов и клеток миеломных опухолей, способных к быстрому размножению, неограниченному числом делений (в отличие от большинства неопухолевых клеток, у которых число делений ограничено). Препараты моноклональных антител характеризуются постоянством состава и физико-химических свойств, низкой вероятностью перекрестной реакции с «чужими» антигенами. Это высокотехнологичный продукт. Его недостаток – зачастую сравнительно низкое сродство к субстрату, низкая аффинность.

Все иммуномикробиологические методы (ИМ) можно разделить на 3 группы:

ИМ, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);

ИМ, основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латексагглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);

6

– ИМ с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы, спиниммунологический и другие методы).

Реакция агглютинации (РА)

Реакция основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы: специфическая фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом – активным центром иммуноглобулина (невидимая фаза); неспецифическая (видимая) фаза – образующийся комплекс

(АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако это явление возможно лишь в электролитной среде, например в 0,85 % растворе натрия хлорида.

РА можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке крови и, наоборот, при помощи стандартной агглютинирующей сыворотки можно идентифицировать выделенные микробы.

Ориентировочная РА для идентификации микроба

Реакция служит для предварительного определения вида микроба. На предметное стекло наносят каплю узкоспецифичной адсорбированной сыворотки (т. е. сыворотку, содержащую только специфические антитела). Сыворотку разводят 1 : 10 и рядом наносят каплю физиологического раствора (контроль). Исследуемую культуру микроба петлей вносят в обе капли и размешивают. Через 2–4 мин учитывают результат. При положительной реакции (соответствие исследуемой культуры диагностической сыворотке) наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной жидкости. В контроле – равномерная муть.

Кроме специфической агглютинации бактерий, вызванной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию дают L-формы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в результате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне также происходит склеивание – наступает «кислотная» агглютинация. Чтобы исключить возможность учета ложноположительных результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с изотоническим раствором хлорида натрия.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

РНГА является своеобразной модификацией РА. Сущность реакции состоит в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности эритроцитов. Такие «нагруженные» антигенами эритроциты приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для данного антигена. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат. В последнее время РНГА получила

7

широкое распространение благодаря высокой чувствительности, экспрессивности и простоте постановки.

В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных двукратных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроль). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном – оседают в виде пуговки или колечка (табл. 2).

Таблица 2

Постановка реакции непрямой гемагглютинации

Ингредиенты

 

 

Номера лунок панели

 

Контроли

 

 

1-я

2-я

3-я

4-я

5-я

1-й

2-й

Изотонический

 

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

 

0,5

раствор натрия

 

 

 

 

 

 

 

хлорида, мл

 

 

 

 

 

 

 

 

Исследуемая

 

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Иммунный

 

сыворотка

в

 

 

 

 

 

диагнос-

 

разведении

 

 

 

 

 

 

тикум 0,5

 

1 : 25, мл

 

 

 

 

 

 

 

 

Полученное

 

1 : 5

1 : 10

1 : 20

1 : 400

1 : 800

 

 

разведение

 

0

0

0

 

 

 

 

сыворотки

 

 

 

 

 

 

 

 

Эритроцитарны

 

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

й диагностикум,

 

 

 

 

 

 

 

мл

 

 

 

 

 

 

 

 

Инкубация при 37

°С в

течение 2

ч в термостате

 

 

 

Титр сыворотки 1 : 100.

На эритроцитах можно адсорбировать не только антигены, но и антитела. В данном случае РНГА можно применять для индикации патогенных микробов во внешней среде. Для этого IgG сыворотки фиксируют на поверхности эритроцитов барана. Разрешающая способность экспресс-индикации антигенов составляет несколько тысяч микробных тел в 1 мл.

Задания для выполнения лабораторной работы

1.Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью идентификации изучаемых чистых культур бактерий. Сделать заключение по результатам реакции.

2.Протоколировать и оценить результаты реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), поставленной с целью серодиагностики. Сделать заключение по результатам реакции.

8

Наряду с представленными выше методами в микробиологической диагностике используют следующие иммунологические методы: реакция преципитации в геле, лизиса, связывания комплемента, Кумбса, флоккуляции, антистрептолизиновая, торможения гемагглютинации, принципы которых представлены далее.

Так, в основе реакции преципитации в геле лежит иммунодиффузия в агаровом геле растворов антигенов и антител, залитых в разные лунки, навстречу друг другу в случаях соответствия их специфичности, что приводит к образованию специфического преципитата в виде полосок и дуг в местах встречи реагентов. Как правило, в центральную лунку заливают стандартный раствор антигена, а в периферические – испытуемые сыворотки.

Для постановки реакции лизиса и реакции связывания комплемента (РСК) используют комплемент, который содержится в сыворотке крови морских свинок. Гемолитическая активность комплемента термолабильна и полностью утрачивается при прогревании сыворотки в течение 30 мин при 56 °С. При адсорбции комплемента на комплексе антиген-антитело его действие проявляется реакцией лизиса антигена, если антиген корпускулярный, или не сопровождается никакими видимыми изменениями, если это мелкодисперсные или растворимые антигены.

Для учета результатов РСК вводят вспомогательную (индикаторную) гемолитическую систему. Она состоит из взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика, полученной путем его иммунизации упомянутыми эритроцитами. Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вследствие адсорбции комплемента системой антиген-антитело. Отрицательная РСК характеризуется наличием гемолиза, поскольку свободный комплемент связывается с системой эритроциты барана - гемолитическая сыворотка кролика. РСК обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать ее для серодиагностики многих заболеваний.

Для постановки РСК требуется точное определение количественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента, гемолитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. Поэтому постановке основного опыта предшествует титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения, титрование других ингредиентов.

В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя («инициальная») флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.

Антистрептолизиновая реакция основана на феномене нейтрализации гемолитического действия микробного токсина (О-стрептолизина)

9

антитоксическими антителами иммунной сыворотки.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на том, что при взаимодействии вирусных антигенов (гемагглютининов) со специфическими антителами иммунной сыворотки происходит блокирование (нейтрализация) гемагглютинирующей способности вируса, т. е. торможение гемагглютинации.

Развернутая РТГА проводится в лунках пластмассовых пластин. При положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями.

Иммуноферментный анализ

Одним из наиболее чувствительных методов выявления антител считается иммуноферментный анализ (ИФА), который не уступает по чувствительности радиоиммунному анализу (РИА) и в то же время отличается от него большей доступностью для обычных диагностических лабораторий. Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа (от нескольких минут до нескольких часов), возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке

иконцентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. Поэтому сегодня ИФА находит широкое применение в здравоохранении, различных областях сельского хозяйства, промышленной биотехнологии, природоохранной деятельности и научно-исследовательской работе.

Любое заболевание человека и животных можно быстро и точно диагносцировать путем идентификации возбудителя, его отдельных антигенных компонентов, антител к этим компонентам или веществ, не свойственных здоровому организму и синтезируемых при его патологических состояниях (рак, сердечно-сосудистые и эндокринные заболевания). Диспансеризация населения, эпидемиологические обследования, выявление отравлений, наличия наркотиков в крови, определение содержания лекарственных соединений в тканях, вирусные заболевания растений, определение антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений при отборе активных штаммовпродуцентов в промышленной биотехнологии, контроль за качеством медицинских препаратов из донорской крови на отсутствие вирусоввозбудителей СПИДа и гепатита B – это лишь небольшой перечень практического применения ИФА. Современные фундаментальные исследования в биохимии, клеточной физиологии и иммунологии, микробиологии, вирусологии, онкологии трудно представить без ИФА. Реагенты для проведения ИФА сегодня стали коммерческими продуктами

имогут быть приобретены по каталогам известных фирм.

10