Руководство по иммунофармакологии / 013306

20	Глава 2
на один рецептор приходится один цвет, что				валентных антигенов. Ключом к пониманию
свидетельствует об одновалентности IgE-pe-				стимуляции тучных клеток и базофилов, ве-
цептора.				роятно, является представление о поперечном
В другой серии экспериментов определялось				сшивании двух соседних Fc-e-рецепторов на
время	восстановления флюоресценции после			мембране. Для доказательства этого могут быть
облучения лазером мембран тучных клеток,				применены разные методы, схематически
несущих флюоресцеин-IgE и родамин-IgE.				представленные на рис. 8. Бивалентные или
Иммобилизация флюоресцеин-IgE антителами				многовалентные антигены вызывают попереч-
предотвращала восстановление зеленой флю-				ное сшивание соседних IgE-молекул через их
оресценции и не влияла на красную. Это иссле-				Fab-фрагменты (рис. 8, в), вызывая агрегацию
дование подтверждает положение об однова-				Fc-рецепторов клеточных мембран. Анти-IgE,
лентной природе связывания IgE-рецептор и				антитела класса IgG к Fc-e-тяжелых цепей IgE,
отвергает любое взаимодействие типа рецептор-				агрегируют рецепторы, как показано на рис. 8, г.
рецептор.		Скорость	восстановления	Fc- и Fab'-фрагменты этого анти-IgE, будучи
флюоресценции в облученной зоне мембраны				одновалентными, не активны. Лектин-конка-
может быть использована для определения				навалин А активирует тучные клетки и базо-
коэффициента диффузии рецептора в мембране.				филы, присоединяясь к IgE-связанным угле-
Он оказался равным 2-10-			см2/сн, что очень	водам и сшивая соседние молекулы иммуно-
близко к значению коэффициента для				глобулина (см. рис. 8,д). Димеры IgE, полу-
липидного маркера в той же мембране-8-10-9				ченные химическим путем, вызывают попереч-
см2/сн; это указывает на жидкую природу				ное сшивание IgE-рецепторов. Очень изящно
мембран тучных клеток при физиологической				была показана возможность активации тучных
температуре.				клеток при агрегации Fc-рецепторов даже в
				отсутствие IgE. Это было достигнуто с по-
				мощью антител (IgG) к очищенным Fc-рецеп-
Активациямембранногорецептора				торам. Действие этих антител схематически
				представлено на рис. 8, ж. Но если IgE занимает
Простое связывание молекулы IgE с Fc-e-pe-				рецепторы (т.е. места, на которые направлено
				действие антирецепторных антител), тем самым
цептором тучной клетки или базофильного				маскируя их, то антирецепторные антитела не
лейкоцита не активирует клетку и не приводит к				могут вызвать поперечное сшивание Fc-e-
выделению гистамина или других активных				рецепторов.
веществ. Для активации необходимо присо-				Модель поперечного сшивания рецепторов
единение специфического антигена к IgE, фик-				при активации тучных клеток и базофилов
сированному на клетке.				рождает ряд интересных вопросов. Во-первых,
Не активируют клетку и одновалентные				если мембрана жидкая и Fc-e-рецепторы дви-
антигены: выделение гистамина и других фар-				гаются в ней свободно, то предусматривается
макологически		активных веществ происходит		(моделью) определенная частота рецепторных
только под действием бивалентных и много-				событий, которые могут быть соотнесены со

Мембранатучной клетки

Поперечное сшивание

Рис. 8. Различные способы поперечного

сшивания Fсe-рецепторов тучных клеток Антитело или базофилов.

Тучные клетки и базофильные лейкоциты

21

Рис. 9. Зависимость «концентрация-эффект» для выделения гистамина базофилами под действием бивалентного бензилпенициллоилового гаптена (БП02).

Базофилы несут IgE-антитела к БПО. Следует отметить что выделение гистамина после достижения максимума снижается при более высоких концентрациях гаптена

[Dembo и соавт.-J. Immunol., 1978, 121, 354].

Концентрация бивалентного гаптена (М)

спонтанным выделением гистамина, что наб-

секреции

гистамина

количеству

поперечных

людается как у тучных клеток, так и у базо-

сшивок согласуется не со всеми фактами; в ряде

филов. Во-вторых, какова связь между обра-

ситуаций картина представляется гораздо более

зованием поперечных связей и клеточной ак-

сложной. Во-первых, базофилы некоторых

тивацией, оцениваемой по секреции гистамина?

людей неспособны выделять гистамин, несмотря

На рис. 9 показана кривая доза-ответ для

на образование поперечных сшивок (см. ниже).

гистамина, выделяемого базофилами при их

Это может быть связано с отсутствием

стимуляции двухвалентным гаптеном бензил-

сопряжения Fc-рецепторов со вторичными

пенициллоилом (БПО)2. Гаптен является двух-

посредниками (они будут описаны ниже),

валентным, а базофилы несут IgE к гаптену

которые необходимы для переноса информации

БПО. Так как на каждой молекуле IgE су-

от поперечного сшивания к секреторным

ществует два места для распознавания антигена

процессам. Во-вторых, количественные и

(см. главу 1), то антитело взаимодействует с

качественные

характеристики

выделения

двумя группами БПО. По мере повышения

гистамина различаются в зависимости от типа

концентрации

(БПО)2

увеличивается

лиганда, вызывающего образование поперечных

количество поперечных связей между молеку-

сшивок. Например, хотя димеры IgE, вы-

лами IgE, причем они имеют вид IgE БПО-БПО

зывающие

образование поперечных

сшивок

• IgE. Увеличению количества поперечных

только двух Fc-6-рецепторов, представляются

связей соответствует усиление ответа клеток,

достаточным сигналом к клеточной активации,

но до определенного максимума, поскольку

тримеры и более высокие олигомеры иммуно-

количество IgE, фиксированного клеткой, ог-

глобулина служат более эффективным сигналом

раничено.

Если

повышение

концентрации

для тучных клеток и базофилов. Антигены и

(БПО)2

продолжается, то выделение гистамина

анти-IgE способны образовывать мультире-

снижается вследствие уменьшения количества

цепторные агрегаты. В настоящее время связь

поперечных связей при избытке (БПО)2. При-

между размером рецепторного агрегата и выз-

чина заключается в том, что вместо перекрест-

ванным им ответом определена неточно, однако

ных связей типа IgE-БПО-БПО-IgE в условиях

имеются указания на наличие влияния размера

избытка (БПО)2

образуются связи типа IgE-

агрегата. У тучных клеток крыс время

БПО-БПО, которые не вызывают секреции

инактивации, вызванной поливалентным анти-

гистамина.

Термодинамическая

модель

геном овальбумином, невелико (tj/2

= 300 с), а

связывания IgE-(BnO)2 может быть создана, что

время полужизни инактивации после стиму-

четко

соответствует

экспериментальным

ляции димером IgE и анти-IgE составляет 1000 и

данным и свидетельствует в пользу концепции

3500 с соответственно. Видимо, скорость

о пропорциональности секреции гистамина ко-

инактивации

определяется размером

агрегатов

личеству образовавшихся поперечных сшивок.

IgE,

образующихся

при

использовании

Минимальным сигналом к активации тучных

конкретного лиганда. Более того, показаны

клеток служит простое двухмерное связывание

различия

в

медикаментозном

подавлении

двух IgE-рецепторов (см. рис. 8).

секреции гистамина, вызванной антигеном, и

Однако концепция о пропорциональности

секреции гистамина, индуцированной анти-IgE.

3-1134

22 Глава 2

Секрециягистамина

В этом разделе рассматриваются основные этапы активации тучных клеток и базофилов, которая происходит после поперечного сшивания Fc-e-рецепторов и приводит к секреции гистамина.

Кальций

Секреция гистамина тучными клетками и базофилами после антигенной стимуляции зависит от наличия внеклеточного кальция. Оптимальная концентрация кальция-1 мМ. Определенная секреция гистамина наблюдается в отсутствие внеклеточного кальция при стимуляции тучных клеток антигеном и не подавляется хелатами (веществами, связывающими кальций), такими как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) или EGTA [ди- (2-аминоэтокси)-этантетрауксусная кислота].

Зависимость от кальция антигениндуцированного выброса гистамина можно сравнить с участием кальция в сопряжении мембранного возбуждения с мышечным сокращением. Получен ряд данных, которые в своей совокупности свидетельствуют в пользу гипотезы о повышении уровня свободного кальция в цитозоле при агрегации FC-e-рецепторов; увеличение же концентрации кальция в тучных клетках приводит к возрастанию секреции гистамина.

Кальциевый ионофор А23187 может быть использован для переноса иона из внешней среды с высокой концентрацией кальция (1 мМ) внутрь клетки, где концентрация иона низка (0,1 мкМ); таким образом, его внутриклеточная концентрация повышается. В тучных клетках и базофилах А23187 вызывает кальцийзависимую секрецию гистамина. Сходные результаты получены при использовании другого ионофора, иономицина, что подтверждает роль вхождения кальция в тучные клетки и базофилы при индукции секреции гистамина. В клетках, стимулированных антигеном, ионофоры могут вызвать ограниченную секрецию гистамина и в отсутствие внеклеточного кальция. Это объясняется высвобождением кальция из внутренних депо тучных клеток и базофилов.

С помощью химических методов можно повысить проницаемость клеточных мембран для ионов и небольших молекул. После этого концентрацию внутриклеточного кальция можно контролировать извне кальциевыми буфер-

ными растворами. При использовании такого экспериментального подхода было показано, что секреция гистамина индуцируется возрастанием уровня внутриклеточного кальция с 0,1 мкМ до 1 мкМ.

Более прямые доказательства роли внутриклеточного кальция в активации тучных клеток были получены при введении кальция внутрь клеток через микропипетки. При этом отмечалась дегрануляция тучных клеток, но не определялась секреция гистамина. Слияние тучных клеток с липосомами или фосфолипидными комплексами, нагруженными кальцием, приводило к повышению уровня внутриклеточного кальция и секреции гистамина.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что искусственное повышение концентрации кальция в тучных клетках вызывает секрецию гистамина. Следующий вопрос таков: обусловлена ли секреция гистамина поперечным сшиванием Fc-e-рецеп- торов, которое приводит к повышению внутриклеточного уровня кальция? Как уже отмечалось, для индуцированной антигеном секреции гистамина требуется внеклеточный кальций. Поперечное сшивание Fc-e-рецепторов приводит к повышению проницаемости мембраны для кальция, который движется в клетку по градиенту концентрации. Известно, что редкоземельный элемент лантан блокирует кальциевые каналы мембраны. Лантан и другие редкоземельные элементы подавляют секрецию гистамина, причем это подавление отменяется при увеличении концентрации внеклеточного кальция. Вероятно, антигенная стимуляция обусловливает открытие кальциевых каналов мембран тучных клеток и базофилов, которые блокируются лантаном. Следовательно, поперечное сшивание Fc-e-рецепторов открывает кальциевые каналы; поэтому существует возможность определения движения кальция внутрь клетки. Действительно, поток радиоактивного кальция [45Са] через мембраны тучных клеток при поперечном сшивании Fc-e- рецепторов гораздо выше, чем в покоящихся клетках. Другими словами, агрегация рецепторов вызывает увеличение проницаемости мембран тучных клеток для кальция. Применение флюоресцентных индикаторов кальция, таких как quin и fura, позволяет определить временные и количественные изменения концентрации внутриклеточного свободного кальция [Ca2+]i вследствие агрегации Fc-e-рецепторов. Уровень [Са2+]i составляющий в покое 100 нМ, при агрегации рецеп-

					Тучные клетки и базофильные лейкоциты			23
торов возрастает до 1,2 мкМ; это увеличение					контролем кальция находятся многие метабо-
зависит от внеклеточного кальция и блоки-					лические процессы клетки, поэтому его уровень
руется лантаном. В экспериментах с индика-					в большинстве клеток постоянно под-
торами внутриклеточного кальция показано,					держивается. Ионофор А23187 совместно с
что после стимуляции увеличение [Ca2+]i					кальцием вызывает 100% выделение гистамина
обусловлено (отчасти) высвобождением иона из					из клеток. Такая величина секреции редко
внутриклеточного депо, поскольку оно					достигается при поперечном сшивании Fc-e-
наблюдается и при отсутствии внеклеточного					рецепторов. Возможной причиной ограничения
кальция.					выделения гистамина в этом случае является
Несмотря на все доказательства входа					наличие	различных лимитирующих секрецию
кальция в тучные клетки и базофилы, сти-					механизмов: нормализация мембранной про-
мулированные поперечным сшиванием Fc-e-					ницаемости, секвестрация и удаление кальция,
рецепторов,	электрофизиологические			методы	высвобождающегося в ходе секреторного про-
не обнаруживают наличия кальциевого канала,					цесса в клетках.
управляемого рецептором. При поперечном					При стимуляции рецепторов тучных клеток
сшивании рецепторов выявляется деполяриза-					и базофилов в бескальциевой среде выделяется
ция мембран, однако она не сопровождается					небольшое количество гистамина. При добав-
секреторным ответом. Антагонисты кальция, в					лении кальция в разное время после рецептор-
определенных концентрациях			блокирующие		ного взаимодействия секреция быстро умень-
потенциалзависимые кальциевые каналы, не					шается при увеличении интервала времени
подавляют секрецию гистамина. Однако не-					между образованием перекрестных связей и
смотря на эти отрицательные данные, в пользу					добавлением кальция (рис. 10). Такая инакти-
гипотезы свидетельствует обнаружение выде-					вация клеток, называемая десенситизацией,
ляемого из клеток RBL белка, который об-					возникает в результате развития устойчивости
ладает свойствами кальциевого канала, управ-					клеток, стимулированных оптимальной кон-
ляемого Fc-8-рецептором. Этот белок, связы-					центрацией антигена в бескальциевой среде, ко
вающий хромогликат, описан в главе 23. Таким					второй антигенной стимуляции в среде, со-
образом, возникает парадокс, объяснить					держащей кальций. Однако эти клетки остаются
который можно двояко: либо мы пока не-					чувствительными к ионофорам, что сви-
способны определить кальциевые каналы, либо					детельствует о связи рефрактерности, вызван-
каналов нет, а существуют другие причины					ной антигеном, с уменьшением мембранной
того, что изменения [Са2+ ]; после стимуляции					проницаемости для кальция. Прямые измерения
зависят от внеклеточного кальция. Возможным					потока	радиоактивного	кальция	[45Са]
объяснением	может	служить		наличие	показывают повышение проницаемости кле-
кальциевого переносчика, управляемого ре-					точных мембран тучных клеток после попе-
цептором.					речного сшивания Fc-e-рецепторов с последу-
В настоящее время неизвестно, каким об-					ющим возвращением к исходному состоянию.
разом кальций участвует в процессе секреции.					Время снижения клеточной проницаемости на
Имеются данные о зависимости секреции ги-					50% составляет около 5 мин. Таким образом,
стамина от кальмодулина - белка, связыва-					тучные клетки и базофилы ограничивают свою
ющего внутриклеточный кальций. Вероятно,					секреторную активность только за счет вре-
кальцийкальмодулин активирует киназу (см.					менного повышения кальциевой проницаемости
ниже) и другие ферменты, инициирующие сек-					после перекрестного связывания рецепторов.
рецию.					При	исследовании инактивации		тучных
					клеток, несущих IgE к двум различным анти-
Инактивация секреторного процесса					генам, выявлено, что рефрактерность, возни-
После обсуждения роли увеличения концент-					кающая после образования перекрестных связей
					рецепторов первым антигеном, не уменьшает
рации свободного внутриклеточного кальция в					ответа на второй. Инактивация специфична
сопряжении	процессов	поперечного сшивания			только для поперечно сшитых рецепторов.
Fc-e-рецепторов и секреции гистамина необ-					Однако это справедливо при поперечном
ходимо рассмотреть вопросы кальциевого го-					сшивании лишь небольшой фракции Fc-e-
меостаза. При обработке клеток кальциевыми					рецепторов. При агрегации большой фракции
ионофорами	вхождение кальция становится				Fc-e-рецепторов клетка становится нечувстви-
неконтролируемым, и		клетки	гибнут. Под

'*

24 Глава 2

Рис. 10. Инактивация тучных клеток.

Клетки, стимулированные в нулевое время комплексом антиген-антитело, не способны выделять гистамин даже в присутствии внеклеточного кальция. Выделение гистамина уменьшается при увеличении интервала времени между стимуляцией и добавлением кальция. Вероятно, эта инактивация связана с закрытием кальциевых каналов.

5

10

15

20

25

30

Время (в минутах) между стимуляцией и добавлением Са2*

тельной к эффектам связывания остальных ре-			даны лишь частично или не даны совсем.
цепторов. Смысл неспецифической инактивации			В этой связи следует также отметить су-
неясен, но предполагается, что количество			ществование клеточных механизмов, предназ-
мембранных кальциевых каналов, доступных			наченных не только для прерывания каль-
для управления рецепторами, ограничено, при-			циевого сигнала, но и для ограничения секреции
чем число рецепторов превышает количество			гистамина. Это предположение основывается на
каналов. Таким образом, при поперечном			следующем наблюдении: кальциевый сигнал
сшивании большой фракции рецепторов, когда			пропорционален количеству поперечно сшитых
открыты и инактивированы все кальциевые			IgE-рецепторов, а секреторный ответ достигает
каналы, агрегация оставшихся рецепторов не-			своего максимума (обычно меньше объема
способна вызвать ответ из-за отсутствия до-			полной секреции), когда перекрестно связана
ступных каналов. Прямых доказательств этой			относительно небольшая часть рецепторов.
гипотезы пока нет, и основанием для нее служит			Метаболизмфосфолипидов
неконкретизированное	предположение	о
необратимости инактивации кальциевых кана-
лов или крайне низкой скорости восстановления			Обмен фосфатидилинозитола
инактивированных каналов.			В последние годы повышенное внимание уде-
В том же контексте следует рассмотреть и
другое положение относительно кальция и			ляется мембранным фосфолипидам	тучных
клеточного ответа. Выше уже упоминалось о			клеток, а также возможной роли их изменений
существовании определенной популяции лиц с			при сопряжении Fc-e-рецепторов с секрецией
базофилами, не выделяющими гистамин. Такие			гистамина. В настоящее время получены четкие
базофилы имеют обычный набор IgE-pe-			доказательства того, что различные фос-
цепторов, но даже полное сшивание этих ре-			фолипидные метаболиты инозитола	являются
цепторов не приводит к секреции. Получены			вторичными мессенджерами в процессе пере-
косвенные доказательства несопряженности			дачи сигнала. В первых исследованиях на туч-
IgE-рецепторов и кальциевых каналов. Таким			ных клетках, где проводилось измерение
образом, хотя увеличение концентрации сво-			включений 32Р- или [3Н]-инозитола в фосфати-
бодных ионов кальция в тучных клетках и			дилинозитол, фосфатидилхолин и др., было
базофилах, видимо, вызывает секрецию, ответы			установлено, что стимуляция тучных клеток
на многие вопросы, касающиеся взаимосвязи			поперечным сшиванием Fc-e-рецепторов при-
Fc-e-рецепторов и кальциевых каналов.

Тучные клетки и базофилъные лейкоциты

25

водит к распаду фосфатидилинозитола. Кривые доза-эффект, а также временные характеристики процессов обмена фосфатидилинозитола и стимулированной секреции гистамина тесно коррелируют.

Благодаря этим исследованиям наши знания о метаболизме фосфоинозитида в клетках значительно расширились; схема метаболизма представлена на рис. 11. Фосфатидилинозитол является мембранным фосфолипидом, который под действием АТФ-зависимой специфической киназы превращается в 4-монофосфат и 4,5- дифосфат (ФИФ2). Стимуляция мембранного рецептора активирует фосфолипазу С, вероятно, через ГТФ-связывающий регуляторный белок. Фосфолипаза С превращает ФИФ2 в инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3) и диацилглицерол. ИФ3 быстро распадается, превращаясь в инозитол-1,4-дифосфат (ИФ2). Как показывают недавно полученные данные, в некоторых системах ИФ2 вызывает высвобождение кальция из внутриклеточных депо, а

диацилглицерол активирует фермент протеинкиназу С. Таким образом, инициированный стимуляцией рецепторов обмен фосфоинозитида приводит к повышению уровня внутриклеточного кальция и активации протеинкиназы С. В ряде клеток наблюдается синергизм кальциевого сигнала и активности протеинкиназы С при осуществлении специфического ответа клетки.

Что же служит доказательством участия этих механизмов в передаче сигнала от поперечно сшитых Fc-e-рецепторов к механизмам секреции гистамина? Недавние исследования, выполненные на клеточной линии крысиного базофильного лейкоза (RBL), подтвердили ранее полученные данные о стимуляции обмена фосфатидилинозитола при поперечном сшивании Fc-e-рецепторов, а также о пропорциональности скорости гидролиза инозитолового фосфолипида количеству образовавшихся поперечных сшивок. Однако, помимо увеличения продукции ИФ2 и ИФ3, отмечается по-

Рис. 11. Метаболизм фосфоинозитида в клетках.

И-инозитол; ФА - фосфатидиловая кислота; ДАГ-диацилглицерол; ЦДФ-ДАГ- цитидиндифосфодиацилглицерол; ФЛС-фосфолипаза С; ФИФ2 - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат; ФИФ- фосфатидилинозитол-4-фосфат; ФИ - фосфатидилинозитол; ИФ3- инозитол-1,4,5-трифосфат; ИФ2-инозитол-1,4-дифосфат; ИФ-инозитол-4-фосфат и инозитол-1-фосфат; ИФ4- инозитол-1,3,4,5- тетрафосфат.

26	Глава 2
вышенное		образование других полифосфатов				стимулов и достаточно выраженной секреции
инозитола, включая ИФ4, и пока неясно, какие						гистамина. Синергизм наблюдается также
из них участвуют (если это имеет место) в						между ТФА (активация киназы С) и попереч-
передаче сигнала. Другой проблемой является						ным сшиванием Fc-e-рецепторов, однако он
кальциевая		зависимость		фосфоинозитидного		имеет более сложный характер, поскольку он
обмена. Как указывалось в ранних исследо-						отмечается лишь при кратковременной экспо-
ваниях, обмен фосфатидилинозитола в тучных						зиции клеток с низкой концентрацией ТФА (3
клетках, стимулированных поперечным сши-						нм). При более длительной экспозиции клеток с
ванием Fc-e-рецепторов, не зависит от вне-						30 нм ТФА сигнал, вызванный поперечным
клеточного кальция. Этот момент весьма важен,						сшиванием рецепторов, подавляется. Это
ибо если фосфат инозитола предположительно						свидетельствует о том, что в подобных условиях
генерирует кальциевый сигнал (высвобождение						ТФА подавляет кальциевый и, возможно,
кальция ИФ3 из внутриклеточных депо), то						инозитолфосфатный		сигналы.		Возможна
образование фосфата инозитола само по себе не						неоднозначная интерпретация результатов этих
должно зависеть от кальция. Однако недавние						экспериментов: 1) протеинкиназа С способна
исследования на клетках RBL показали, что						как подавлять, так и стимулировать кальциевый
гидролиз		фосфолипидов инозитола после				сигнал; 2) ТФА может действовать посредством
стимуляции клеток в значительной степени						механизмов, отличных от активации киназы С.
зависит от кальция и лишь в определенных
условиях		является		кальцийнезависи-мым		Метилирование фосфолипидов
процессом. Стало быть, теперь не вполне ясно,						Помимо изменения обмена мембранного фос-
участвуют ли фосфаты инозитола в фор-
мировании кальциевого сигнала в тучных						фатидилинозитола при стимуляции в результате
клетках и базофилах. Неясно также, какая форма						поперечного	сшивания		Fc-e-рецепторов
фосфата		инозитола		является	активной	возможна инициация метилирования некоторых
молекулой, если данный механизм действи-						мембранных фосфатидов. Показано, что после
тельно работает. Требует своего объяснения и						образования поперечных сшивок между Fc-e-
другой фактор-высокая степень зависимости						рецепторами мембранный фосфатидилсе-рин
секреции гистамина от внеклеточного кальция.						декарбоксилируется, превращаясь в фос-
Если, как отмечалось выше, источником						фатидилэтаноламин. Мембраны содержат два
увеличения [Са2+];, активирующего клетки,						метилтрансферазных фермента, для которых
служит внеклеточный кальций, то непонятно,						кофактором является 8-аденозил-Ь-метионин.
каким образом фосфаты инозитола индуцируют						Одна из метилтрансфераз локализуется на
вход внеклеточного кальция в клетку. В						внутренней поверхности мембранного бислоя, а
настоящее		время	единственно определенным			вторая - на наружной. Первый фермент ме-
действием ИФ3, как сейчас полагают, является						тилирует фосфатидилэтаноламин до фосфати-
высвобождение внутриклеточного кальция.						дил-1Ч-монометилэтаноламина, являющегося
	Не более ясна и роль протеинкиназы С,					субстратом для второй метилтрансферазы, ко-
фермента, активируемого диацилглицеролом-						торая во внешнем слое мембраны превращает
продуктом распада ФИФ2. Диацилглицерол в						его в фосфатидилхолин (рис. 12). Фосфатидил-
качестве активатора протеинкиназы С может						холин может служить субстратом для фосфо-
быть заменен форболовым эфиром 12-0-тет-						липазы А2, которая превращает его в лизо-
радеканоилфорбол-13-ацетатом (ТФА). Сам по						фосфатидилхолин и арахидоновую кислоту.
себе ТФА вызывает очень медленное выделение						Реакции метилирования предшествуют секреции
гистамина из тучных клеток и практически не						гистамина и по времени совпадают с входом
влияет на гистаминовую секрецию RBL.						кальция в тучные клетки. Кроме того,
Следовательно,			только	одна	активация	ингибиторы	метилтрансфераз		предупреждают
протеинкиназы С не является достаточным						секрецию гистамина и вход кальция в клетки,
условием для запуска процесса секреции гис-						хотя кривые «доза-эффект» для этих инги-
тамина. Однако введение в клетку очень не-						биторов не исключают возможности отсутствия
большого		количества кальция (с			ионофором	связи между угнетением метилтрансфераз-ной
А23187, не приводящим к секреции гистамина)						активности, с одной стороны, и подавлением
совместно с активацией протеинкиназы С, ин-						секреции гистамина и движения кальция-с
дуцированной ТФА, приводит к синергизму						другой. Основная трудность здесь за-

Тучные клетки и базофильные лейкоциты

27

Рис. 12. Образование фосфатидилхолина.

ФЛА2-фосфолипаза А2; ФЛС-фосфолипаза С; ФС-фосфатидилсерин; ФЭ-фосфатидилэтаноламин; ФХфосфатидилхолин; МТП-метилтрансфераза II; ДАГЛ - диацилглицерол-липаза; ФСД-фосфатидил серии декарбоксилаза, — — торможение, + — активация. Для наглядности показана раздельная активация перекрестным связыванием Fc-рецептора протеина G, имеющего отношение как к ФЛС, так и к аденилатциклазе. Это разные белки, но, вероятно, они активируются одним и тем же перекрестным связыванием.

ключается в понимании того, каким образом		с (3-адренорецептором. Показано, что коклюш-
данная система генерирует сигнал для клетки,		ный токсин, который тормозит активацию
поскольку все, казалось бы, свидетельствует в		ферментов через ГТФ-связывающий белок,
пользу	образования фосфатидилхолина во	подавляет выделение гистамина из тучных
внешней части мембраны и в то же время сам		клеток.	Негидролизуемый	аналог	ГТФ,
фосфолипид составляет значительную часть		Gpp(NH)p,	стимулирует выделение гистамина
мембраны. Имеются указания на возможность		при его введении в проницаемые тучные клетки
увеличения подвижности мембраны, однако		в присутствии кальция. Хотя ГТФ-регулятор-
это не дает решения вопроса относительно		ный белок, участвующий в секреции гистамина,
механизма передачи сигнала.		не был выделен, в пользу его существования
		свидетельствуют данные		эксперимента на
		крысиных базофильных лейкоцитах. Свойства
ГТФ-связывающие белки		этого белка отличаются от свойств Ni и Ns ГТФ-
Как отмечалось выше, для превращения ФИФ2		регуляторных протеинов, участвующих в
		сопряжении тормозящих и		стимулирующих
в ИФ3	необходима активация фосфолипазы С,	рецепторов с аденилатциклазой в других сис-
которая возможна при поперечном сшивании		темах. Недавно было показано, что белок G
Fc-e-рецепторов через ГТФ-связывающий бе-		тучных клеток, участвующих в процессе экзо-
лок по механизму, аналогичному активации		цитоза (см. ниже), отличается от белка G,
аденилатциклазы при связывании Р-агониста		активирующего фосфолипазу С.

28

Глава 2

Активацияпротеаз

ПГЕ2; взаимодействие последнего с этими ре-

Помимо кальциевого и фосфолипидного мета-

цепторами приводит к подавлению выделения

гистамина, стимулированного комплексом ан-

болизма, рассматриваемого в контексте пере-

тигенIgE. Подавление секреции гистамина

дачи сигнала с рецептора на секреторный про-

ПГЕ2 обсуждается ниже.

цесс, для полноты изложения необходимо ска-

зать и об активации протеаз. Уже давно из-

Циклическиенуклеотиды

вестно, что протеазы активируются при сти-

муляции тучных клеток. Кроме того, протеазы

Первоначальные наблюдения подавления ад-

вызывают секрецию гистамина. Ингибиторы

реналином антигенстимулированной секреции в

протеаз подавляют секрецию гистамина, но

легких были затем подтверждены на ба-зальных

только в случае их присутствия во время по-

лейкоцитах человека. В последующие годы идеи

перечного сшивания Fc-e-рецепторов. Таким

относительно роли циклических нуклеотидов в

образом, протеазы предположительно являются

секреции гистамина развивались в разных

необходимым

компонентом

в

процессе

направлениях. Подавление секреции гистамина

секреции гистамина и активируются при по-

в легких человека и морских свинок при

перечном сшивании Fc-e-рецепторов. Более то-

активации

р-адренорецепторов

оказалось

го, протеазы могут участвовать в активации

недостоверным. Для подавления секреции в

секреции гистамина (см. выше). Однако, как и в

базофилах

требуются

достаточно

высокие

случае с фосфолипидным метилированием,

концентрации изопреналина, а количественные

непонятно, каким образом протеазы активируют

характеристики, например рА2, свидетельствуют

секреторный процесс.

об отсутствии на них Р-адренорецепторов. С

другой

стороны,

хотя

аго-нисты

р-

Продуктылипоксигеназы

адренорецепторов не влияют на секрецию

гистамина тучными клетками (у крыс),

Кроме гистамина, тучные клетки, стимулиро-

применение [3Н]-дигидроалпренолола в ра-

ванные комплексом антиген-IgE, продуцируют

диолигандном связывании показало наличие на

другие активные вещества, в том числе

клетках р-адренорецепторов.

медленно действующее вещество анафилаксии

Кроме агонистов р-адренорецепторов, дру-

(МДВ-А) и простагландины, особенно ПГD2. В

гие вещества, повышающие уровень цикличе-

настоящее время МДВ-А идентифицировано как

ского аденозин-3',5'-монофосфата, подавляют

смесь двух или более метаболитов арахи-

секрецию гистамина, вызванную поперечным

доновой кислоты по липоксигеназному пути-

сшиванием Fc-e-рецепторов. Отмечена актив-

лейкотриенов D4 и С4

(см. главу 10). Таким

ность холерного эндотоксина, теофиллина, ди-

образом, при активации мембранной фосфо-

бутирила цАМФ и аденозинфосфоротиоат.

липазы А2 поперечным сшиванием Fc-e-рецеп-

Теофиллин в высоких концентрациях (1 мМ)

торов

может

образовываться

арахидоновая

является ингибитором фосфодиэстеразы и, по-

кислота, которая превращается в nrD2 и лей-

давляя ферментативное разрушение цАМФ,

котриены. Эти метаболиты, как и гистамин,

вызывает повышение уровня внутриклеточного

опосредуют некоторые эффекты воспаления, но

цАМФ. При более низких концентрациях (10

в отличие от гистамина они не хранятся в клетке

мкМ) теофиллин выступает как конкурентный

в готовом виде. Арахидоновая кислота может

антагонист аденозина и подавляет секрецию

также

образовываться

при

действии

гистамина. В тучных клетках крыс и морских

диацилглицероллипазы

на

диацилглицерол,

свинок

аденозин

потенцирует

анти-

продукт распада фосфатидилинозитола (см. рис.

генстимулированное

выделение гистамина.

12). Препараты, подавляющие липоксиге-назу,

Механизм этого усиления неизвестен, однако

такие

как 5,8,11,14-эйкозатетраеновая

кислота

следует отметить существенную разницу между

(ЭТЕК), угнетают и секрецию гистамина,

тучными клетками и базофилами, поскольку в

поэтому, как полагают, продукты ли-

базофилах аденозин, напротив, подавляет

поксигеназы могут не только выделяться (в

секрецию гистамина. Было постулировано, что

качестве фармакологически активных веществ),

аденозин участвует в патогенезе аллергических

но и участвовать в процессах, ведущих к секре-

реакций, потенцируя секрецию гистамина; од-

ции гистамина. Ингибиторы циклооксигеназы

нако в пользу этого положения представлены

не влияют на секрецию гистамина, но тучные

достаточно скудные доказательства.

клетки

и базофилы имеют

рецепторы для

При прямых измерениях уровня цАМФ в

АТФ ифосфорилирование белков

венные данные о холино- и а-адренорецепто-рах на тучных клетках. В этом контексте следует также отметить сообщения об изменениях уровня цГМФ в тучных клетках при поперечном сшивании Fc-8-рецепторов, хотя такие изменения не имеют сколь-нибудь существенного значения для контроля секреции гистамина.

условиях поперечного сшивания Fc-e-рецепто- ров тучных клеток отмечается его быстрый подъем, предшествующий процессу выделения гистамина. По окончании секреции гистамина уровень цАМФ возвращается к исходным значениям. Интерпретация этих эффектов неопределенна, однако некоторые новые наблюдения позволяют сделать ряд однозначных выводов. Показано, что повышение уровня внутриклеточного цАМФ может сопровождаться не

только подавлением секреции гистамина, но и Выше были представлены ранние, связанные с ее увеличением в зависимости от типа стимембраной этапы процесса секреции гистамина мулируемых клеток. Поперечное сшивание Fc- и обмена арахидоновой кислоты. О более 6-рецепторов приводит к такой секреции поздних этапах известно относительно мало. гистамина, при которой цАМФ повышает скоДля секреции гистамина необходимо накопрость секреции, но подавляет максимальную ление внутриклеточного АТФ. При стимуляции степень секреции. С другой стороны, при спонтучных клеток поперечной сшивкой Fc-e- танной и вызванной А23187 секреции гистарецепторов в присутствии глюкозы не происмина цАМФ, по-видимому, лишь увеличивает ходит увеличения потребления кислорода и скорость секреции. Кроме этих наблюдений, аноксия не полностью подавляет вызванную следует отметить выявление в тучных клетках таким образом секрецию гистамина. Ингибикрыс протеинкиназы, чувствительной к цАМФ, торы окислительного фосфорилирования, такие активация которой происходит при поперечном как цианид и антимицин А, лишь частично сшивании Fc-8-рецепторов. тормозят антигениндуцированную секрецию

Таким образом, поперечное сшивание Fc-e- гистамина. Тучные клетки относительно бедны рецепторов приводит к раннему повышению митохондриями, и окислительное фосфорилиуровня цАМФ, который активирует протеинрование, по-видимому, не является абсолютным киназу, участвующую в инициации секреции условием секреции гистамина.

гистамина. Искусственный подъем уровня Однако гликолиз в тучных клетках протекает цАМФ также увеличивает скорость секреции. активно, и удаление глюкозы вызывает Кроме того, цАМФ обладает тормозящим эфчастичное торможение секреции, опосредованфектом по отношению к секреции (гистамина), ной Fc-e-рецепторами. Сочетание подавления вызванной поперечной сшивкой Fc-e-рецепто- окислительного фосфорилирования и удаления ров, что ограничивает максимальную степень глюкозы полностью отменяет секрецию гиссекреции. Ингибиторное действие цАМФ мотамина, а восстановление гликолиза либо жет быть связано с ограничением подъема [Ca2 + окислительного метаболизма частично восста- ]j, вызванного стимуляцией, так как увеличение навливает секрецию. Эти данные интерпретивнутриклеточного цАМФ в тучных клетках руются как зависимость Fc-e-опосредованной может снизить повышенную проницаемость секреции от АТФ, который может поставляться мембран для кальция или вход кальция как в результате гликолиза, так и при вследствие поперечного сшивания Fc-e-pe- окислительном фосфорилировании. Показано, цепторов. Предполагается, что уровни цАМФ в что клетки, лишенные АТФ, неспособны секреразных частях клетки могут реагировать на тировать гистамин, а стимуляция Fc-e-рецеп- предъявление стимула по-разному, т.е. изметоров приводит к потреблению внутриклеточняться в противоположных направлениях и с ного АТФ. Уровень АТФ тучных клеток сниразной скоростью. жается при стимуляции секреции гистамина.

В экспериментах было также исследовано Конечно, АТФ необходим для обеспечения действие агонистов а-адренорецепторов и хомногих клеточных процессов, а не только для линорецепторов. В тучных клетках легких стисекреции. Как уже отмечалось, имеются данные муляция а-адренорецепторов и холинорецеп- о вовлечении в секрецию гистамина ряда киназ, торов (мускариновых) усиливает секрецию использующих АТФ (цАМФ-зависимая киназа, гистамина, опосредованную Fc-рецепторами. киназа С, фосфоинозитидкиназы), и вполне Эти данные не были подтверждены при исвероятно также, что АТФазы участвуют в пользовании крысиных тучных клеток и базомеханизмах транспорта кальция в клетку. филов человека. Также отсутствуют количестФосфорилирование белков, таким образом,

Тучные клетки и базофильные лейкоциты

29