Ферменты

8 Мембранные методы очистки и концентрирования ферментных растворов. Диализ. Электродиализ. Баромембранные способы. В зависимости от движущей силы процесса мембранные методы классифицируются на диффузионные - диализ (движущая сила - разность концентраций по обе стороны мембраны), электромембранные - электродиализ (разность электрических потенциалов), баромембранные - обратный осмос, ультрафильтрация, микрофильтрация (разность давлений). Для очистки от низкомолекулярных примесей при небольших производительностях — диализ, для обессоливания в интенсивных условиях - электродиализ, для глубокой очистки от примесей с одновременным концентрированием – ультрафильтрация. Диализ. Сущность диализа в том, что если два раствора с различной концентрацией какого-либо компонента разделить мембраной, то начнется естественный процесс диффузии, достигающий равновесия при выравнивании концентраций этого компонента с обеих сторон мембраны. Одни вещества хорошо проходят ч/з материал мембран, другие плохо. Процесс диализа имеет ряд существенных недостатков: 1. при диализе возможна «потеря» фермента в результате вымывания ионов металлов, входящих в состав молекулы фермента; 2.при диализе водопроводной воды может происходить потеря активности фермента в результате попадания из воды в раствор ингибиторов фермента; 3.в процессе диализа одновременно с очисткой происходит сильное разбавление ферментного раствора. Объем продиализованного раствора увеличивается примерно на 20-25%, а если учесть, что происходит активное удаление балластных веществ, то в результате диализа получают очень разбавленные ферментные растворы. Поэтому сейчас этот метод очистки ферментных растворов от балластных веществ в ферментной промышленности почти не используется. Электродиализ. Применяется для удаления из раствора электролитных примеси, т. е. органические и минеральные ионы. Сущность этого мембранного метода в том, что перенос ионов через мембрану интенсифицируют с помощью постоянного электрического поля, а мембраны изготавливают из специальных ионообменных материалов на основе синтетических полимеров. Электрический потенциал к аппарату подводится через два электрода, размещенных в соответствующих электродных камерах. Обе камеры отделены от рабочей обессоливающей камеры, куда подается исходный раствор, ионообменными мембранами, со стороны катода - анионообменной, со стороны анода - катионообменной. При работе аппарата катионы под действием постоянного электрического поля смещаются к аноду, встречают на пути катионообменную мембрану, проходят через нее в электродную камеру и в виде слабого раствора щелочи выводятся из аппарата. Соответственно ведут себя и анионы, выходя из аппарата в виде слабого раствора кислоты. Обессоленный раствор ферментов (диализованный раствор) выводится из рабочей камеры. Электродиализный метод осуществляется всегда в непрерывном режиме и существенно более энергоемок, чем диализ. Баромембранные методы. С помощью полупроницаемых мембран разделяются истинные растворы, т.е. гомогенные системы, в то время как фильтрованием можно разделить лишь суспензии, т. е. твердую фазу отделить от жидкой. Баромембранные методы получили широкое распространение в биотехнологической, пищевой, фармацевтической, химической промышленности. Физико-химический механизм. Растворение вещества в растворителе возможно только тогда, когда они имеют сродство друг к другу, т. е. когда на уровне межмолекулярного взаимодействия происходит сольватация молекулами растворителя молекул или ионов растворяемого вещества. Когда речь идет о водных растворах, процесс называется гидратация. Поскольку молекула воды представляет собой диполь, ее энергия связи с частицей растворимого вещества тем больше, чем больший заряд несет эта частица на себе. Понятно, что чем больше заряд иона, тем больше количество молекул воды окажется связанным с ионом в виде многослойной гидратной оболочки. Именно образованием гидратных оболочек объясняется явление, которое называется прямой осмос. Если осмотическое давление (Ро) больше гидравлического (Рr), то происходит прямой осмос, если Ро = Рr, то диффузия через мембрану прекращается. Если к раствору приложить рабочее давление, превышающее осмотическое, т. е. Рr>РО то начнется перенос молекул воды слева направо, т. е. будет происходить дегидратация раствора, концентрирование растворенного вещества и получение чистой воды в правой половине сосуда. Это механизм называется обратным осмосом. При ультрафильтрации происходит разделение высоко – и низкомолекулярных соединений с целью получения концентрата высокомолекулярных соединений. Ультрафильтрация обладает способностью не инактивировать ферменты и требует минимальные энергозатраты.

9 Выделение и очистка ферментов. Осаждение ферментов органическими растворителями. Осаждение ферментов высококонцентрированными растворами солей Культура микроорганизмов, выращенная поверхностным способом, и культуральная жидкость после глубинного культивирования содержат большое количество балластных веществ. Выделение и очистка ферментов трудоемкий и дорогостоящий процесс, поэтому, если ферментный препарат можно использовать в виде неочищенной культуры микроорганизмов, его очистку не проводят, например, спиртовая, кожевенная промышленности, в с/х при получении кормов. Осаждение ферментов органическими растворителями. Эффект осаждения белков связан с тем, что в присутствии органического растворителя снижается активность воды. Происходит вытеснение молекул воды с поверхности белковой молекулы. Молекулы воды, расположенные на гидрофобных участках поверхности белка, могут быть замещены на молекулы органического растворителя. При этом растворимость белков падает, происходят агрегирование и осаждение белковых молекул. Факторы, влияющие на осаждение ферментов. 1.Размер молекулы белка. Крупные молекулы агрегируют быстрее, чем мелкие. Наиболее широко для осаждения ферментов используются этиловый спирт, ацетон и изопропиловый спирт. 2.Наличие в растворе некоторых ионов Ме может оказывать стабилизирующее влияние на фермент. Так, ионы Са^2+ способствуют сохранению активности α-амилаз, протеиназ, глюкоамилаз; защитным действием обладают ионы магния, марганца, кобальта. В то же время ряд нонов (Ее^2+ , Рb^2+ , Сu^2+, Аl^3+, Ni^2+, Аg^+ и др.) действует отрицательно и их присутствие крайне нежелательно. Наличие электролитов часто позволяет снизить расход осадителя и улучшить структуру осадка. 3.Температура ферментного раствора и растворителя при осаждении д.б низкой, т.к. смешивание спирта и водного раствора сопровождается повышением температуры раствора и может произойти инактиваця. Оптимальная температура осаждения 3-5 °С для большинства м\о. Для этого ферментный раствор охлаждают до 1-3°С , а растворитель до -8 - -12°С. 4.рН среды. Наиболее полно ферменты выпадают в изоэлектрической точке, когда создаются благоприятные условия для агрегирования белковых молекул. Использование органических осадителей при рН, близком к изоэлектрической точке, позволяет ускорить осаждение ферментов и использовать растворители более низких концентраций. 5.Концентрация сухого вещества в исходном растворе. Максимальный выход активного фермента в препарат и наиболее стабильная структура осадка получаются при содержании сухого вещества не более 10-12%. 6.Длительность контакта с растворителем. Следует стремиться сократить это время до минимума, чтобы уменьшить инактивацию ферментов. Осаждение ферментов высококонцентрированными растворами солей (высаливание). Процесс высаливания зависит от степени гидрофобности белковой молекулы. Белковая молекула имеет гидрофобные участки на поверхности в виде боковых цепей ряда аминокислот (тирозин, триптофан, лейцин, изолейцин, метионин, валин и фенилаланин). На гидрофобных участках молекулы белка при соприкосновении с водой происходит образование слоя, состоящего из ориентированных молекул воды. При добавлении значительного количества соли происходит связывание воды, белок частично освобождается от воды и создаются условия для агрегирования белковых молекул. Растворимость белка резко падает, и он выпадает в осадок. Чем выше концентрация соли, тем быстрее происходит образование осадка. Хотя высаливание белков в основном определяется гидрофобными взаимодействиями, на этот процесс существенно влияют и другие факторы: рН среды, близость его к изоэлектрической точке белка, температура, степень чистоты ферментного раствора, длительность процесса и т. д. Самую большую растворимость в солевых растворах большинство белков имеет при рН около 7, когда они содержат наибольшее количество заряженных групп, наименьшую растворимость - вблизи изоэлектрической точки. Поэтому целесообразно вести осаждение ферментов методом высаливания при рН вблизи изоэлектрической точки. Для высаливания могут быть использованы сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат цинка и хлористый натрий. Наиболее часто используют сульфат аммония, реже - хлористый натрий. Самая сложная стадия процесса высаливания - это внесение соли и способ ее растворения. Соль измельчают и медленно добавляют небольшими порциями при постоянном перемешивании, чтобы избежать локальных зон повышения концентрации соли в растворе. Перемешивание должно быть умеренным, без пенообразования. Процесс формирования осадка может длиться от 20-40 мин до нескольких часов. Повышение температуры при высаливании благоприятствует быстрому агрегированию молекул белка в крупные хлопья, поэтому процесс ведут при 20-30°С. При высаливании можно добиться частичного фракционирования комплекса ферментов.

10.Особенности приготовления питательных сред для синтеза амилолитических ферментов. Средой для выращивания продуцентов являются пшеничные отруби с добавлением до 25 % солодовых ростков, увлажнённых водой, подкисленной 0,1 н раствором серной или соляной кислоты. Выбор сред для каждого продуцента проводится опытным путём с учётом физиологических потребностей продуцента и условий производства. Наилучшие результаты наблюдались в присутствии двухзамещённого цитрата аммония и аммония фосфорнокислого двухзамещённого. Органические источники азота менее эффективны, чем неорганические. Дополнительное введение азота в виде экстрактов из растительного, животного и микробного материала к (NH4)2HPO4 позволяет на 30 – 40 % повысить продуцирующую способность бактерий и достичь активности 110 – 140 АС/мл. Главным источником углерода в среде для всех продуцентов α – амилаз является крахмал различного происхождения. Используют чаще всего крахмал картофельный или кукурузный, который вводится в среду в клейстеризованном состоянии. Вместо крахмала может применяться крахмалосодержащее сырьё, например, ячменная или кукурузная мука. Все эти компоненты используются в нативном виде или в виде различных гидролизатов. Установлено, что биосинтез α – амилаз протекает более интенсивно, если крахмал частично гидролизовать в процессе приготовления питательной среды, не допуская при этом накопления в среде низкомолекулярных сахаров, например, мальтозы и особенно глюкозы. Поэтому, если состав среды предусматривает высокое содержание крахмала, целесообразно вводить его порциями по мере потребления культурой микроорганизма, что позволяет избежать явления катаболитной репрессии . В качестве основного обогатителя среды используют отруби. Распространение получают среды, основным компонентом которых являются отходы пивоваренного производства (фильтрат пивной дробины).