Дәріс № 2. Биотехнологиялық объектіні таңдау.

1. Жинақталатын дақылдарды алу.

2. Микроорганизмдердің кейбір түрлеріне сипаттама.

Биотехнологиялық процестің негізгі түйіні, оның мәнін анықтаушы жасуша болып табылады. Дәл сонда арнаулы өнімдер синтезделеді. Ю.А.Овчиниковтың бейнелі сөздерімен, жасуша шағын химиялық зауыт ретінде көрсетеді, мол өнімділікпен жұмыс істейтін, шекті келістілікпен және белгіленген бағдарламамен. Онда минут сайын жүздеген күрделі қосылыстар синтезделеді, аса ірі биополимерлерді қосқанда, бірінші ретте нәруыздар.

Қазіргі биотехнологиялық өндірістің негізі-микробиологиялық синтез, яғни микроорганизмдердің көмегімен әртүрлі заттар синтезі.

Табиғаттың объектілерінен тәуелсіз, биотехнологиялық зерттеулердің алғашқы кезеңі жасуша және тіндерден таза культураларды алу болып табылады.

Микроорганизмдерге барлық прокариоттар жатады-бактериялар, актиномицеттер, риккетсиялар, және эукариоттардың бір бөлігі- ашытқы, жіп тәрізді саңырауқұлақтар, қарапайымдылар және балдырлар. Олардың ортақ қасиеттері- шағын мөлшері, сондықтан олар тек микроскоппен көрінеді. Қазіргі уақытта 100 мыңға жуық әртүрлі микроорганизмдер түрі белгілі. Сонша көп әртүрлі микроорганизмдерге қалай дұрыс таңдау жасауға болады, дәл сол түрге, бізді қызықтыратын өнімге? Осыған ұқсас мәселелерді шешу үшін микроорганизмдерді бөліп алу жүргізіледі. Сынама сол немесе басқа продуценттің ортасы мүмкіндеу орынынан алынады. Осыған сәйкес көмірқышқылды микроорганизмдерге бензинді колонка маңындағы топырақ мекені болуы мүмкін, шарап ашытқылары көбіне жүзімде кездеседі, анаэробты целлюлоза іріткіш және метан түзетін микроорганизмдер көп мөлшерде күйіс қайтаратын жануарлардың қарындарында кездеседі. Сынама үлгісі арнайы құрамды сұйық қоректік ортаға енгізеді. Бұл орталар элективті деп атайды. Мұнда әртүрлі факторларды қайнату жолымен бізді қызықтыратын продуценттің өсу басымдылығы үшін таңдалған шарттар құрылады. Бұл факторларға энергия көзі, көміртек, азот, рН мәні, температура, осмостық қысым және т.б. жатады. Продуцентке холестериноксидазалардың жиналуы үшін көміртектің бірден-бір көзі ретінде холестеринді орта қолданылады; көмірқышқылды микроорганизмдердің ортасы парафинмен; протеолитикалық және шиполитикалық ферментті продуценттердің- ортасы,нәруыз және майдан тұратын орта. Сонда микроорганизмдердің жинақтаушы культуралары болады.

Келесі кезең- таза культураларды бөліп алу. Ол үшін тығыз қоректік орталар қолданылады, онда жинақтаушы культурадан алынған, сынама үлгісі отырғызылады. Тығыз қоректік ортадағы микроорганизмдердің жеке клеткалары жекеленген колонияларды түзеді, олардың келесі отырғызылуынан продуценттің таза культурасын алады, бір түр клеткалар популяциясынан тұратын.

Микроорганизмдерді бөліп алудың басқа жолыда бар-микроорганизмдер коллекциясынан. Әр түрлі микроорганизмдер топтарының биохимиясы мен физиологиясын зерттеу нәтижесінен жиналған тәжірибесімен басқарылады: антибиотик продуценттерін көбіне актиномицеттер ортасынан табады, клеткадан тыс бөлініп алынған гидролитикалық ферменттер грам оң бактерияларға , этанолдың әдеттегә продуцентә-ашытқылар және т.б. тән.

Арнаулы өнімдерді синтездеу қабілеттілігі продуцентті таңдаудағы негізгі белгісі болып табылады. Бірақта микробиологиялық өндіріс продуценттерге басқа талаптар қатарын қояды, маңызды көзқараспен өндіру технологиясына микроорганизмдер міндетті:

1. Өсу жылдамдығы жоғары болу керек;

2. Тіршілік әрекетіне арзан тағамдық емес субстранттарды қолдану

3. Бөгде микрофлорамен жұқтыруға қарсы тұру керек.

Барлығы арнайы өнім өндірісінде шығынды айтарлықтай төмендетеді.

Біржасушалы организмдер, тірі ағзалардың жоғарғы түріне қарағанда синтетикалық процестердегі жоғарғы жылдамғдығымен ерекшеленеді. Мысалы, массасы 500 кг сиыр бір тәулік ішінде 0,5 кг нәруызды синтездейді. Бұндай көлемдегі нәруызды бір тәуліктің ішінде 5г ашытқы көмегімен алуға болады. Сонша өсудің жоғарғы жылдамдығымен сипатталады, бірақ, барлық, микроорганизмдерге емес. Аздау мөлшерде өсетін олиготрофты микроорганизмдер бар Биотехнологиялық зерттеулерде аса маңызды объектілер фотосинтездеуші микроорганизмдер болып табылады. Олар өздерінің тіршілік әрекеттерінде күн сәулесін қолданады, клетканың әртүрлі заттарын синтездейді, нәтижесінде көмірқышқылын қалпына келтіреді, судың тотығуымен (цианобактериялар және эуукариоттар) қабаттасқан, атмосфералық азотты меңгере алу (прокариоттар) яғни ең оңайэнергия көзі, көміртек, қалпына келтіретін эквиваленттер және азоттан тұрады. Фототрофты микроорганизмдер аммиактың, сутегі, нәруыз және әртүрлі биопрепараттардың продуценті ретінде тиімді. Биотехнологияға қолайлы объект термофильді микроорганизмдер болып табылады. Олар оптимальды жоғарғы температурада өседі. (60-80⁰ С, жеке өкілдері 110⁰ С-қа дейін және жоғары, 300⁰С –қа қысымға дейін өсе алатын микроорганизмдер мұхиттың тереңдігінен табылды) басқа микрофлораның өсуіне қиындық туғызатын темпетаруларда. Термофильдер ішінен құнды продуценттер табылады, спирттің, амин қышқылдың, ферменттің, молекулярлы сутегінің. Термофильдерді қолдану стерилизациялайтын өндіріс құралдардағы шығынды азайтады. Сонымен қатар, бұл организмдерде өсу және метаболиттік белсенділігі жоғары, 1,5-2 есе, басқа мезофилдерден қарағанда. Термофилмен синтезделетін ферменттер көбіне протеазалар Цермус кульдофилус қайнатуға, тотығуға, детергентке, органикалық ерігіштікке және басқада жағымсыз шарттарға жоғары қарсы тұра алады. Олар орташа температурада аз қозғалады.

Объектілерді бөлу және жинақтау-биотехнологиялық процестің маңызды кезеңі. Бірақ оңай жинақтау жолымен жоғары белсенді продуценттерді алу мүмкін емес, сондықтан организмнің табиғатын керекті бағытта өзгерту шешімі туады. Бұл үшін селекциялық әдіс қолданылады. Олардың көмегімен микроорганизмдердің өндірістік штамдары алынады, микроорганизмдердің белсенді штамдарын 10, 1000 есе жоғарлататын синтетикалық белсенділік.

Дәріс № 3. Селекция.

Селекция әдістерімен алынған, микроағзалардың өнеркәсіптік штамдары. Индуцирленген мутагенез. Мақсатты өнімнің құрылымдық ұқсастықтарына орнықтылығы бойынша – продуценттерді іріктеу.

Селекция – ДНК нуклеотидті тізбектілігінде құрылымдық түрөзгергіштің салдарынан, тұқымқұалаушылығы секіріс тәрізді өзгерістерге ұшыраған, ағзаларды, яғни, мутанттарды бағытты іріктеу. Селекцияның басты жолы – бұл продуценттерді көз жұмып іріктеуден оардың геномдарын саналы құрастыруға дейінгі жол. Бірақ кенеттен мутацияларды іріктеуге негізделген, әдістер микроағзаларды пайдаланумен әртүрлі технологиялардың дамуында маңызды рөл атқарады.

Осындай жолмен ұзақ уақыт бойында сыра, шарап, наубайхана ашытқыларының штамдары, сіркеқышқылының, пропион-қышқылының бактериялары т.б. іріктелген болатын. Баспалдақты іріктеу туралы сөз қозғалып отыр: кезңдердің әрқайсысында микроағзалардың популяцияларынан ең жоғары тиімді клондар іріктеледі. Кенеттен түрөзгеруге негізделген, селекция әдісінің шектеулігі олардың төмен тиілігімен байланысқан, бұл үдерістің қарқындылығын мәнді түрде қиындатады. ДНК құрылымында өзгерістер сирек жүреді. Түрөзгергіштік туындау үшін, ген орташа алғанда -есе еселенуі керек.

Көптеген ұрпақтар бойында үлкен көлемдерде бионысанды үздіксіз егумен сәйкестікте, 1мл тамшыларға және одан артық жасушаларға жететін, микробты популяциялардың жоғары тығыздықтары мутанттардың жеткілікті үлкен мөлшерін алуға мүмкіндік береді. Үздіксіз тәртіпте егу барысында ең өнімділікті мутанттарды іріктеудің мысалы, ашытқылар тіршілігінің өніміне, этанолға төзімділік белгісі бойыншаSaccharomyces uvarumашытқыларды іріктеу болып табылады. Қышқылдарға және сілтілерге, метаболизм өнімдеріне, ауыр металлдардың иондарына, т.б.-әртүрлі факторларға бионысандардың төзімділігін жоғарылатуға жол алатын, бұл қадамның жаңашылдығы-дақылдың бөлуімен және биореакторға ингибирлейтін фактордың (бұл жағдайда этанол) түсуімен-дақылдың тіршілігін сипаттайтын, параметрдің арасында кері байланысты орнатуда. Осындай белгілеудегі ұзақ (650 сағаттық) егуде, 10%-ға дейін концентрацияларда этанолдық ингибирлейтін әрекетіне резистентті, мутант ашытқылар алынған.

Геномның жасанды зақымдануында бионысан мутациялары жиілігінің күрт ұлғаюы-индуцирленген мутагенез селекцияның мәнді түрде жақсаруына әкеледі. ДНК-ның бірінші құрылымының өзгерістерін тудыратын, кейбір химиялық қосылыстар, ультракүлгін рентген немесе усәулелері мутагенді әсерге ие болған. Өздерін ұсына білген мутагендер қатарына азотты қышқыл, алкилдеуші агенттер,акридинді бояғыштар, бром – урацил, т.б. жатады.

Алынған клондардың тоталді тексерейін (скрипинг) жүргізіді. Ең өнімділікті клондарды іріктеп алып, сол немесе өзге мутагенмен өңдеуді қайталайды, ең өнімділікті нұсқаны қайта таңдайды, т.с.с., яғни, мұнда да керекті белгі бойынша баспалдақты іріктеу туралы сөз қозғалады.

Еңбегінің күрделілігі – индуцирленген мутагнез және тізбекті баспалдақты іріктеу әдісінің негізгі кемшілігі. Сондай – ақ мутациялардың сипаты туралы мәліметтердің болмауы да әдістің кемшілігіне жатады, зерттеуші ақтық нәтиже бойынша іріктеу жүргізіледі. Егер, ауыр металдарға төзімді, бактерия штамдары туралы сөз қозғалса, онда төзімділік әртүрлі мутация топтарына байланысты болуы мүмкін: а) бактерия жасушасымен металдар катиондарының жұтылу жүйесін басумен; б) жасушадан жұтылған катиондардың шығарылуын белсендірумен; в) ауыр металдардың ингибирлейтін әсеріне сезімтал, жүйелердің қайта құрылуымен.

Молекулалық генетикалық жетістіктері, мақсатты өнімнің құрылымдық аналогтарына төзімділіктері бойынша, продуценттерді іріктеудің мақсатқа сай әдістерін тәжірибеге енгізуге мүмкіндік берді. Әдіс, биосинтетикалық жолдың ақтық өнімімен кері байланыстың қағидасы бойынша, ферменттерді реттеуге негізделген (В.Г.Дебабов, 1984). Метаболит концентрациясының жоғарылауы, метаболит синтезіне қатысатын, ферменттің белсенділігін ингиьирлейді; немесе бұл ферменттің синтезін репрессиялайды. Осылайша,пен глюкоза болғанда көптеген бактериялардың жасушалары тіршілікке қажетті барлық азотқұрамды қосылыстарды синтездейді. Егер ортаға сол немесе өзге аминқышқылын қосса, онда оның

Сурет 2. Ақтық өніммен биосинтетикалық жолдың негативті реттелуі: A, B, C, D-Ea, Eb, Ec, Ed ферменттерімен, өршітілетін реакциялардың өнімдері.

Синтезі тез тоқтайды. Метаболиттің құрылымдық аналогтары да осындай әсер тудырады, бірақ олар метаболитті функционалды алмастыра алмайды. Мысалы, аминқышқылының аналогы ақуыз құрамына кіре алмайды, сондықтан аналогтың ақуыз құрамына кіре алмайды, сондықтан аналогтың қатысуында қалыпты жасушалардың өсуі, мақсатты өнімге ашығумен байланысты, басылады.

Бұл жағдайларда тек кейбір жасушалар ғана аман қалады. Бұл ферменттер синтезінің және белсенділігінің бұзылған реттелуімен мутенттар. 1) Еа ферменті (сурет 2) функционалдық белсенділігін сақтаған, бірақ ақтық өнімнің немесе оның аналогының ингибирлейтін әсеріне сезімталдылығын жоғалтқан; 2) Еа ферментінің синтезі табиғатта өсімдіктердің обыр ісіктерін тудырады, өйткені олар бақылаусыз көбейеді. Осындай клондардың негізінде құнды қосылыстарды алуға болады.