Лабораторная работа №309

Определение аминокислот в их смеси.

Литература:

ФХМА, М. 2001г, стр. 447-463

Краткое теоретическое введение:

Общая характеристика метода

Создание метода бумажной хроматографии (в 1944 г.) значительно расширило возможности разделения, идентификации и количественного определения ма­лых количеств веществ в различных областях химии и биохимии. В зависимости от того, какого типа применяют бумагу или чем ее пропитывают, механизм разделения может быть различным: распределительным, адсорбционным, ионообменным, осадочным или смешанным. Однако в большинстве случаев на практике исполь­зуют метод, в котором реализуется распределительный механизм, когда разделение достигается за счет различного распределения вещества между двумя жидкими фазами — вариант жидкость-жидкостной хроматографии. Поэтому ниже бумажная хромато­графия будет рассмотрена в идеальном варианте распределитель­ного механизма, когда неподвижная фаза, как правило, вода, удерживается твердым носителем — хроматографической бума­гой, а подвижная фаза представляет собой органический раство­ритель (или смесь растворителей) с добавлением кислот и воды.

Анализ смеси веществ этим методом проводится по следую­щей схеме: на полоску бумаги различной формы на небольшом расстоянии от одного из ее концов наносят на линию старта в ви­де капли (или полоски) смеси разделяемых веществ. После высы­хания капли край бумаги ниже линии старта погружают в подвиж­ную фазу, налитую на дно хроматографической камеры, затем подвешивают вертикально полоску бумаги, плотно закрывают ка­меру и оставляют на некоторое время (восходящий вариант). Подвижная фаза под действием капиллярных сил поднимается по бумаге, вместе с ней перемещаются с различной скоростью анализируемые вещества. Когда фронт подвижной фазы прибли­зится к противоположному концу бумаги или пройдет заданное расстояние, лист вынимают и сушат.

Зоны разделяемых веществ в виде пятен, которые могут быть как видимыми, так и невидимыми, обнаруживают, отмечают по­ложение и проводят определение (качественное и количествен­ное) разделенных компонентов.

Хроматографическая бумага. Подвижная фаза.

Хроматографическую бумагу изготавливают из высококачественного хлопка, т. е. из практически чистой α-целлюлозы (до 98%). Древесину в качестве исходного сырья не применяют, так как при длительной переработке ее и очистке получаются короткие и хаотично распо­ложенные волокна бумаги. Хроматографическая же бумага должна представлять собой длинные, ориентированные в определенном направлении волокна. В этом случае нанесенная на бумагу жид­кость перемещается по капиллярам, образуемым волокнами хро­матографической бумаги. Наиболее четкое и воспроизводимое разделение достигается в том случае, когда направление движе­ния подвижной фазы совпадает с направлением волокон бумаги.

α-Целлюлоза даже после сушки содержит в порах значительное количество связанной воды (гигроскопическая влага, до 25%), ко­торая и служит неподвижной фазой. Физическая структура свя­занной воды в целлюлозе сильно отличается от структуры "сво­бодной воды", которая иногда применяется в качестве подвиж­ной фазы или входит в ее состав.

Хроматографическая бумага должна отвечать следующим тре­бованиям:

1) быть химически чистой, для чего ее предварительно обраба­тывают растворами минеральных кислот, щелочей или ацетоном и спиртами, которые вымывают различные органические и неор­ганические примеси;

2) быть химически и адсорбционно инертной по отношению к разделяемым веществам и подвижной фазе;

3) быть однородной по плотности и толщине; чем плотнее бу­мага, тем медленнее скорость движения зон по ней, но тем боль­шее количество вещества можно разделить (сорбционная емкость бумаги выше);

4) иметь длинные и определенным образом ориентированные волокна.