БХ-методичка

ГОСУДАРСТВЕННОЕ МЕДИЦИНСКОЕ УЧЕБНОЕ ЗАВЕДЕНИЕ МЗ УКРАИНЫ

“УКРАИНСКАЯ МЕДИЦИHСКАЯ СТОМАТОЛОГИЧЕСКАЯ

АКАДЕМИЯ”

М Е Т О Д И Ч Е С К И Е Р А З Р А Б О Т К И

ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕHТОВ ІІ КУРСА МЕДИЦИНСКОГО ФАКУЛЬТЕТА

ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ И БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ (МОДУЛИ II-ІІІ)

Полтава – 2010

Авторы: д.м.н., профессор Л.М. Тарасенко, д.м.н., профессор К.С. Непорада, к.б.н., доцент В.К. Григоренко, к.б.н., ст. преп. С.В. Харченко, к.м.н., доцент Л.Г. Нетюхайло, М.В. Билець, О.Е. Омельченко, Н.Н. Прислопская.

Методические	разработки по биологической и биоорганической химии
(ІІ-V модули) для самостоятельной работы студентов медицинского факультета. –
Полтава, 2006. –	с. Русским языком.

Методические разработки для самостоятельной работы студентов по биологической и биоорганической химии (І-V модули) высших медицинских заведений образования ІV уровня аккредитации подготовлены в соответствии с программой “Биологическая и биоорганическая химия”, которая составлена сотрудниками опорной кафедры биоорганической, биологической и фармакологической химии Национального медицинского университета имени О.О. Богомольца (заведующий кафедры – член-корреспондент АМН Украины, заслуженный деятель науки и техники Украины, профессор Ю.И. Губский). Учебный материал структурирован на 5 модулей, что отвечает стандартам учебы, согласно основ Болонского процесса, и способствует повышению качества подготовки студентов. Учебное пособие рассчитано на 2-х часовые занятия, содержит последовательность и указания к учебным действиям, перечень практических навыков и видов индивидуальных, самостоятельных работ, а также список обязательной и дополнительной литературы.

Рецензенты: заслуженный деятель науки и техники Украины, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии В.П. Мищенко.

доктор медицинских наук, профессор кафедры экспериментальной и клинической фармакологии Т.А. Девяткина.

2

ПАМЯТКА СТУДЕНТУ!

Дисциплина “БИОЛОГИЧЕСКАЯ И БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ” структурирована на 3 модуля:

Модуль 1. Биологически важные классы биоорганических соединений. Биополимеры и их структурные компоненты.

Модуль 2. Общие закономерности метаболизма. Метаболизм углеводов, липидов, аминокислот и его регуляция.

Модуль 3. Молекулярная биология. Биохимия межклеточных коммуникаций.

Биохимия тканей и физиологических функций.

Учебный план по дисциплине “Биологическая и биоорганическая химия” для студентов медицинского факультета

Структура	Количество часов, из них					Курс
		Аудиторных
учебной						обучени	Виды контроля
	Всего		Практически	СРС
дисциплины		Лекций				я
			х занятий
	270	50	150	70		1-2
Кредиты ECTS	9,0
Модуль 1	60год/2,0						Текущий и итоговый
	кредиты	10	30	20		1	(стандартизированны
	ECTS						й)
Модуль 2	105год/3,5						Текущий и итоговый
	кредиты	20	60	25		2	(стандартизированны
	ECTS						й)
Модуль 3	10год/3,5						Текущий и итоговый
	кредиты	20	60	25		2	(стандартизированны
	ECTS						й)
В том числе,
итоговый	29год/1,0
контроль	кредиты	-	14	15
усвоения	ECTS
4 модулей
Недельная			6,75год / 0,23 кредита ECTS
нагрузка
Примечание: 1 кредит ECTS – 30 часов
Аудиторная работа - 74%, СРС – 26%

3

МОДУЛЬ 2 ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ МЕТАБОЛИЗМА

МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ, ЛИПИДОВ, АМИНОКИСЛОТ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ.

Тема 1. Предмет, задачи, основные этапы и современные направления развития биохимии. Цель и методы проведения биохимических исследований, их клинико-диагностическое значение.

Актуальность темы.

Биохимия – фундаментальная наука и учебная дисциплина, которая изучает химический состав живых организмов и химические превращения биомолекул. Только знание молекулярных механизмов функционирования организма обеспечивает глубокое понимание механизмов патогенеза, биохимической диагностики, профилактики и лечения важнейших заболеваний человечества.

Знания биохимии необходимы для изучения физиологии, микробиологии, фармакологии, общей патологии и клинических дисциплин. Без крепкого фундамента теоретических дисциплин невозможное формирование высококвалифицированного врача.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Изучение химического состава живых организмов и химических реакций биомолекул, которые входят в состав этих организмов.

Конкретные цели:

1.Анализировать этапы и закономерности становления биохимии как медикобиологической науки и учебной дисциплины.

2.Объяснять принципы и основы методов биохимических исследований функционального состояния организма человека в норме и при патологии.

3.Использовать результаты биохимического анализа для оценки состояния определенных звеньев обмена веществ.

Исходный уровень знаний-умений. Знать химический состав живых организмов и структуру биоорганических соединений.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание		и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
Контроль	исходного	уровня
знаний.
1. Определение биохимии как			1.1.	Биохимия как наука.
биологической	науки.	Задачи	1.2.	Задачи биохимии.
биохимии.			1.3. Основные этапы развития биохимии.
			1.4. Значение биохимии для диагностики и
			лечения основных заболеваний человека.
2. Разделы биохимии.			2.1. Статическая биохимия.
			2.2. Динамическая биохимия.
			2.3. Функциональная биохимия.
			2.4. Клиническая биохимия как раздел
			биохимии.

4

3. Цель и методы проведения	3.1. Объекты изучения биохимии.
биохимических исследований, их	3.2. Цель биохимических лабораторных
клинико-диагностическое	исследований.
значение.	3.3. Материал и принципы забора
	материала для исследования (подготовка
	больного, забор крови, забор мочи).
	3.4. Критерии оценки метода лабораторных
	исследований (достоверность, точность,
	специфичность,	чувствительность	и
	ошибка метода).
	3.5. Клинико-диагностическое значение
	биохимических исследований.

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Подготовить реферат из истории развития биохимии: а) направления развития биохимии;

б) основополагающие открытия в отрасли структуры и функциональной роли белков.

Правила работы в биохимической лаборатории.

1.Лабораторные исследования начинать после инструктажа преподавателя, строго придерживаясь методики (алгоритма) исследований.

2.При проведении лабораторных исследований быть внимательным, аккуратным и точным.

3.Работу с опасными реактивами проводить под вытяжкой.

4.Придерживаться инструкций к работе на приборах и оборудовании.

Порядок работы на ФЭК:

1.Колориметр включить в сеть за 15 мин. до начала измерений. Во время прогревания кюветное отделение должно быть открыто.

2.Выставить необходимый для измерения цветной светофильтр.

3.Установить минимальную чувствительность колориметра.

4.Перед измерением проверить установку стрелки колориметра на “0” при закрытом кюветном отделении.

5.По ходу светового луча поместить кювету с раствором.

6.Закрыть крышку кюветного отделения.

7.Снять показатели по шкале колориметра.

8.Выключить прибор из сети.

Порядок работы с использованием водяной бани:

1.Установить баню на подставку или стол.

2.Уровень воды в бане должен быть не более 2/3 объема посуды.

3.Окунуть в баню штатив для пробирок.

4. На сложной вилке бани установить переключение мощности в положение “700 В.А.”, что отвечает ускоренному нагреванию. Вилку вставить в электрическую сеть.

5.После закипания води переключатель перевести в положение “350 В.А.”, что отвечает рабочему режиму.

6.Во время работы поддерживать нужный уровень воды в бане.

Алгоритм лабораторной работы.

5

Качественный анализ биологической жидкости на содержание белков и аминокислот.

1) Нингидриновая реакция на аминокислоты.

Принцип реакции. Нингидрин при нагревании с α-аминокислотами вызывает образование из них альдегида с освобождением CO2 и NH3, и восстановленного нингидрина. Аммиак реагирует с восстановленным нингидрином, образовывая комплекс сине-фиолетового цвета.

Ход качественного определения аминокислот. В пробирку налить 0,5 мл раствора аминокислоты и добавить 0,5 мл 1% раствора нингидрина в спирте. Перемешать и нагревать на водяной бане 5 минут. Наблюдается сине-фиолетовая окраска.

2) Биуретовая реакция на белки.

Принцип реакции. Ионы меди (Cu2+) в щелочной среде образуют с пептидными группами (кислото-амидная или пептидная связь) комплексное соединение синефиолетового цвета.

Ход качественного определения белков.

В пробирку налить 0,5 мл раствора белка и 0,5 мл биуретового реактива. Развивается сине-фиолетовая окраска.

Тема 2. Исследование строения и физико-химических свойств белков-ферментов.

Актуальность темы.

Ферменты это биологические катализаторы реакций обмена веществ. Белковая природа ферментов обусловливает их высокую лабильность в зависимости от многих факторов. Так, в зависимости от температуры тела человека, а также от рН внутренней среды организма активность ферментов может изменяться, что приводит к развитию патологических процессов.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Изучить физико-химические свойства белков-ферментов.

Конкретные цели:

1.Анализировать механизмы регуляции основных метаболических процессов;

2.Трактовать биохимические закономерности строения и функционирования разных классов ферментов;

3.Анализировать физико-химические свойства белков-ферментов.

Исходный уровень знаний-умений: знать строение белков, классификацию и структуру протеиногенных аминокислот.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание	и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1. Практическое	изучение	1.1. Доказать белковую природу
физико-химических	свойств	ферментов биуретовой реакцией, реакцией
белков-ферментов.		Фоля. Объяснить принципы метода.

6

1.2.Объяснить термолабильность ферментов на примере определения активности амилазы слюны, которая предварительно нагрета или охлаждена и предварительно не обработана.

1.3.Изучить зависимость активности амилазы слюны от рН среды.

2.	Ферменты		как	2.1. Физико-химические свойства белков-
биологические		катализаторы		ферментов.
реакций обмена веществ.				2.2.	Электрохимические			свойства,
				растворимость.
				2.3.	Термодинамическая			стабильность
				белковых молекул ферментов; денатурация.
3.	Строение	ферментных		3.1.	Апофермент,			кофермент
белков.	Простые	и	сложные(простетическая группа). Олигомерные белки-
ферменты.				ферменты, мультиэнзимные комплексы.
				3.2.	Мембранно-ассоциируемые
				ферменты.
4.	Методы	выделения		4.1. Ультрацентрифугирование.
ферментов из биообъектов.				4.2.	Гель-	и	ионообменная
				хроматография.
				4.3. Электрофорез.

Алгоритм лабораторной работы.

1. Доказать белковую природу ферментов биуретовой реакцией, реакцией Фоля.

1.1. Биуретовая реакция на белки:

Принцип реакции: ионы меди (Cu2+) в щелочной среде образуют с пептидными группами комплексное соединение сине-фиолетового цвета.

Ход работы: в пробирку налить 0,5 мл исследуемого раствора и 0,5 мл биуретового реактива. Развивается сине-фиолетовая окраска.

1.2. Реакция Фоля.

Принцип метода: при нагревании раствора белка, в котором есть остатки серусодержащих аминокислот (цистеин) с растворами щелочи и соли свинца, сера образует черный осадок PbS.

Ход работы: в пробирку налить 0,5 мл исследуемого раствора, добавить 1 мл реактив Фоля. Нагревать на водяной бане до образования черного осадка.

2. Изучение термолабильности ферментов.

Слюну развести в 5 раз (1 мл слюны + 4 мл воды). 2 мл разведенной слюны кипятить 5 минут. В 3 пробирки налить по 10 кап. 1% раствора крахмала. В первую пробирку прибавить 10 кап. воды (контроль), во вторую – 10 кап. охлажденной прокипяченной слюны, в третью – 10 кап. разведенной слюны.

Все пробирки поместить в водяную баню или термостат при температуре 38 0С на 10 минут. После этого выполнить качественные реакции на крахмал и продукты его гидролиза (глюкозу и мальтозу).

Реакция на крахмал: к 5 кап. исследуемого раствора добавить 1 кап. раствора Люголя (КІ3). В присутствии крахмала появляется синяя окраска

Реакция Фелинга: к 5 кап. исследуемого раствора добавить 3 кап. раствора Фелинга (CuSO4 + NaOH), подогреть. В присутствии глюкозы или мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди.

7

3. Изучение зависимости активности ферментов от рН среды.

Слюну развести в 10 раз (1 мл слюны + 9 мл воды). В 3 пробирки налить по 1 мл буферных растворов с рН 3; 7,4; 14. В каждую пробирку отмерять по 1 мл разведенной слюны, по 1 мл 1% раствора крахмала, перемешать и инкубировать 10 мин. при температуре 38 0 С. После этого под контролем индикаторной бумаги нейтрализовать содержание пробирки с рН 3 - раствором щелочи, а содержание пробирки с рН 14 – раствором 0,1н HCl.

Результат опыта выявить с помощью раствора Люголя, добавляя его по 1-2 кап. в каждую пробирку, размешать, отметить окраску и сделать выводы.

Тема 3. Определение активности ферментов. Единицы измерения каталитической активности ферментов. Исследование ферментативных процессов по типу реакций основных классов ферментов.

Актуальность темы.

Количественное определение активности ферментов в биологическом материале используется для диагностики разных болезней. Так при остром панкреатите повышается активность амилазы в крови и моче.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Анализировать изменение активности фермента амилазы в биологических жидкостях. Изучение международной классификации ферментов по типу реакций.

Конкретные цели:

1.Количественно определять активность амилазы в моче за Вольгемутом, трактовать полученные результаты.

2.Трактовать международную классификацию и номенклатуру ферментов по типу реакций.

Исходный уровень знаний-умений: знать постепенный гидролиз молекулы крахмала к мальтозе через стадию декстринов. Знать типы химических реакций.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание			и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое		изучение	1.1.	Определение активности	амилазы
определения амилазы слюны.				слюны.
2.	Методы	определения		2.1. На конкретных примерах объясните
активности ферментов.				принципы методов определения активности
				ферментов:
				а) по количеству продукта, который
				образуется под действием фермента за
				единицу времени;
				б) по количеству потраченного субстрата
				за единицу времени;
				в)	спектрофотометрические	методы
					8

		определения активности ферментов и
		визуализация результатов ферментативной
		реакции.
		2.2. Единицы измерения активности и
		количества ферментов:
		а) международные единицы;
		б) катал;
		в) удельная активность фермента.
3.	Международная	3.1. Объяснить принцип международной
классификация	и номенклатура	классификации и номенклатуры ферментов.
ферментов по типу реакций.		3.2. Назвать шесть классов ферментов и
		объяснить типы катализированных реакций.

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Сделать реферативный доклад по теме: ”Роль поджелудочной железы в возникновении гиперамилаземии и гиперамилазурии”.

Алгоритм лабораторной работы.

Количественное определение активности амилазы.

Принцип определения активности амилазы по Вольгемуту:

Метод основан на способности амилазы расщеплять (гидролизовать) крахмал. Находят такое разведение слюны, которое расщепляет 2 мг крахмала (в 2 мл 0,1% раствора крахмала) за 30 минут при t=38 0С. Потом рассчитывают количество крахмала, которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны.

В норме активность амилазы слюны – 160-320 ус.ед.

Ход работы.

В 10 пробирок наливают по 1 мл воды. В 1-ю пробирку добавляют 1 мл слюны, разведенной в 10 раз, перемешивают. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее в 2-ю пробирку, из нее – таким же образом в 3-м и т.д до 10-и пробирке. Из 10-и пробирки 1 мл смеси выливают. Во все пробирки доливают по 1 мл воды и по 2 мл крахмала, перемешивают и оставляют в термостате на 30 минут при t=38 0 С. Через 30 минут пробирки вынимают и добавляют по 1 капли раствора Люголя, перемешивают. Жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвета. Отмечают последнюю пробирку с желтым цветом, где гидролиз крахмала прошел полностью и проводят расчет.

Расчет:

Отмечают пробирку, где гидролиз крахмала прошел полностью. Например, желтый цвет появился в 4-й пробирке, где слюна разведена в 160 раз. Соответственно, 1/160 мл слюны расщепляет 2 мл 0,1% раствора крахмала, а 1 мл неразведенной слюны будет расщеплять Х мл 0,1% раствора крахмала:

1/160 мл - 2 мл

1мл - Х мл

		2 1 160
	Х=		= 320 мл 0,1% раствора крахмалю.
		1

Таким образом, амилазная активность слюны равняется 320 у.е.

9

Тема 4. Исследование механизма действия ферментов и кинетики ферментативного катализа.

Актуальность темы. Сложное строение и функциональная организация ферментов частично является ключом к пониманию характерных свойств ферментов

– высокой специфичности и скорости катализа. Большую роль в развитии представлений о механизме действия ферментов сыграли классические работы Михаэлиса и Ментен, которые разработали положение о фермент-субстратных комплексах.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Изучение механизмов действия ферментов и кинетики ферментативного катализа. Знать методы определения активности ферментов, а также уметь интерпретировать эти методы.

Конкретные цели:

1.Анализировать механизмы действия ферментов.

2.Объяснить методы определения активности ферментов

3.Объяснить кинетику ферментативного катализа.

Исходный уровень знаний-умений. Знать биологическую роль и структуру ферментов, физико-химические свойства белков.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание		и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое	изучение	1.1.	Определение			активности
определения		активности	холинестеразы.
холинестеразы.
2.	Механизмы	действия	2.1. Термодинамические закономерности
ферментов.			ферментативного катализа.
			2.2. Активные центры ферментов. Отличия
			строения активных центров у простых и
			сложных ферментов.
			2.3. Ферментативное			превращение
			субстратов	при	каталитическом		действии
			фермента	на		примере	действия
			химотрипсина		и	ацетилхолинестеразы.
			Последовательность этапов каталитического
			процесса.
3.	Кинетика ферментативных		3.1. Зависимость скорости реакций от
реакций.			концентрации фермента, субстрата, рН и
			температуры.
			3.2. Константа Михаелиса-Ментен, ее
			смысловое значение.

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Подготовить рефераты из раздела «Механизм действия ферментов»:

А) «Механизм действия антиметаболитов на обмен веществ и их клиническое применение»;

В) «Механизм действия ферментов в очаге воспаления».

10