Алемасова - Лекции по аналитической химии

полипиррольной пленкой. В качестве фермента использовали глюкозоксидазу. Объем образца, требуемый для анализа, составляет всего 50 мкл. Сенсор можно использовать для проточно-инжекционного определения глюкозы.

В лабораторных условиях холестерин определяют с использованием ферментативной колориметрической реакции и автоматического анализатора. При этом для анализа используют цельную кровь, плазму либо сыворотку. Этот способ не пригоден для тестирования холестерина в домашних условиях.

Другое описанное тест-устройство для определения холестерина в плазме или сыворотке крови содержит набор из трех реагентов: реагент 1 содержит полианион и полимер в жидкости; реагент 2 – детергент в жидкости; реагент 3 – лиофилизированный порошок холинэстеразы, холестериноксидазы. Устройство позволяет определять липопротеины высокой плотности на фоне липопротеинов низкой плотности. Нераспечатанное устройство при температуре 2 – 8°С хранится длительное время, в распечатанном устройстве – не более 3 недель. Устройство можно применять только в лабораториях, поскольку пробоподготовка включает центрифугирование. Относительное стандартное отклонение – менее 0,015. В качестве реагентов используют смесь 4-аминоантипирина и фенола, образующих при действии Н2О2 хинонимин красного цвета, имеющий максимум светопоглощения при 500 нм.

Тестовый вариант без центрифугирования пробы включает дополнительно декстрансульфат магния (молекулярная масса 5·104), который осаждает липопротеины очень низкой и низкой плотности, оставляя в растворе липопротеины высокой плотности.

Разработан простой визуальный колориметрический очень чувствительный метод определения холестерина в моче с использованием мембранного фильтра. Окрашенный в зеленовато-желтый цвет мембранный фильтр сразу же после фильтрования раствора пробы, содержащего также бромхлорфенол голубой, и высушивания при 60°С в течение 10 минут, изменяет цвет на темно-синий. В присутствии холестерина образуется ионный ассоциат с избытком реагента, который сорбируется на мембранном фильтре и при высушивании приобретает синий цвет двухзарядного аниона красителя.

При анализе крови определяют также гемоглобин, лактаты, активность холинэстеразы. При анализе мочи определяют ее плотность, рН, белок, кетоновые тела, билирубин, уробилиноген, следы крови, гемоглобин, фенилкетоны, α-амилазу, лейкоциты, аскорбиновую, молочную кислоты, нитриты, хлориды и медь(II). Для всех этих компонентов разработаны тест-методы.

Тест на белки в моче является следующим по важности после тестирования на глюкозу. В основе теста на белки лежит реакция калиевой соли

271

этилового эфира тетрабромфенолфталеина с альбумином мочи при действии уксусной кислоты. Синий цвет раствора реагента при введении уксусной кислоты в присутствии альбумина изменяется на зеленый, а при избытке альбумина – на желтый. Тест позволяет обнаружить по 0,5 мкг альбумина, казеина, гемоглобина, клупеина, салмина, 1 мкг глиадина, 5 мкг эдестина.

Для определения нитрита в моче используют реакцию Грисса. Сульфаниловая кислота (1) в разбавленной уксусной кислоте с нитритом дает красное окрашивание. При этом сульфаниловая кислота диазотируется азотистой кислотой, а образовавшееся диазосоединение (2) с нафтиламином (3) образует азокраситель (4) красного цвета:

HO3S	NH2		+ HNO + H+		HO3S	+	N + 2H		O
						N
			3				2
	1					2
				NH2					+
	+				HO3S	N	N		NH3
HO3S		+
	N N
			3					4

При тестировании рН имеют в виду, что для мочи он изменяется в диапазоне 4,5 – 8,0 (норма рН 5–6). В первых тестах на рН мочи использовали лакмусовую бумажку. Сейчас используют полоски бумаги, смоченные смесью метилового красного и бромтимолового синего, изменяющие окраску из оранжевой в синюю в диапазоне рН 5 – 9.

Для тест-определения хлоридов в моче используют тест-полоски, смоченные комплексом серебра с 2-(2-тиазолилазо) -п-крезолом, полученным в среде 2-(N-морфолин)этансульфоната и метанола в присутствии гуммиарабика. Для определения хлорид-ионов в слюне и других жидкостях организма с пределом обнаружения 2 мг/л используют индикаторную реакцию с Ag2CrO4. Для тестирования меди в моче рекомендованы тестполоски, содержащие 4-(3,5-дибром-2-пиридилазо)-N,N-диалкиланилин, аскорбиновую кислоту, ПАВ и буферные вещества (рН 4,5 – 7,5).

Известны тест-методы обнаружения паров алкоголя, наркотиков, отравляющих и взрывчатых веществ. Определение наркотических веществ часто проводят в клинической и судебной медицине. Состав политестов на наркотики представлен в табл. 19.3.

272

Таблица 19.3. Тест-методы для определения наркотиков

Вид наркотика			Состав реагентов			Цветовые метки
Марихуана,			Порошок прочного синего Б;			От оранжевой до
гашиш			смесь (1:3) хлороформ – ССl4			пурпурно-красной
Опий,	маковая		10%-ный раствор формалина в			Фиолетовая		окра-
соломка			серной кислоте, CHCl3; 5%-ный			ска верхнего слоя
			раствор K2CO3
Морфий,		геро-	2%-ный раствор формалина в			Фиолетовая		(мор-
ин,	кодеин,		серной кислоте, Al2O3 (нейтрали-			фин, героин), сине-
промедол,		ам-	затор)			фиолетовая		(коде-
фетамины						ин), красная (про-
						медол),	оранжевая
						или	коричнево-
						бурая (амфетамин)
Барбитураты			5%-ный раствор Co(NO3)2 в изо-			Сиреневая
			пропаноле; 10%-ный раствор пи-
			ридина в изопропаноле
Героин			Бромфеноловый синий в буфер-			Пурпурная
			ном растворе (рН 5), CHCl3
Кокаин			2%-ный раствор роданида ко-			Голубая		окраска
			бальта, CHCl3			нижнего слоя
Амфетамины			1%-ный раствор нитропруссида			Темно-розовая
			натрия в 5%-ном водном раство-
			ре ацетона;	2%-ный	раствор
			K2CO3
Эфедрин			0,5 M водный раствор CuSO4; н-			Фиолетовая		окра-
			бутанол; 10%-ный раствор K2CO3			ска верхнего слоя
ЛСД			5%-ный	раствор	п-	Красно-фиолетовая
			диметиламинобензальдегида в
			смеси (1:1)	этанола и	H3PO4;
			Al2O3
Морфин,		коде-	0,3%-ный раствор молибдата ам-			Фиолетовая (мор-
ин, героин			мония в конц. H2SO4; Al2O3			фин, героин), бу-
						тылочно-зеленая
						(кодеин)
Барбитураты			0,5%-ный раствор CuSO4 в 5%-			Голубая окраска
			ном растворе пиперидина; CHCl3			нижнего слоя

Эти тесты изготовлены в виде полиэтиленового пенала с полупрозрачными реакционными контейнерами, двумя стеклянными ампулами с химическими реагентами и двумя полиэтиленовыми пробками. При нажа-

273

тии на пробки ампулы разрушаются и их содержимое поступает в реакционный контейнер, в который предварительно помещена проба исследуемого объекта. Некоторые тесты дополнительно снабжены стандартными тю- бик-капельницами с водными растворами карбоната калия различных концентраций. Тест на опий и соломку мака снабжен дополнительным контейнером для экстракций. Тесты, содержащие ампулы с концентрированными кислотами, снабжены ампулами с оксидом алюминия для нейтрализации среды.

Для быстрого обнаружения 0,005 – 1 мг/л морфия в крови и моче в ургентной медицине используют бумагу, смоченную раствором, содержащим антитела против морфия, глюкозоксидазу, 4-хлор-1-нафтол, фосфат натрия, альбумин, конъюгат пероксидазы с морфием, глюкозу. В тесте на амфетамин, кокаин, марихуану, морфий бумагу обрабатывают смесью основного нитрата висмута, KI, K2PtCl4. При тестировании гашиша и марихуаны силикагель импрегнируют прочным синим Б и NaOH.

19.4. Иммунологический тест беременности

Иммунологическая химия позволили создать большое количество высокочувствительных тестов для быстрого анализа во время операций и для домашней диагностики. Примером последнего является тест на наличие беременности, который проводится с использованием мочи. Все подобные тесты основаны на определении в моче уровня человеческого гормона гонадотропина, который появляется в моче женщины во время беременности и может быть использован для ее раннего обнаружения.

Принцип действия у всех таких тестов совершенно одинаковый. Дело в том, что из зиготы формируется не только зародыш, но и зародышевые, а затем плодные, оболочки. Одна из оболочек – хорион - вырабатывает собственный гормон - хорионический гонадотропин. С помощью тестов можно определить содержание этого гормона в крови или моче. Механизм определения заключается в иммунологической реакции антиген-антитело, которая происходит на поверхности бумажной полоски. При наличии в исследуемой жидкости гонадотропина происходит каскадная активация иммуноферментной реакции, в результате которой исследуемый материал (моча) окрашивается обычно в розовый цвет.

Антитела к гонадотропину нанесены в виде двух тонких линий, одна из которых контрольная, содержащая заведомо достаточное количество этого гормона. Поэтому при наличии в исследуемой жидкости (моче) гонадотропина происходит окрашивание обеих линий, а при его отсутствии – только одной. Если ни одна линия не окрасилась, это означает, что тест дефектный, негодный для определения беременности.

Хорионический гонадотропин начинает вырабатываться с седьмых – восьмых суток беременности, но диагностическая его концентрация в моче

274

достигается только к десятым суткам. И если условно считать, что продолжительность лютеиновой фазы у женщины 13-15 дней, то прибавив с момента овуляции 3 дня на возможное оплодотворение и еще 10 на достижение диагностического титра гонадотропина, получим, что с помощью теста беременность можно определить с первого дня задержки менструации или даже за 1-2 дня до нее. Надежность таких тестов > 99%.

19.5. Сенсоры в анализе

Сенсорами (от лат. sensus – чувство) называют чувствительные элементы небольших размеров, генерирующие аналитический сигнал, интенсивность которого зависит от концентрации определяемого вещества в объекте. В отличие от тест-методов сенсоры позволяют проводить не визуальное, а инструментальное количественное измерение содержания вещества, связанное с предварительной градуировкой прибора по стандартам.

Сенсоры являются по сути дела основными элементами нового поколения аналитических приборов, включающих устройство для ввода пробы, чувствительный элемент, обработку аналитического сигнала и выдачу конечного результата о концентрации компонента. Для них характерны малая масса и габариты, автономный автоматизированный режим работы и малый расход энергии.

Существует три типа сенсоров: физические, химические и биосенсоры. В физических сенсорах под влиянием анализируемого вещества изменяются электрические, тепловые, магнитные или спектральные характеристики. Например, для определения СО2 используются кондуктометрические сенсоры, основанные на измерении электрической проводимости водного раствора диоксида углерода. Проводимость анализируемого раствора определяется концентрацией ионов Н+ и НСО3–, которая в свою очередь зависит от парциального давления СО2. Увеличение электропроводности анализируемого раствора по сравнению с холостым (без СО2) является аналитическим сигналом.

Отличительный признак химических сенсоров и биосенсоров – наличие рецептора – слоя молекул или частиц вещества, участвующего в химических, биохимических или биологических процессах, протекающих при контакте сенсора с определяемым компонентом объекта. Другим необходимым элементом сенсора является преобразователь энергии указанных аналитических процессов в электрический или световой сигнал. Далее этот сигнал обрабатывается в электронном блоке и подается на дисплей.

Примером биосенсоров могут служить ферментные электроды – это датчики, в которых ионоселективный электрод покрыт пленкой, содержащей фермент, способный вызвать реакцию органического или неорганического вещества (субстрата) с образованием веществ (ионов, молекул), на

275

которые реагирует электрод. В основе работы электрода лежит ферментативная реакция:

Определяемое вещество (субстрат) Фермент→ Ион (молекула)

В результате реакции образуется частица, обуславливающая отклик электрода. Селективность ферментных электродов очень высока, поскольку каждый фермент катализирует только какую-то определенную реакцию. На рис. 19.3 показана схема электрода для определения мочевины СО(NH2)2 на основе фермента уреазы:

Рис. 19.3. Ферментный электрод для определения мочевины: 1 – гель, содержащий фермент уреазу; 2 – стеклянная мембрана, селективная к NH4+- ионам; 3 – внутренний электрод сравнения; 4 – внутренний стандартный раствор NH4+; 5 – субстрат

В слое геля, содержащем уреазу, протекает реакция: CO(NH2)2 + 2H2O+ H+ Уреаза,буфер→2NH4+ + HCO3–

Концентрацию образующихся ионов аммония измеряют с помощью NH4+-селективного стеклянного электрода. При постоянной активности фермента потенциал этого электрода является функцией логарифма актив-

ности CO(NH2)2.

В табл. 19.4 приведены другие примеры использования ферментных электродов.

Таблица 19.4. Использование ферментных электродов Субстрат Фермент ЭлектрохиИндикаторный

мически акэлектрод тивная частица

Пенициллин	Пенициллиназа	Н+	Стеклянный	рН-
			чувствительный
Мочевина	Уреаза	NH4+	Стеклянный	NH4+-
			чувствительный
Муравьиная	Алкогольоксидаза	СО2	СО2-газовый

276

кислота			Стеклянный	рН-
Глюкоза	Глюкозооксидаза	Н+
			чувствительный
Фосфат-ион	Щелочная фосфата-	О2	Платиновый
	за

Химические сенсоры дают прямую информацию о составе среды без отбора пробы и ее какой-либо предварительной подготовки. Они могут работать автономно и обычно связаны с системой накопления информации и ее обработки. На основе сенсоров конструируют сенсорные анализаторы, представляющие собой батарею отдельных сенсоров, каждый из которых дает информацию о содержании отдельного компонента. С помощью таких мультианализаторов проводится экспрессное определение уровня электролитов крови и других физиологических жидкостей, исследуется поведение лекарств, химически вредных веществ, наркотиков.

19.6. Иммунный анализ

Иммунный анализ использует уникальную специфичность антитела, связывающего антиген, с целью селективно распознать и определить вещества, которые являются антителами или антигенами.

Антитело представляет собой белок со специфичным доменом, связывающим антигены. Антигены – это биополимеры (главным образом белки и полисахариды), способные вызвать иммунный ответ, т.е. вызывающие развитие иммунологических реакций. Можно добиться высокой селективности иммунного анализа, потому что другие соединения в пробе распознаваться не будут. Антитела представляют собой один из главных классов белков, объединенных названием иммуноглобулины. Антиген не обязательно должен быть белком; это может быть любая макромолекула, которая способна индуцировать иммунный ответ и, таким образом вызвать образование антител против нее. Молекулы с низкой молекулярной массой (такие, как гормоны или наркотики, являющиеся предметом анализа) не являются антигенными, но можно создавать антитела с активными центрами, специфичными к этим молекулам, соединяя их с белковым носителем. Такие низкомолекулярные соединения известны как гаптены.

Антитела продуцируются В-лимфоцитами, причем каждая В-клетка проявляет на своей поверхности только одну специфичность, так что инородный антиген связывают только клетки с «подходящими» активными центрами. Это связывание стимулирует деление таких клеток и образование большого количества иммуноглобулинов с той же специфичностью. Активный центр может быть лишь небольшой частью всей молекулы антигена, и, таким образом, у одного и того же антигена может быть несколько потенциальных активных центров. Результатом этого процесса

277

становится образование сыворотки, содержащей неоднородную смесь антител с разнообразным сродством. Такие сыворотки известны как поликлональные и, в отличие от моноклональных антител, в их кинетику распознавания вносит свой вклад каждый из активированных распознающих центров или эпитопов.

1.Основы аналитической химии. В 2-х книгах/ Под ред. Ю.А.Золотова. – М.: Высш.шк., 2004.

– Кн. 2. – С. 394-400, 482-489.

2.Васильев В.П. Аналитическая химия. В 2-х

книгах. – М.: Дрофа, 2002. – Кн. 2. – С. 357-

3.Золотов Ю.А., Иванов В.М., Амелин В.Г. Химические тест-методы анализа. – М.: Едиториал УРСС, 2002. – 304 с.

278

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

Абсорбционность – 224 Адсорбция – 31

физическая – 32 капиллярная – 32

Активность – 63 Анализ – 8

активационный – 261 атомно-абсорбционный –

223

атомно-флуоресцентный –

229

дробный – 8 иммунный – 277 качественный – 8 качественный атомно-

абсорбционный – 223 качественный спектральный

– 217

количественный – 9 кондуктометрический – 214 люминесцентный – 241 нестандартные методы – 122 по спектрам комбинацион-

ного рассеяния – 251 рентгеноспектральный – 245 стандартные методы – 122

Аналит – 8 Аналитическая

группа – 20 концентрация – 65 химия – 8

Аналитический сигнал – 10 Аналитическая группа - 20 Аниониты – 51 Анионообменники – 51 Ассоциаты ионные - 34 Аргентометрия – 186

метод Мора – 188 метод Фольгарда – 188 метод Фаянса – 189

Атомизаторы – 225 Атомизация – 227

Ауксохромы – 166

Биосенсоры – 12 Буферные растворы – 69 Буферная ёмкость – 72.

Валиномицин – 109 Виды люминесценции – 241

Внутрикомплексные соединения –

97

Внутренный электролиз – 213 Вода

стехиометрическая – 127 нестехиометрическая – 127

Возгонка – 39 Волна полярографическая – 206

Вольтамперометрия – 204 Воспроизводимость – 136 Выборка случайная – 136 Выборочная совокупность – 136 Выход энергетический – 243

Гальванический элемент – 114 Гетерогенные процессы – 76 Генеральная совокупность – 136 Гидролиз – 73 Гипотеза аналогий – 98 Гравиметрия –

Гравиметрическая форма – 142 Градуировочная функция – 15 Градуировочный график – 15 Группа

аналитическая – 20 функционально-

аналитическая – 100 хромофорная – 165

Групповые реагенты – 20

Декантация – 148 Демаскирование – 11 Дентатность – 87 Деполяризатор – 206

279

Детекторы – 220, 228, 236, 240

визуальные – 220 фотографические – 220 фотоэлектрические – 220

Диализ – 38 Диметилглиоксим – 103 Дисперсия – 137 Дистилляция – 39 Дитизон – 107

Доверительный интервал – 139 Доверительная вероятность – 139

Ёмкость ионообменника – 31

Закон

распределения – 35 действия масс – 66 нормального распределения

– 138

эквивалентов – 151 Фарадея – 212 Ламберта-Бугера-Бера – 224 светопоглощения – 234 аддитивности – 235 Вавилова – 243 Стокса-Ломмеля – 243 Мозли – 246 Вульфа-Брэгга – 247 радиоактивного распада –

259

Зонная плавка – 39

Излучение резонансное – 223

радиоактивное – 258 Измерение

погрешность – 133 правильность – 135 сходимость – 135 воспроизводимость – 136 точность – 136

Изоморфизм – 32 ИК-спектроскопия – 239

Индикаторная ошибка – 167 Индикаторы титрования

кислотно-основного – 163 природные – 163 синтетические – 163 окислительно-

восстановительного – 173 комплексонометрии – 183 аргентометрии – 188

Индикаторы металлохромные – 183 адсорбционные – 189

Интервал перехода окраски индикаторов

кислотно-основных – 165 окислительно-

восстановительных – 174 Иодометрия – 175 Ионизационные счетчики – 260 Ионная сила – 64 Ионометрия – 202

Источники излучения – 219, 236, 240

Источники резонансного излучения

лампы с полым катодом –

224

высокочастотная безэлектродная лампа – 225

Катиониты – 51 Катионообменники – 51 Квантовый выход – 243 Квантометры – 221 Коллектор – 30 Комплексонаты – 108 Комплексные соединения – 86 Комплексоны – 108, 179 Комплексы

инертные – 88 лабильные – 88

Константа распределения – 35

280