Генетика вірусів

Розділ 5

ГЕНЕТИКА ВІРУСІВ

Вірусам, як і більш досконалим живим істотам, притаманні спад- ковість та мінливість. Дослідженням саме цих властивостей за- ймається генетика вірусів. Зміст і специфіка цієї наукової дисци- пліни визначаються біологічними особливостями вірусів, найваж- ливішими з яких є відносна простота організації, надзвичайна різ- номанітність генетичного матеріалу і популяційна структура.

Увірусів існує рівень організації, який знаходиться вище рівня організації індивідуальної вірусної частинки (віріона). Це — попу- ляційний рівень. Вірус, що розмножується в організмі хазяїна, в біологічному плані не механічне скупчення віріонів, а певна спілка

зознаками і властивостями популяції. Еволюція, гомеостаз, регуля- ція чисельності та інші важливі процеси, що відбуваються у вірус- них популяціях, здійснюються на основі біологічних і генетичних законів. Ці закони вивчає спеціальний розділ генетики вірусів —

популяційна генетика.

Увищих організмів сфери дослідження класичної, молекулярної та популяційної генетики чітко розмежовані. Класична і молеку- лярна генетика вивчають структурну організацію та функції гене- тичного матеріалу на рівні особини, гена й молекулярних структур, а популяційна — на рівні популяції. У вірусів ця межа стирається.

Об’єктом генетичного дослідження вірусів здебільшого є не окре-

мий віріон і його геном, а величезна за чисельністю вірусна попу- ляція та генетичні явища, що відбуваються в ній, а також популя- ція генів, молекулярних структур і генних продуктів. Генетичне і молекулярно-генетичне дослідження вірусів проводиться на попу- ляційній основі. Кінцева мета генетичного дослідження вірусів — розуміння деталей структури і функції вірусного геному та кожного

згенних продуктів. Генетичну методологію використовують для ви- вчення патогенезу вірусних інфекцій і противірусного імунітету, якщо потрібно зіставити специфічні властивості вірусу з індивідуа- льними генами й генними продуктами.

СТРУКТУРНА ОРГАНІЗАЦІЯ ВІРУСНОГО ГЕНОМУ

Генетичний апарат вірусів, на відміну від клітинного геному, над- звичайно різноманітний. Він представлений як ДНК, так і РНК, які бувають одно- і дволанцюговими, лінійними, фрагментованими і кільцевими, плюс-нитчастими і мінус-нитчастими (детальну ха-

рактеристику вірусних нуклеїнових кислот наведено в розд. 2 «Мор-

107

Розділ 5

фологія та хімічний склад вірусів»). Геном вірусів тварин гаплоїд-

ний. Виняток становлять ретровіруси, які мають диплоїдний геном,

представлений двома ідентичними молекулами одноланцюгової плюс-нитчастої РНК, що з’єднані між собою водневими зв’язками.

У спадковому апараті вірусів, як і в клітинних організмів, вико- ристовується триплетний генетичний код. Це означає, що три нуклеотиди в одноланцюгових молекулах або три пари нуклеотидів у дволанцюгових молекулах нуклеїнової кислоти утворюють три- плет (кодон) і кодують одну амінокислоту. А 1500 нуклеотидів чи їхніх пар кодують вірусний поліпептид середнього розміру, який складається з 500 амінокислот і має молекулярну масу 50 × 103 Д.

Кодувальна здатність вірусного геному визначається його моле- кулярною масою, яка коливається в межах (1,5…250) × 106 Д для ДНК і (2,4…20) × 106 Д для РНК.

Найдосконалішим генетичним матеріалом вірусів є дволанцюго- ва ДНК. Подвійний запис генетичного коду забезпечує глибокий консерватизм спадковості та створює передумови для збереження основних видових властивостей. Окрім того, ланцюги ДНК характе- ризуються високою міцністю й утворюють відносно великі молекули, які вміщують більше генетичної інформації порівняно з РНК. Тому саме ДНК відповідає потребам прогресивної еволюції, що веде до ускладнення структури і функції біологічних систем. Якщо як кри- терій еволюційного розвитку розглядати кодувальну здатність ге- ному, то очевидно, що ДНК-вмісні віруси просунулися по еволюцій- них щаблях значно далі, ніж РНК-вмісні.

Можливість збільшити ємність геному РНК-вмісних вірусів лімі- тується величиною 8,1 × 106 Д для одноланцюгових і 20 × 106 Д для дволанцюгових РНК. Це обмеження зумовлене відносно низькою фізичною та хімічною стабільністю молекули РНК, що зумовлене неміцним фосфодиефірним зв’язком на основі рибози і вільним ста- ном значної частини аміногруп азотистих основ. Максимальні роз- міри молекули РНК обмежені також механізмом її взаємодії з рибо- сомами. Збільшення ємності геному РНК-вмісних вірусів еволюцій- но йшло не за рахунок збільшення розмірів молекули РНК, а за- вдяки структурним змінам. Результатом цього процесу є фрагмен- тована будова і відносно більша кодувальна здатність геному орто- міксо-, арена-, бунья-, рео- і бірнавірусів. Фрагментований геном РНК-вмісних вірусів належить до великих еволюційних досягнень і є вершиною розвитку РНК-вмісних генетичних структур. За своєю біологічною суттю цей тип організації спадкового матеріалу нагадує хромосоми, які виникли внаслідок еволюції ДНК-вмісних генетич- них систем. Перевага фрагментованого геному полягає в тому, що в кількох фрагментах РНК, кожен з яких не досягає критичного роз- міру, міститься такий обсяг спадкової інформації, збереження якої не може забезпечити ціла молекула РНК. Окрім того, наявність

108

Генетика вірусів

фрагментів створює передумови для здійснення рекомбінацій, в ос- нові яких лежить обмін великими блоками спадкового матеріалу. Цей унікальний механізм слугує для РНК-вмісних вірусів із фраг- ментованим геномом могутнім джерелом спадкової мінливості, що збільшує їхню генетичну пластичність.

Ген у вірусів — це одиниця структурної та функціональної спад- ковості, яка є ділянкою ДНК або РНК, що кодує, як правило, один білок. Продуктами генів є структурні й неструктурні вірусні білки, в тому числі ферменти, які входять до складу віріона або утворюються в зараженій клітині та беруть участь в інфекційному циклі.

Вірусні гени, так само як і клітинні, мають мозаїчну структуру, тобто кодувальні ділянки — екзони — чергуються з інтронами — нуклеотидними послідовностями, які не несуть генетичної інфор- мації та не транслюються. При транскрипції зчитується весь ген, включаючи екзони та інтрони. Потім відбувається процесинг (дозрі- вання) іРНК: з утвореного довгого первинного транскрипта фермен- тативно видаляються ділянки, що відповідають інтронам, а ділян- ки, ідентичні екзонам, зшиваються. У результаті такої модифікації з первинного транскрипта утворюється зріла іРНК, яка містить про- граму синтезу білка. Процес посттрансляційного ферментативного вирізання інтронів і з’єднання екзонів називається сплайсингом (від англ. splice — з’єднувати, зрощувати кінці каната).

Сукупність усіх генів вірусу називається геномом. Незважаючи на те, що вірусний геном за молекулярною масою в 105 – 106 разів менший від клітинної ДНК (1,8 × 1012 Д), він успішно конкурує та примушує клітину функціонувати за генетичною програмою вірусу.

Кількість генів у ДНК-вмісних вірусів коливається від 3 до 160, а у РНК-вмісних — від 5 до 15. У вірусів із фрагментованим гено- мом кожен фрагмент представляє собою один ген.

Як відбувається регуляція активності вірусного геному? Адже в зараженій клітині всі події, пов’язані з репродукцією вірусу, мають упорядкований характер. У клітинній ДНК, поряд із структурними генами, в процесі еволюції виникли регуляторні (або функціональні)

гени. Вони визначають синтез білкових факторів, що контролюють ак- тивність структурних генів. Регуляторними генами, які контролюють транскрипцію, є підсилювач транскрипції та промотор — ділянка ДНК, що знаходиться безпосередньо перед структурними генами з бо- ку 3′-кінця полінуклеотидного ланцюга і визначає місце специфічного зв’язування РНК-полімерази. У вищих організмів функціональні гени займають більшу частину геному й утворюють диференційовану сис- тему регуляції його активності. Різні класи регуляторних генів (зокре- ма регулятори, оператори, репресори) є в бактерій і великих фагів.

Віруси хребетних знаходяться на різних ступенях цього еволюцій- ного шляху. Геном РНК-вмісних і дрібних ДНК-вмісних вірусів (пар- во- і цирковіруси), очевидно, повністю складається зі структурних ге-

109

Розділ 5

нів і не має у своєму складі спеціальних систем регуляції. Цю функ- цію виконують деякі структурні вірусні білки. Наприклад, капсидний білок вірусу поліомієліту бере участь у регуляції трансляції вірусної плюс-нитчастої РНК, блокуючи зв’язування рибосом із клітинними іРНК. Значна роль у регуляції дозрівання вірусів грипу належить матриксному білку, при взаємодії з яким відбувається зміна конфор- мації нуклеокапсидів, що є необхідною умовою формування віріонів потомства. Отже, у РНК-вмісних і дрібних ДНК-вмісних вірусів деякі структурні вірусні білки мають поліфункціональні властивості.

Ускладі геному великих ДНК-вмісних вірусів (покс-, герпес-, іридо-, асфар- та аденовіруси), а також у гепаднавірусів є регулятор- ні гени (в тому числі промотор), які контролюють функцію структур- них генів. Так, геном поксвірусів кодує синтез 15 ферментів, асоці- йованих із серцевиною, які беруть участь у транскрипції ДНК і ко- валентних модифікаціях РНК. У великих ДНК-вмісних вірусів ре- гуляторні функції виконують також неструктурні вірусні білки.

Геном РНК-вмісних і дрібних ДНК-вмісних вірусів складається з унікальних генів і не несе значної кількості іншої інформації. Це виключає присутність у вірусному геномі істотної генетичної надмірності, під якою розуміють наявність генів, що повторюють- ся, і некодувальних ділянок нуклеїнової кислоти.

Явище генетичної надмірності характерне для вищих організмів. Вона слугує внутрішнім джерелом генетичних нововведень, на її основі в надрах геному можуть формуватися нові гени з неіснуючи- ми раніше функціями. Генетична надмірність розглядається як ме- ханізм, здатний передбачити еволюційні потреби майбутнього і за- безпечити поступальний рух еволюції. Крім еволюційного значення для виду в цілому, генетична надмірність підвищує пристосованість окремої особини до мінливих умов навколишнього середовища. На- явність у геномі генів, що повторюються і дублюють одні й ті самі процеси, збільшує запас міцності генетичного апарату.

Отже, РНК-вмісні і дрібні ДНК-вмісні віруси позбавлені біологіч- них переваг, зумовлених генетичною надмірністю. У геномі великих ДНК-вмісних вірусів також немає дублювальних генів, але знахо- дяться ділянки олігонуклеотидних послідовностей, які повторюють- ся. Геном аденовірусів містить досить значну некодувальну ділянку, делеція (випадіння) якої не впливає на життєздатність вірусу.

Убагатьох вірусів молекулярна маса білків, які синтезуються, перевищує теоретично розраховану, виходячи з кодувальної здатно- сті вірусного геному. Цей феномен пояснюється наявністю у вірусів спеціальних механізмів, які дають змогу отримати розгорнуту гене- тичну інформацію при максимальній економії спадкового матеріа- лу. Такі механізми виробилися в процесі еволюції вірусів як генетич- них паразитів. Класичний принцип «один ген — одна молекула РНК — один білок» у вірусів порушується, і один вірусний ген може

110

Генетика вірусів

кодувати два білки. Наприклад, геном вірусів грипу А представле- ний одноланцюговою мінус-нитчастою фрагментованою РНК, яка містить 8 генів, з них 7-й і 8-й гени кодують по два білки.

Механізми збільшення генетичної інформації у вірусів різні:

1)дворазове зчитування з однієї й тієї самої іРНК, але з різних ініціювальних кодонів (АУГ); триплети при цьому зберігаються, ге- нетичний код не порушується, проте синтезуються поліпептиди різ- ної довжини, один з яких є вкороченою копією іншого (трансляція без зрушення рамки);

2)зрушення рамки трансляції на 1 – 2 нуклеотиди, внаслідок чо- го утворюються нові триплети, з’являється новий генетичний код і синтезуються унікальні білки, в яких немає ідентичних амінокисло- тних послідовностей;

3)сплайсинг із зрушенням рамки трансляції;

4)нарізання поліпептиду-попередника на ділянки неоднакової довжини, внаслідок чого утворюються різні білки з амінокислотни- ми послідовностями, що перекриваються.

Отже, кількість реальних генів у вірусів перевищує молекулярну масу геному. Внаслідок перекривання генів і зрушення рамки трансляції розмиваються межі генів. Тому поняття «ген» у класич- ному розумінні як дискретний фрагмент геному, що кодує один бі- лок, втрачає суть і набуває скоріше функціонального значення.

Угенах закодована інформація про всі властивості вірусів, які на- зиваються генетичними ознаками. Вони поділяються на групові, видові, внутрішньовидові та внутрішньоштамові. Основними є групові

йвидові ознаки, до яких належать: тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК); розміри і морфологія віріона; тип симетрії капсиду, кількість капсомерів; антигенна специфічність; стійкість до органічних розчин- ників і детергентів; наявність нейрамінідази й антигенів хазяїна; ге- маглютинувальні властивості; патогенність для тварин певного виду, курячих ембріонів, цитопатичний ефект у відповідній культурі клітин.

Сукупність генетичних ознак (або генетичної інформації) вірусу на- зивається генотипом. Він визначається структурою спадкового мате- ріалу — ДНК або РНК, тобто послідовністю нуклеотидів у молекулі нуклеїнової кислоти. Генотип є постійною властивістю вірусу, проте він може змінюватися внаслідок мутацій, що відбуваються в геномі.

Сукупність генетичних ознак вірусу, які виявляються в певних умовах навколишнього середовища, називається фенотипом. У ньому ніколи не реалізуються всі генетичні можливості розвитку вірусу. Фенотип вірусу — це окремий випадок прояву функції вірус- ного геному в певних умовах довкілля. Фенотип не є постійною вла- стивістю вірусу, він може змінюватися в процесі репродукції вірусу,

атакож унаслідок мутацій. Наприклад, патогенність — це генетич- на ознака вірусу. Фенотиповим проявом патогенності є вірулент- ність — ступінь патогенності. Ця ознака значно варіює в різних си-

111

Розділ 5

стемах, що залежить від особливостей штаму і методу його підтри- мання. Так, вірус жовтої пропасниці пантропний і високовірулент- ний для людини і мавп, проте при серійних пасажах у ЦНС білих мишей стає нейротропним і непатогенним для природних хазяїв.

ПОПУЛЯЦІЙНА СТРУКТУРА ВІРУСІВ

Центральним об’єктом генетичного дослідження вірусів є вірус- на популяція. Це вірус певного виду, що розмножується в природ- ній або експериментальній чутливій системі та проходить у ній знач- ну кількість генерацій, упродовж яких між окремими віріонами від- буваються генетичні й негенетичні взаємодії.

Вірусні популяції є важливою ланкою в структурі виду і викону- ють роль основних одиниць еволюції. У природних умовах вони утворюються в організмі заражених хазяїв. Властивостями популя- ції, хоч і меншою мірою, характеризується вірус, який розмножуєть- ся в культурі клітин. Це створює можливість експериментального дослідження внутрішньопопуляційних явищ.

Популяційна структура вірусів і специфіка генетичних процесів, що відбуваються у вірусних популяціях, визначаються рядом фак- торів. Найважливішими з них є такі:

1)висока чисельність вірусних популяцій. В організмі хазяїна накопичуються колосальні за чисельністю вірусні популяції. Потомст- во одного віріона за індивідуальний цикл розвитку налічує в серед- ньому 102, а через три генерації — 106 вірусних частинок. Уже суто кі- лькісний бік явища підвищує ймовірність появи в популяції рідкісної мутації, яка може бути підхоплена відбором при зміні умов існування;

2)швидка зміна поколінь. Величезна різниця в тривалості життєвого циклу вірусів та їхніх хребетних хазяїв дає змогу вивчати мінливість вірусів у лабораторії та спостерігати еволюцію в природі. Можливі наслідки мінливості вірусів у природних умовах — поява нових штамів збудника і виникнення епідемій та епізоотій, а в екс- перименті — селекція варіантів із заданими властивостями;

3)гаплоїдність і нестатевий спосіб розмноження:

а) визначають генетичну структуру вірусних популяцій; б) виключають можливість збереження запасів мінливості за ра-

хунок диплоїдності; в) ставлять мутації, що виникають, під негайний контроль відбо-

ру, який визначає їхню наступну долю; г) знижують ефективність впливу відбору на нейтральні мутації;

д) визначають спосіб генетичної перебудови вірусної популяції, що полягає в заміні одних клонів іншими;

4) мала ємність геному і відсутність генів, які повторю-

ються. Для здійснення інфекційного циклу вірусів потрібна функ- ціональна цілісність усіх генів. Незначна зміна функції будь-якого

112

Генетика вірусів

унікального гена, що настає внаслідок мутації, може мати летальний або умовно-летальний ефект. Ця обставина, поряд із високою мутабе- льністю генетичного матеріалу, впливає на розмір генетичного ван- тажу, який міститься у вірусних популяціях. Під цим терміном ро- зуміють зниження середньої пристосованості вірусної популяції за рахунок варіантів, селективна цінність яких нижче оптимальної;

5) безперервність у часі епідемічного й епізоотичного процесів.

Обов’язковою умовою збереження вірусів як біологічних видів є передавання їх новим чутливим хазяям. Тому генетична історія ві- русної популяції, що утворилася і закінчила своє існування в орга- нізмі певного індивіда, продовжується при переході до нового хазяї- на і наступному передаванні збудника по ланках епідемічного або епізоотичного ланцюгів. Сама можливість передавання вірусу, а також її кількісна та якісна характеристики визначаються суто ви- падковими причинами. Випадковість слугує передумовою впливу на стадії передавання збудника могутнього еволюційного факто- ра — генетичного дрейфу. При передаванні вірусу посилюється та- кож діяльність відбору. Отже, еволюційні сили впливають на віруси не тільки під час їхньої репродукції в клітинах сприйнятливого ор- ганізму, але й при переході від одного хазяїна до іншого.

Вірусні популяції характеризуються високою генетичною неодно- рідністю. Треба розрізняти такі поняття, як штам, тип (серотип), варіант, мутант, клон. Усі ці терміни в загальному означають ві- рус, який генотипово відрізняється від батьківського дикого типу (природного ізоляту), що представляє природну вірусну популяцію.

Штам — це вірус, виділений із природної вірусної популяції від заражених хазяїв або об’єктів навколишнього середовища. Фактично штамами називають різні дикі типи одного виду вірусу, які адапто- вані до лабораторних умов. Наприклад, штами Flürі-Hep, ERA, CVS вірусу сказу, штами Oregon C24V, NADL, Singer вірусу діареї ВРХ.

Тип (серотип) — це вірус того самого виду, що відрізняється за нейтралізацією інфекційної активності. Наприклад, вірус інфек- ційної катаральної гарячки овець має 24 серотипи, а вірус африкан- ської чуми коней — 9 серотипів. Серотипи вірусів визначають у РН.

Варіант — це вірус, який відрізняється від дикого типу за фено- типовими ознаками, але разом з тим генотипова основа цієї відмінно- сті невідома, наприклад, варіанти з нейтралізації сироватками.

Мутант відрізняється від дикого типу за відомими генетични- ми ознаками.

Клон — це вірус, популяція якого походить від одного віріона і є сукупністю генетично однорідних вірусних частинок.

Природні вірусні популяції можуть добре адаптуватися до зовніш- ніх умов і за постійності середовища залишатися стабільними впро- довж тривалого часу. Проте у разі зміни факторів довкілля передумо- вою існування популяції є не збереження її в незмінному вигляді, а

113

Розділ 5

перебудова спадкової структури, що забезпечує пристосування до ново- го середовища. Ця перебудова може здійснюватися лише за наявності в популяції запасу генетичної мінливості генотипово різних варіантів.

Генетичний склад вірусної популяції називається генофондом. Іншими словами, генофонд вірусної популяції — це сукупність усіх генів, які є у віріонах, що складають цю популяцію. Генофонд, так само як і вірусний геном, пристосований для виконання певних життєвих функцій. Спадкова інформація, що міститься в геномі, забезпечує відтворення вірусу, а генотипова різноманітність, пред- ставлена в генофонді, дає змогу вірусам пристосовуватися і вижива- ти в мінливих умовах навколишнього середовища.

СПАДКОВА МІНЛИВІСТЬ ВІРУСІВ

Віруси змінюють свої властивості як у природних умовах, так і в експерименті, причому мінливість у них виражена значно більшою мірою, ніж в інших організмів. Це пов’язано з надзвичайно корот- ким життєвим циклом вірусів порівняно з їхніми хребетними хазя- ями і колосальною чисельністю вірусних популяцій.

В основі спадкової мінливості вірусів лежать такі процеси: 1) му- тації; 2) рекомбінації; 3) включення у вірусний геном генетичного матеріалу клітини-хазяїна; 4) потік генів. Саме з цих джерел ство- рюється і поповнюється генофонд вірусних популяцій.

Перед тим як розглядати процеси, що лежать в основі спадкової мінливості вірусів, треба зупинитися на модифікаціях. Це фено- типові зміни у вірусів, які зумовлені клітиною-хазяїном і не пере- даються за спадковістю. Модифікації не торкаються вірусного гено- му, а полягають у тому, що клітина впливає на характер вірусних компонентів, які синтезуються в ній. Наприклад, склад білків, за- кодованих у вірусному геномі, може модифікуватися клітиною- хазяїном за рахунок особливих мутагенних форм тРНК (sРНК), у яких порушена відповідність між антикодоном і здатністю захоплю- вати специфічну амінокислоту. Вміст вуглеводів у складі віріонів визначається клітинними ферментами, що здійснюють глікозилу- вання вірусних білків. Модифікації можуть бути зумовлені вклю- ченням до складу віріонів потомства компонентів клітини-хазяїна, наприклад, ліпідів на кінцевій стадії репродукції вірусу, коли фор- мується суперкапсидна оболонка. Зовнішня ліпопротеїнова оболон- ка вірусу може містити клітинні білки, що змінює антигенні влас- тивості збудника. При переміні клітини-хазяїна змінюється і вміст клітинних компонентів у складі віріонів потомства.

Модифікації лежать в основі адаптації вірусу до нового хазяїна і подолання залежного від нього обмеження. Модифіковані віруси набувають здатності ефективніше заражати клітини, аналогічні тим, в яких вони модифікувалися. Отже, клітина-хазяїн може істот- но впливати на фенотип вірусу.

114

Генетика вірусів

МУТАЦІЇ

Мутації — це спадкові зміни у вірусів, які полягають у пору- шенні генетичного коду. Молекулярні механізми мутацій різнома- нітні. Можливі заміни, випадіння (делеції), вставки і перестановки нуклеотидів або їхніх пар в одно- і дволанцюгових молекулах нук- леїнової кислоти. Ці порушення можуть обмежуватися окремими нуклеотидами або охоплювати значні ділянки вірусного геному.

Розрізняють спонтанні та індуковані мутації. Спонтанні мутації виникають у природі під впливом на генетичний матеріал вірусів різних природних мутагенних факторів, а індуковані — з’являються в експерименті. Конкретні причини спонтанних мутацій частіше всього залишаються нез’ясованими. Принципової різниці в суті пе- ребудови вірусного геному при спонтанних та індукованих мутаціях немає. Вважають, що мутагени, які використовуються в лабораторії, не індукують нових мутацій, а збільшують частоту тих чи інших спонтанних мутацій у десятки й сотні разів.

При класифікації мутацій використовують два різні підходи: 1) за зміною генотипу; 2) за зміною фенотипу.

За зміною генотипу мутації поділяються на генні, або крапко- ві, що локалізуються в індивідуальних генах, і делеційні, які за- ймають значні ділянки вірусного геному.

Якщо крапкові мутації локалізуються в одному гені, такі мутан- ти називаються одноударними. До них належать температуро-

чутливі мутанти (ts-мутанти, від англ. temperature sensitive),

які втратили здатність розмножуватися за підвищеної температури (+38 – 41 °С), але репродукуються за звичайних умов культивуван- ня (+36 … +37 °С). Крапкові мутації можуть локалізуватися у двох або кількох генах. У цьому разі кажуть про подвійні або множинні мутанти. У природних умовах крапковими мутаціями генів гема- глютиніну і нейрамінідази зумовлений антигенний дрейф вірусу грипу А, який полягає в поступовій зміні поверхневих антигенів, що призводить до появи епідемічних штамів збудника.

Делеції, що характеризуються пошкодженням значних ділянок вірусного геному, можуть бути одиничними і подвійними, розміще- ними на протилежних кінцях молекули нуклеїнової кислоти. Деле-

ційні мутанти представлені дефектними інтерферувальними час-

тинками (ДІ-частинками). Вони утворюються у вірусних популяці- ях спонтанно, причому різні штами одного і того самого вірусу мо- жуть істотно відрізнятися за продукцією ДІ-частинок. Цей спонтан- ний фон значно зростає в разі зміни умов культивування вірусу, ос- новними з яких є підвищення множинності інфекції та підбір опти- мальної чутливої системи. Втрата ДІ-частинками значних ділянок геному (іноді до 90 % і більше) призводить до летального ефекту, який виражається в нездатності їх до репродукції. Відтворення

115

Розділ 5

ДІ-частинок здійснюється за допомогою функцій, які кодуються ге- номом інфекційного вірусу. ДІ-частинки інтерферують з інфекційним вірусом і гальмують його розмноження, використовуючи продукти його генів, зокрема полімеразу. Залежно від виду вірусу і типу утво- рених ДІ-частинок конкуренція може відбуватися на рівні реплікації вірусного геному або на стадії використання вірусних білків у процесі формування віріонів потомства. Вірусологи повинні завжди пам’ята- ти, що ДІ-частинки можуть контамінувати вірусні препарати і здійс- нювати негативний вплив на біологічну активність вірусу.

При класифікації мутацій за зміною фенотипу вказують на ге- нетичну ознаку, фенотиповий прояв якої змінюється внаслідок му- тації, або на порушену функцію вірусу. Нагадаємо, що фенотип ві- русу складається з певної суми генетичних ознак, які виявляються в певних умовах. Ці ознаки змінюються внаслідок мутацій. Кожна ознака може мати протилежний фенотиповий прояв, властивий ві- русу дикого типу і мутанту. Наприклад, вірус дикого типу розмно- жується за підвищеної температури, а ts-мутанти практично не ре- продукуються в цих умовах. Або холодові мутанти вірусу грипу не розмножуються при +37 °С, а лише при +32 … +34 °С, що робить перспективним використання їх у ролі живих вакцин. Існують тер- мостабільні мутанти, які здатні репродукуватися при +41 °С і харак- теризуються високою вірулентністю.

За зміною фенотипу найзагальнішими є мутації за такими озна-

ками:

1)морфологія бляшок у культурі клітин;

2)термочутливість циклу репродукції;

3)стійкість до прогрівання;

4)стійкість до інгібіторів вірусної репродукції;

5)спектр патогенності.

Мутації можуть призвести практично до зміни фенотипу за будь- якою ознакою, що властива цьому вірусу, і порушувати будь-яку йо- го функцію. Так, виділено мутанти аденовірусу людини типу 5 із порушеною здатністю до трансформації клітин. Діапазон мутацій- них змін збільшується завдяки тому, що фенотипові прояви бага- тьох ознак, які підлягають мутації, мають кількісне вираження. Наприклад, розмір негативних колоній у бляшкотвірних мутантів одного й того самого вірусу може коливатися від десятих частин мі- ліметра до кількох сантиметрів.

Співвідношення між геном і ознакою у вірусів хребетних досить складні. З одного боку, однакові зміни у фенотипі можуть бути спричинені мутаціями в різних генах (полігенність), а з іншого — одна мутація може призвести до виникнення цілого комплексу фе- нотипових ефектів (плейотропія). Полігенною є, зокрема, ts-ознака. Прикладом сильно вираженої плейотропії є ts-мутант аденовірусу людини типу 2, в якого мутація локалізується в ділянці геному, що

116

Генетика вірусів

контролює синтез різних білків. Плейотропний ефект цієї одиничної мутації виражається в зниженні синтезу чотирьох поліпептидів, по- рушенні протеолітичного нарізання вірусних білків, утраті здатнос- ті капсомерного білка до полімеризації, зміні його антигенних влас- тивостей і, нарешті, в порушенні складання віріонів потомства і пригніченні їхнього виходу з клітини.

Мутаційний процес характеризується певною частотою виник- нення мутацій, що в багатьох організмів (у тому числі бактерій і фа- гів) знаходиться під генетичним контролем спеціальних генів- мутаторів. У вірусів хребетних, геном яких складається з унікаль- них генів, контроль частоти мутагенезу не встановлено. Проте, ймо- вірно, мутаційні пошкодження генів, що кодують ферменти, які бе- руть участь у реплікації ДНК і РНК, можуть призвести до порушен- ня їхньої функції й тим самим змінити частоту мутацій. Ступінь реалізації мутаційного потенціалу вірусного геному залежить також від властивостей клітини-хазяїна, а саме: наскільки ефективно від- новлюються передмутаційні пошкодження вірусного генетичного апарату репараційними ферментами клітини, до яких належать ендонуклеаза, екзонуклеаза, метилаза і ДНК-лігаза.

Спонтанні мутації. Деякі віруси дають значну частину мутан- тів при пасажуванні на біологічних об’єктах за відсутності будь- яких відомих мутагенів. Ці спонтанні мутації нагромаджуються в геномах вірусів і призводять до фенотипової мінливості, яка є об’єктом селективного тиску в ході еволюції вірусу. Частота спон- танного мутагенезу особливо висока у РНК-геномах і становить 10–3 – 10–4 на кожний включений нуклеотид, тоді як у ДНК-вмісних вірусів цей показник низький — 10–8 – 10–11. Наприклад, популяція РНК-вмісного вірусу везикулярного стоматиту містить 1 – 5 % ts-му- тантів, а ДНК-вмісного вірусу віспи кролів — менше 0,1 %. Вважа- ють, що вища частота нагромадження мутацій у РНК-геномах зумов- лена відносно низькою точністю реплікації РНК. Це пов’язано, оче- видно, з відсутністю в репліказ коригувальної активності, яка влас- тива ДНК-полімеразам. Отже, якщо геноми ДНК-вмісних вірусів відносно стабільні, то цього не можна сказати про РНК-вмісні віру- си, що робить концепцію дикого типу стосовно них досить хиткою.

Спонтанні мутації виникають унаслідок таутомерного перетво- рення (зміни конфігурації) азотистих основ, які входять до складу нуклеїнової кислоти. Так, таутомерне зрушення в положенні атома водню в аденіні призводить до того, що аденін при реплікації спа- ровується не з тиміном, а з гуаніном. Така помилка спричинює при наступних реплікаціях заміну пари азотистих основ А – Т на Г – Ц.

Індуковані мутації. Більшу частину мутантів, які виділені в процесі дослідження вірусів тварин, отримано з популяції дикого типу внаслідок обробки мутагенами. Останні зазвичай застосовують для того, щоб збільшити частоту мутацій у популяції, після чого мутанти

117

Розділ 5

підлягають скринінгу за допомогою відповідного селективного тиску. Основною проблемою, пов’язаною з використанням мутагенів, є підбір оптимальної дози, так щоб частота мутацій із потрібним фенотипом збільшувалася, але ймовірність множинних мутацій у геномі була мі- німальною. Для генетичного дослідження вірусів бажано отримати мутанти, які відрізняються від дикого типу тільки однією мутацією.

В експериментах з вірусами тварин було використано багато різних мутагенів. За механізмом дії вони поділяються на дві основні групи:

1)мутагени, які впливають на нуклеїнову кислоту, що знахо- диться в складі віріона: азотиста кислота, гідроксиламін, алкілува- льні сполуки (іприт, етиленімін, формальдегід, нітросполуки);

2)мутагени, які взаємодіють із нуклеїновою кислотою в процесі її реплікації — аналоги основ (5-бромдезоксиуридин, 5-азацитидин,

2-амінопурин, 5-бромурацил, 5-фторурацил, 5-йодурацил, 2,6-ди- амінопурин), інтеркалувальні речовини (актиноміцин, профлавін та інші акридинові барвники), УФ-промені.

В основі молекулярних змін вірусної нуклеїнової кислоти під дією мутагену лежать два основні процеси: 1) заміна азотистих основ; 2) їхнє випадіння (делеція) або вставка. Розрізняють два типи замі- ни азотистих основ у складі нуклеїнової кислоти: транзиція й трансверсія. При транзиції одна пуринова чи піримідинова основа замінюється іншою аналогічною, наприклад, замість аденіну — гу- анін, замість цитозину — урацил. Трансверсія супроводжується за- міною пуринової основи на піримідинову або навпаки. Делеція або вставка азотистих основ призводить до більш глибоких змін генетич- ного коду, ніж їхня заміна.

Не всі мутації, що виникли під дією мутагену, однаково стабільні. Більшості індукованих мутацій властива здатність повернення до дикого типу — реверсії. Можливі справжні реверсії, коли зворотна мутація відбувається в місці первинного пошкодження, і псевдоревер- сії, коли зворотна мутація відбувається в іншій ділянці дефектного гена (інтрагенна супресія) або в іншому гені (екстрагенна супресія).

Кожна мутація має характерну частоту реверсій. Наприклад, мута- нти, отримані під впливом УФ-променів, дають близько 20 % реверсій, а при дії профлавіну всі мутанти генетично стабільні, що залежить від ступеня пошкодження генетичного апарату вірусу. УФ-промені зумов- люють переважно заміну азотистих основ у молекулі вірусної нуклеї- нової кислоти, а профлавін — їхні делеції або вставки.

Реверсія є досить частою подією, оскільки ревертанти зазвичай більш пристосовані до конкретної клітинної системи. Тому при отриманні мутантів із заданими властивостями, наприклад, вак- цинних штамів, треба рахуватися з можливою їхньою реверсією до дикого типу. При отриманні вакцинних вірусних штамів доцільно використовувати такі мутагени, які зумовлюють глибокі зміни гене- тичного коду (делеції або вставки азотистих основ), оскільки такі мутанти мають стабільні спадкові властивості.

118

Генетика вірусів

Мутації мають випадковий характер і пояснюються статистични- ми законами. Мутації можуть мати різні наслідки. В одних випадках вони призводять до зміни фенотипу в нормальних умовах. Напри- клад, змінюється розмір бляшок у культурі клітин, нейровірулент- ність для певного виду тварин, чутливість до хіміотерапевтичних препаратів тощо. Мутації є летальними, якщо внаслідок них пору- шується синтез або функція життєво важливого вірусоспецифічного білка, наприклад, вірусної полімерази. Іноді мутації є умовно лета- льними, оскільки вірусний білок зберігає свої функції в оптимальних для нього (пермісивних) умовах і втрачає цю здатність у нерозв’язних (непермісивних) умовах. Типовим прикладом є ts-мутації.

Мутовані гени постійно включаються в генофонд вірусної популя- ції та збільшують її генетичну неоднорідність. Отже, внаслідок мута- цій окремі віріони набувають нових властивостей. Подальша доля таких вірусів-мутантів залежить від природного добору, який зберігає популяцію, найбільш пристосовану до конкретних умов існування.

РЕКОМБІНАЦІЇ

Рекомбінації — це обмін генетичним матеріалом, що відбува- ється між батьківськими вірусами в процесі змішаної інфекції. Мож- ливий обмін як повними генами (міжгенна рекомбінація), так і ді- лянками одного і того самого гена (внутрішньогенна рекомбінація). У результаті виникають дочірні геноми з генетичною інформацією в такому поєднанні, яка відсутня в батьків. Утворений вірус-реком- бінант має властивості, успадковані від різних батьків.

Рекомбінації описані в багатьох родин ДНК-вмісних вірусів (зок- рема покс-, герпес-, адено- і поліомавіруси), а також у РНК-вмісних вірусів із фрагментованим геномом і деяких із лінійною РНК (піко- рна- і ретровіруси). Тест рекомбінації застосовують для генетичного дослідження вірусів. З його допомогою можна побудувати генетичні карти вірусів, де визначається, в яких ділянках геному відбулися мутації. Рекомбінанти вдається отримати тільки при схрещуванні близьких за властивостями вірусів, що належать до одного роду.

Частота виникнення рекомбінацій коливається в широких межах та істотно залежить від використовуваної біологічної системи (клі- тина – вірус), а також від того, яку спадкову властивість потрібно рекомбінувати. Характерні ознаки штамів, що рекомбінуються, по- значаються як маркери. Для отримання рекомбінантів використо- вують штами, які містять два або більше маркерів.

В основі рекомбінацій лежать два основні механізми, що зале- жать від фізичної організації вірусного геному.

У ДНК-вмісних вірусів рекомбінація включає розрив та возз’єд- нання ковалентного зв’язку в нуклеїновій кислоті з утворенням до- чірніх віріонів небатьківського типу (внутрішньомолекулярна ре-

119

Розділ 5

комбінація). У цьому процесі, очевидно, беруть участь ферменти клітини-хазяїна, хоч і не виключається роль вірусоспецифічних фе- рментів, закодованих у вірусному геномі. Для ДНК-вмісних вірусів, за винятком поліомавірусів, характерна висока частота рекомбіна- цій — від 14 до 38 %. Низька частота рекомбінацій у поліомавірусів (до 0,2 %) зумовлена кільцевою структурою молекули ДНК. Пору- шення її цілісності в результаті опромінення УФ-променями при- зводить до істотного підвищення частоти рекомбінацій.

Унікальний механізм рекомбінації властивий РНК-вмісним ві- русам із фрагментованим геномом (ортоміксо-, арена-, бунья- і рео- віруси). Він полягає в обміні фрагментами геному між партнерами на стадії морфогенезу, при цьому ковалентні зв’язки в нуклеїновій кислоті не розриваються. Такий механізм рекомбінації називається

пересортуванням генів, або реасортацією. Наслідком цього є обмін великими блоками спадкового матеріалу, що спричинює значну зміну властивостей вірусу. Наприклад, вірус грипу А може отрима- ти в результаті рекомбінації нові селективно цінні типи поверхне- вих антигенів гемаглютиніну і нейрамінідази, що зумовлює анти- генний шифт і призводить до виникнення пандемічних штамів. Ча- стота рекомбінацій для РНК-вмісних вірусів із фрагментованим ге- номом становить від 18 до 50 %.

Механізм рекомбінації у РНК-вмісних плюс-нитчастих пікорна- вірусів (віруси поліомієліту та ящуру) полягає в обміні не генетич- ним матеріалом, а спадковою інформацією. За умов змішаної інфек- ції частина генетичної інформації при синтезі геномної РНК реком- бінантів постачається одним із батьків, а друга частина — іншим

(механізм вибіркового копіювання зі зміною матриці). Частота ре-

комбінацій у пікорнавірусів невисока — 0,05 – 0,6 % (іноді до 1 %), що зумовлено невеликими розмірами їхніх геномів.

Аналогічний механізм рекомбінації властивий ретровірусам. Як відомо, геном ретровірусів диплоїдний, утворений двома ідентич- ними плюс-нитками РНК і підлягає зворотній транскрипції. У ході цього процесу ревертаза може «перескакувати» з однієї нитки РНК на іншу, утворюючи гібридну матрицю ДНК. Якщо обидві молекули РНК ідентичні, це не призводить до наслідків. Однак за наявності вірусів-мутантів, які несуть різні молекули РНК, можлива поява рекомбінантів з іншими геномами. Подібний механізм опосередко- вує генетичну нестабільність у вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ). З усіх зворотних транскриптаз ретровірусів ревертаза ВІЛ найактив- ніша щодо збою генетичного коду. За нуклеотидними послідовнос- тями РНК ізоляти ВІЛ із різних пасажів одного вірусу можуть відрі- знятися більше ніж на 20 %. Для ретровірусів характерна висока частота рекомбінацій — 10 – 50 %.

Здійснення рекомбінацій призводить до утворення у вірусній по- пуляції нових інтегрованих генотипів. Виникнення їх відбувається

120

Генетика вірусів

за рахунок не збагачення популяції генами з новими функціями, а перерозподілу вже існуючих генів. У цьому полягає кардинальна відмінність двох внутрішніх джерел спадкової мінливості вірусів: унаслідок мутацій генофонд вірусної популяції поповнюється змі- неними генами, а рекомбінації перерозподіляють уже існуючий спадковий матеріал. Рекомбінації можуть слугувати для вірусної популяції не тільки джерелом спадкової мінливості та створювати генотипову різноманітність, а й виконувати протилежну роль — згладжувати існуючі відмінності. Співвідношення і вираження цих суперечливих процесів залежать від величини і генотипової різно- манітності популяції, від надходження в неї нових генів та від час- тоти і молекулярних механізмів рекомбінацій, властивих вірусам різних таксономічних груп.

ВКЛЮЧЕННЯ У ВІРУСНИЙ ГЕНОМ ГЕНЕТИЧНОГО МАТЕРІАЛУ КЛІТИНИ-ХАЗЯЇНА

Це слугує джерелом спадкової мінливості в онкогенних РНК- вмісних ретровірусів, які на певній стадії репродукції вбудовують ДНК-копію геному в генетичний апарат клітини. При цьому клітинні гени в провірусну ДНК можуть включитися шляхом рекомбінації. Подальша транскрипція інтегрованого ДНК-провірусу призводить до появи у вірусному геномі клітинних генів, які підпадають під конт- роль вірусних регуляторних механізмів. Ці гени не потрібні для роз- множення ретровірусів, але продукти їхньої експресії спричинюють трансформацію клітин, зумовлюючи таким чином онкогенні власти- вості збудників. Тому ці гени називаються трансформувальними генами, або онкогенами, а їхні клітинні аналоги — протоонкогена-

ми, які присутні в геномі кожної нормальної клітини і можливо, бе- руть участь у регуляції клітинного поділу і диференціації. У складі ретровірусів виявлено до 35 онкогенів клітинного походження.

В онкогенних ДНК-вмісних вірусів теж є трансформувальні гени, але їхнє походження невідоме. Вони не мають гомології з клітинни- ми протоонкогенами. Навіть якщо вони еволюціонували від клітин- них генів, то відбулася їхня значна дивергенція, оскільки не спосте- рігається рекомбінація трансформувальних генів онкогенних ДНК- вмісних вірусів із клітинною ДНК.

ПОТІК ГЕНІВ

Під цим терміном розуміють природні процеси зміщення вірус- них популяцій, які призводять до порушення ізоляції та спричиню- ють одно- або двосторонній обмін генами. Внаслідок цього відбува- ється збільшення запасів спадкової мінливості певної вірусної по- пуляції за рахунок надходження генів з іншого генофонду.

121

Розділ 5

Стан ізоляції вірусної популяції, що створюється в організмі ха- зяїна і може тривати при наступному передаванні збудника, пору- шується за двох обставин: 1) при повторному зараженні; 2) при змішуванні вірусу, який виділяється від різних хазяїв, у навколиш- ньому середовищі та зараженні цим неоднорідним матеріалом но- вих індивідів. Утворені в даному випадку вірусні популяції генеа- логічно зв’язані з двома або кількома батьківськими популяціями й отримують ту чи іншу частину їхнього генофонду. Ці явища постій- но відбуваються при циркуляції вірусів у інфекційних осередках і відіграють істотну роль у мінливості збудників.

ГЕНЕТИЧНІ ТА НЕГЕНЕТИЧНІ ВЗАЄМОДІЇ ВІРУСІВ

У природних та експериментальних умовах клітина може бути за- ражена не одним, а багатьма віріонами одного штаму вірусу, генети- чно різними штамами, або навіть неспорідненими вірусами. У проце- сі такої змішаної інфекції виникають різні форми взаємодій між віру- сними геномами або продуктами генів. Між вірусними геномами мо- жуть бути такі форми генетичних взаємодій, як рекомбінація, гене- тична реактивація, гетерозиготність. На рівні генних продуктів ви- никають негенетичні взаємодії: комплементація, фенотипове змішу- вання, інтерференція. Негенетичні взаємодії часто призводять до фенотипового маскування істинного вірусного генотипу.

Рекомбінація детально висвітлена в розділі «Спадкова мінли- вість вірусів». Нагадаємо, що рекомбінацією називають обмін генети- чним матеріалом між батьківськими вірусами, внаслідок чого утво- рюється потомство з властивостями, успадкованими від обох батьків.

Генетична реактивація є окремим випадком рекомбінації, ко- ли один або обидва партнери неінфекційні внаслідок пошкодження геному, але при змішаній інфекції дають повноцінне потомство, що має ознаки обох батьків. Це потомство є рекомбінантами, в яких інак- тивувальні пошкодження геному неінфекційного батьківського віру- су еліміновані. Розрізняють множинну і перехресну реактивації.

Множинна реактивація виникає між неінфекційними партне- рами, коли клітина заражається кількома віріонами з пошкодже- ними геномами. Якщо інактивувальні пошкодження локалізовані в різних ділянках вірусного геному, відбувається рекомбінація, вна- слідок чого відновлюється повний генетичний набір, потрібний для утворення повноцінного потомства. Зазвичай множинна реактива- ція відбувається між вірусами, інактивованими УФ-променями. Її спостерігають як між різними штамами або серотипами одного і то- го самого вірусу, так і між неспорідненими вірусами (наприклад, аденовірусом людини типу 12 і SV40). Ефективність множинної ре- активації залежить від багатьох факторів: ступеня пошкодження вірусного геному, множинності зараження, аутоінтерференції.

122

Генетика вірусів

Перехресна реактивація, або крос-реактивація, виникає між інфекційним та інактивованим вірусами. У разі змішаної інфекції виникає рекомбінація непошкоджених ділянок геному інактивова- ного вірусу з геномом повноцінного вірусу, внаслідок чого з’явля- ються штами з властивостями обох батьків. Цей феномен називають також урятуванням маркера, оскільки реактивується лише части- на геному інактивованого вірусу, яка несе певну генетичну ознаку (маркер). За крос-реактивації рекомбінантні форми отримати значно легше, ніж у разі схрещування двох нативних вірусів.

Гетерозиготність полягає в тому, що в разі змішаної інфекції різними штамами вірусу утворюються віріони потомства, які містять у своєму складі два батьківські геноми (повні гетерозиготи) або принай- мні один повний геном і частину іншого (неповні гетерозиготи). Це явище зумовлене неправильним упакуванням геномів при формуван- ні віріонів складно організованих вірусів. Наприклад, потомство вірусу ньюкаслської хвороби може містити понад 10 % повних гетерозигот. Вони нестабільні та при наступній реплікації розділяються на батьків- ські форми, на одну з батьківських форм і певний рекомбінант або на два рекомбінанти. Феномен гетерозиготності не властивий просто ор- ганізованим вірусам, у яких структурні обмеження при упакуванні роблять малоймовірним потрапляння двох геномів у один капсид.

Комплементацією, або негенетичною реактивацією, на-

зивають взаємодію генних продуктів двох вірусів, що стимулює їхнє розмноження, але не змінює генотипи. При цьому один вірус поста- чає іншому компоненти, яких бракує для здійснення повного циклу репродукції, зазвичай структурні або неструктурні білки.

Комплементація може бути дво- та односторонньою. Двосторон- ня комплементація виникає між дефектними вірусами, кожен з яких не здатний до самостійної репродукції. Обидва партнери за- безпечують один одного потрібними генними продуктами. За одно- сторонньої комплементації повноцінний вірус-помічник стимулює репродукцію залежного від нього дефектного вірусу-сателіта, нада- ючи йому потрібні білки.

Комплементація досить поширена серед вірусів як споріднених, так і неспоріднених. Цей феномен тісно пов’язаний із дефектністю вірусів. У вірусній популяції зазвичай присутні, крім стандартних, дефектні віріони, зокрема ДІ-частинки, які втратили частину гене- тичного матеріалу. Тому комплементація має місце в інфекційному циклі багатьох вірусів і полягає в тому, що члени популяції поста- чають один одному продукти генів, які дефектні в партнерів.

Комплементація трапляється і серед вірусів, що належать до різ- них таксономічних груп. У цьому процесі часто беруть участь пред- ставники родини Adenoviridae. В одних системах аденовіруси є де- фектними, а в інших — діють як помічники. Наприклад, у культурі клітин нирки африканської зеленої мавпи аденовіруси людини

123

Розділ 5

спричинюють абортивну інфекцію: цикл репродукції переривається на пізніх стадіях через блокаду синтезу капсидних білків. У присут- ності вірусу SV40 з родини Polyomaviridae ця блокада знімається під дією Т-антигену SV40 й інфекція завершується формуванням віріонів потомства. В інших системах аденовіруси виступають як помічники, а сателітом є аденоасоційовані віруси з родини Parvoviridae. Синтез структурних компонентів аденоасоційованих вірусів забезпечують продукти ранньої транскрипції аденовірусів.

Вірус гепатиту В є помічником для дефектного РНК-вмісного ві- русу гепатиту D, надаючи йому свій поверхневий НВs-антиген для формування зовнішньої оболонки. Поєднання двох вірусів виявля- ють при хронічному активному гепатиті, що в 41 % випадків закін- чується цирозом печінки.

Фенотипове змішування — це явище, за якого геном одного вірусу упаковується в капсид або суперкапсид, що складається пов- ністю чи частково зі структурних білків іншого вірусу. В разі фено- типового змішування об’єднуються тільки вірусні білки, генетичної взаємодії між нуклеїновими кислотами не відбувається. Якщо обо- лонка віріона (капсидна чи суперкапсидна) містить структурні біл- ки обох батьків, такі варіанти вірусу нейтралізуються сироватками проти вихідних штамів.

Фенотипове змішування досить поширене серед просто організо- ваних вірусів, як близькоспоріднених (наприклад, віруси поліоміє- літу типів 1 і 2), так і віддаленіших (віруси ЕСНО типу 7 і Коксакі типу А9). Коли дочірній геном вбудовується в капсид, що складаєть- ся повністю з білків іншого вірусу, це явище називають транскап- сидацією. Іноді більша частина потомства має гетерологічний кап- сид. Транскапсидація виявлена, наприклад, у вірусу ящуру та ен- теровірусу ВРХ або у вірусів поліомієліту і Коксакі.

У деяких складно організованих вірусів фенотипове змішування часто відбувається так, що нуклеокапсид одного вірусу виявляється оточеним суперкапсидною оболонкою іншого, тобто формується псев- дотип. Наприклад, вірус везикулярного стоматиту утворює псевдо- типи з вірусами грипу птахів, простого герпесу, онкогенними ретро- вірусами птахів і мишей.

Фенотипове змішування є тимчасовим феноменом: у наступному поколінні віріони відтворюють ознаки того вірусу, чию нуклеїнову кислоту вони містять.

Інтерференція полягає в здатності одного вірусу пригнічувати розмноження іншого. Залежно від спорідненості між вірусами- партнерами розрізняють гомологічну інтерференцію, яка виявляєть- ся тільки стосовно гомологічного або близькоспорідненого вірусу, і гетерологічну інтерференцію, що виникає між вірусами різних так- сономічних груп. Інтерференція між вірусами може виявлятися на різних стадіях репродукції внаслідок конкуренції за синтезовані ві-

124

Генетика вірусів

русоспецифічні макромолекули, а також за рахунок утворення особ- ливого білка — інтерферону, який виробляється клітинами у відпо- відь на вірусну інфекцію та має виражену противірусну активність.

Найцікавішою для генетики є гомологічна інтерференція. Однією з її форм є аутоінтерференція, що спостерігається в процесі серій- ного пасажування за високої множинності зараження. У цих умовах сумарний урожай віріонів залишається відносно постійним, проте вміст інфекційного вірусу знижується в міру пасажування. Отже, спостерігається інтерференція щодо зростання інфекційної частини вірусної популяції. Вивчення таких інтерферувальних вірусних по- пуляцій показало, що вони містять значну частину ДІ-частинок. Ці делеційні мутанти інтерферують із розмноженням інфекційного вірусу, ефективно конкуруючи за компоненти реплікативного ком- плексу, наприклад, за полімеразу, що призводить до утворення все- зростаючої частини ДІ-частинок.

Гомологічна інтерференція спостерігається і з ts-мутантами, які інтерферують із репродукцією вірусу дикого типу як за пермісивної, так і непермісивної температури.

ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

До цього часу йшлося про генетичні процеси, які відбуваються при взаємодії біологічно та еволюційно близьких вірусів. Проте мож- ливі генетичні взаємодії й неспоріднених вірусів, що є предметом дослідження генної інженерії. Цей новий напрям у генетиці та біотехнології виник завдяки успішному розвитку молекулярної біо- логії. 31 липня 1972 р. у Національній академії наук США було представлено першугенно-інженерну роботу П.Берга про створення in vitro химерної ДНК, яка не мала аналогів у природі: гібриду мав- пячого вірусу 40 (SV40) і бактеріофага λ. Цей химерний геном був уведений у формі плазміди в бактеріальну клітину (Esсherichia coli) й експресований з утворенням вірусоспецифічних білків.

На відміну від класичної та молекулярної генетики, генна інже- нерія має своїм об’єктом дослідження не клітини, не віруси, а гени або їхні групи, оперуючи з ними не як із біологічними об’єктами, а як із молекулами або фракціями молекул. Генна інженерія вивчає за- кономірності конструювання in vitro нових генетичних структур — рекомбінантних (гібридних) ДНК і клонування їх у реципієнтній клі- тині. Мета генної інженерії — пересадження генів у гетерогенні сис- теми, їхня експресія для отримання біологічно активних білків (гор- монів, ферментів, антигенів тощо). Головним завданням генної інже- нерії є вибір таких клітинних систем, які б забезпечили економічно вигідну технологію виробництва біологічно активних речовин. Осно- вним об’єктом при виборі клітинних систем, де вводяться гени і здій- снюється їхня експресія, є прокаріоти (бактерії, насамперед E. coli) та

125

Розділ 5

найпростіші еукаріоти (дріжджі). У деяких випадках доцільно вико- ристовувати вищі еукаріотні системи (клітини птахів і ссавців).

Основним інструментом генно-інженерних робіт є певні ферменти і насамперед рестриктази, або рестрикційні ендонуклеази, які отримують із бактеріальних клітин. Рестриктази досить поширені се- ред прокаріотів і беруть участь у генетичних процесах. Вони захища- ють бактеріальну клітину від чужорідної ДНК, розщеплюючи ДНК бактеріофагів. Відомо понад 500 рестриктаз, які характеризуються ви- сокою специфічністю. Рестриктази розпізнають у молекулі дволанцю- гової ДНК строго визначені нуклеотидні послідовності (зазвичай 4 – 7 пар нуклеотидів) і розщеплюють обидві нитки ДНК на фрагменти розміром від кількох сотень до кількох тисяч пар нуклеотидів. При генно-інженерних маніпуляціях за допомогою різних рестриктаз вда- ється отримати потрібні фрагменти геномів або окремі гени. Здебіль- шого рестриктази утворюють у місцях розрізу молекул ДНК липкі кін- ці, комплементарні один одному, що дає змогу з’єднувати окремі гени або генетичні елементи (екзони, інтрони тощо). Якщо липкі кінці не формуються, їх створюють штучно за допомогою ферменту кінцевої трансферази. Для ковалентних зшивань ниток ДНК застосовують фермент ДНК-лігазу, яку виділяють з E. coli.

Чужорідний генетичний матеріал можна ввести в клітину за до- помогою вектора. Це молекула ДНК, яка здатна до автономної ре- плікації в реципієнтній клітині та забезпечує експресію вбудованих у неї чужорідних генів. Векторами можуть слугувати плазміди, бак- теріофаги, штучні структури (наприклад, косміди — похідні фагів і плазмід). Зручними векторами для еукаріотних клітин є деякі віру- си тварин: із ДНК-вмісних — віруси вісповакцини, поліоми, папі- ломи, SV40, герпесу, аденовіруси; із РНК-вмісних — ретровіруси.

Крім векторів, іноді застосовують додаткові генетичні елемен- ти. Якщо при утворенні генетичної структури в потрібному гені відбулося зрушення рамки зчитування, тоді у відповідну ділянку потрібно вставити лінкер — синтетичний олігонуклеотид, який ви- править зрушену рамку. Іноді при вирізанні гена втрачається іні- ціювальний кодон АУГ, тоді його доводиться ковалентно з’єднувати з початком гена. У багатьох випадках до початку гена потрібно при- єднати сильно діючий промотор — специфічну ділянку ДНК, яка виконує регуляторну функцію за рахунок приєднання РНК-полі- мерази, що ініціює транскрипцію. Часом доводиться відділяти про- мотор, який надто близько розміщений до початку гена, невеликим олігонуклеотидом — спейсером. Іноді для успішного функціону- вання гена слід застосовувати тандемну ампліфікацію — по- вторити ген кілька разів, поставивши один за одним.

До цього часу йшлося про гени, які порівняно легко отримати. Що стосується генів вищих еукаріотів (наприклад, інсуліну або ін- терферону людини), то виділити їх серед десятків тисяч генів, які

126

Генетика вірусів

містяться в геномі еукаріотної клітини, — непосильне завдання. Крім того, гени еукаріотів не можуть бути безпосередньо використа- ні через їхню мозаїчну структуру, що полягає в чергуванні екзонів та інтронів. Тому для отримання таких генів спочатку індукують синтез відповідної іРНК, використовуючи спеціалізовані клітини. Так, іРНК інсуліну отримують in vitro з клітин інсуліноми (пухлини підшлункової залози), а іРНК інтерферону — з лейкоцитів донор- ської крові. При дозріванні іРНК за допомогою спеціальних ферме- нтів вирізають ділянки, які відповідають інтронам. Виділяють іРНК із полісом і піддають зворотній транскрипції за участю РНК-за- лежної ДНК-полімерази (син.: зворотна транскриптаза, ревертаза), яку отримують із віріонів вірусу мієлобластозу птахів. Цей фермент синтезує на матриці іРНК комплементарну нитку ДНК. Другу нит- ку ДНК отримують за допомогою ДНК-полімерази E. coli.

Отриманий ген (у цьому разі ген інсуліну або ген інтерферону) вводять у вектор — плазміду рВР322 за участю ферментів рестрик- тази, кінцевої трансферази і ДНК-лігази й отримують таким чином молекулу рекомбінантної ДНК. Вбудовування гена у векторну ДНК проводять у відповідних ділянках, наприклад, у гени плазміди, які визначають стійкість бактерії до того чи іншого антибіотика. Це призводить до пошкодження гена і супроводжується втратою анти- біотикостійкості тією бактеріальною клітиною, що стане носієм ре- комбінантної ДНК.

Наступним етапом генно-інженерних маніпуляцій є клонування рекомбінантної ДНК і введення її в реципієнтні клітини (зокрема Е. соlі) з подальшою селекцією та клонуванням цих клітин. Для вбудовування рекомбінантної ДНК у бактерію створюють відповідні умови. Наприклад, гіпотонічний розчин кальцію хлориду при 0 – 10 °С і тепловий шок роблять клітинні стінки бактерій проникними для рекомбінантної ДНК. Слід зазначити відносно невисоку ефек- тивність трансформації бактеріальних клітин. Так, із 106 рекомбі- нантних молекул із вбудованим геном ІФН-α тільки одна поглина- ється клітиною-хазяїном.

Наступним етапом є пошук бактеріальних клітин, що містять рекомбінантну ДНК. Для цього використовують селективні середо- вища і відбирають колонії, в яких виявив себе селективний маркер, наприклад, ген стійкості до ампіциліну, зруйнований під час гене- тичних маніпуляцій. Після відбору позитивних колоній перевіря- ють наявність вбудованого гена методом молекулярної гібридизації та рестрикційного аналізу.

Створенням і клонуванням рекомбінантної ДНК завершується ли- ше перший етап генно-інженерних робіт. Головна мета — досягти експресії потрібного гена в прокаріотних чи еукаріотних клітинах і на основі сучасних методів молекулярної біології розробити технологію отримання білкового продукту в умовах промислового виробництва.

127

Розділ 5

Генна інженерія відкриває широкі можливості й перспективи для створення вірусних вакцин. Препарати нового покоління міс- тять лише протективні вірусні антигени, що стимулюють утворення вірусонейтралізувальних антитіл. Такі субодиничні вакцини (проти гепатиту В, грипу А, сказу, ящуру та ін.) були отримані мікробіоло- гічним синтезом з використанням плазмідного або фагового векто- ра, в який вбудували гени протективних вірусних білків. Проте бі- льшість протективних антигенів вірусів є продуктами складних внутрішньоклітинних модифікацій, які не можуть здійснити фер- ментні системи бактерій і дріжджів. Здебільшого потрібно застосо- вувати клітини вищих еукаріотів (птахів і ссавців), що робить генно- інженерні вакцини нерентабельними. Проте для вірусів, які важко культивуються в лабораторних умовах, цей шлях є виправданим.

Перспективним напрямом у створенні генно-інженерних вакцин є використання в ролі вектора великих вірусів тварин, у геном яких вбудовують гени протективних вірусних білків. Найвдалішою мо- деллю для отримання таких рекомбінантних вакцин є вірус віспо- вакцини. Він має великий геном (187 тис. пар нуклеотидів), в який без шкоди для репродукції вірусу можна вбудувати до 25 тис. пар нуклеотидів чужорідного генетичного матеріалу, тобто кілька генів, що кодують протективні вірусні білки. Найзручнішим місцем для їхнього введення є ділянка ранніх генів вірусу вісповакцини, зок- рема ген тимідинкінази, який має сильний промотор. Така локалі- зація чужорідного гена забезпечує його ефективну транскрипцію, не блокує розмноження рекомбінантного вірусу вісповакцини і створює маркер щодо пошкодження гена тимідинкінази, який потрібний для відбору генетично змінених клонів.

На основі вірусу вісповакцини розроблено рекомбінантні вакцини проти гепатиту В, грипу А, сказу, хвороби Ауєскі, везикулярного сто- матиту, ньюкаслської хвороби та ін. Враховуючи безпечність і нала- годжене виробництво вісповакцини, на основі цього вірусу можна конструювати не тільки моновалентні, а й полівалентні препарати.

Крім вакцин, генно-інженерні методи використовують також під час розробки досконаліших діагностикумів. Так, для експрес- діагностики вірусних інфекцій застосовують метод молекулярної гібридизації нуклеїнових кислот. Він ґрунтується на взаємодії вірусного геному з комплементарною ДНК, міченою радіоактивним ізотопом або ферментом. Такий мічений комплекс ДНК називають ДНК-зондом. Для його отримання в плазмідний вектор вводять фрагмент вірусної ДНК (або ДНК-копію потрібного фрагмента віру- сної РНК) й отримують рекомбінантну ДНК. Метод молекулярної гібридизації показав високу чутливість і достовірність при виявлен- ні в патологічному матеріалі геномів вірусів хвороби Ауєскі, інфек- ційного ринотрахеїту ВРХ, аденовірусу ВРХ, інфекційного ларинго- трахеїту птиці та ін.

128

Генетика вірусів

Принципово новим діагностичним методом є рестрикційне картування (рестрикційний аналіз) вірусних геномів. Осно-

ва цього методу — складання фізичних карт вірусних геномів, які показують взаємне розміщення генів, їхні межі, локалізацію почат- ку реплікації, промоторів, лідерів, екзонів та інтронів, сигнальних послідовностей та інших генетичних елементів. Справжню револю- цію у фізичному картуванні геномів вірусів здійснило застосу-

вання рестриктаз і метод секвенування (встановлення послі-

довності нуклеотидів). Як вже зазначалося, рестриктази специфічно розпізнають нуклеотидні послідовності та розщеплюють молекулу ДНК у строго визначених місцях. Застосування широкого набору рестриктаз дає змогу отримати фрагменти вірусного геному різної величини, які потім розділяють та аналізують за допомогою елект- рофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі. Поєднання рес- трикційного аналізу з методом секвенування дало змогу скласти фізичні карти геномів вірусів із точністю до одного нуклеотиду. У разі РНК-вмісних вірусів обов’язковою умовою для їхнього рестрик- ційного аналізу є зворотна транскрипція, тобто отримання ДНК- копії РНК-геному з допомогою зворотної транскриптази (ревертази).

Рестрикційний аналіз гарантує точну типізацію близькоспорід- нених вірусів, що не завжди вдається зробити іншими молекулярно- біологічними та імунохімічними методами. Крім того, рестрикцій- ний аналіз має важливе значення при стандартизації та контролі біопрепаратів.

Незважаючи на великі успіхи, труднощі, які стоять перед генною інженерією, ще не подолані. Якщо прийняти за 100 % шлях від по- чатку досліджень до промислового, комерційно вигідного продук- ту — вакцини, інтерферону чи гормону, то оцінити кожен із трьох основних етапів цього завдання можна так: отримання рекомбінант- них молекул ДНК — 10 %, досягнення експресії потрібного гена в прокаріотних або еукаріотних клітинах — 30 %, вихід на економічно вигідну технологію — 60 %. Незважаючи на всі ці труднощі, генна інженерія стала ядром сучасної біотехнології, і внесок її у виробницт- во з кожним роком зростає.

? Контрольні запитання

1. Яка особливість генетичного дослідження вірусів? 2. Схарактеризуйте структурну організацію вірусного геному та регуляцію його активності. 3. Назвіть механізми збільшення генетичної інформації у вірусів. 4. Що таке генетичні ознаки, генотип і фенотип вірусів? 5. Схарактеризуйте ві- русну популяцію, її генофонд і генетичну неоднорідність. 6. Які процеси лежать в основі спадкової мінливості вірусів? 7. Що таке модифікації віру- сів? 8. Схарактеризуйте мутації у вірусів, їх механізм і наслідки. 9. Назвіть

129