Микробиология 2 коллоквиум

а1.Особенности генетического материала прокариот

Ядерные структуры:

 - нуклеоид.

Неядерные структуры (транспонируемые генетические элементы):

  - плазмиды,

  - инсерционные элементы;

  - транспозоны;

  - эписомы.

Транспонируемые элементы входят в состав бактериального генома, бактериальной хромосомы и плазмид.

Не являются жизненно необходимыми, так как не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в энергетическом метаболизме

Они осуществляют:

· координацию взаимодействий плазмид, умеренных фагов и нуклеоида для обеспечения репродукции;

· регулируют активность генов генома бактериальной клетки;

· могут инактивировать гены, в которые включились («выключение» гена);

· встраиваясь в хромосому, проявляют эффект промотора, включающего или выключающего транскрипцию соответствующих генов.

1. IS – инсерционные. Координируют взаимодействие плазмид, умеренных фагов, транспозонов и генома.

2. Tn – транспозоны. Содержат специф. гены (например, гены устойчивости к лекарствам) и два IS-элемента). Часто содержатся в составе R-плазмид.

3. Эписомы – содержат IS-элементы и транспозоны, способны реплицироваться в автономном или интегрированном в хромосому клетки хозяина состоянии. Собственно говоря, это вирусы (умеренные лизогенные фаги).

4. Плазмиды – двуцеп. ДНК размером от 103 до 106пн, кольцевые или линейные.

Свойства плазмид:

v  Реплицируются независимо от бакт. хромосомы,

v  Интегративные плазмиды могут обратимо встраиваться в хромосому и функционировать в виде единого репликона,

v  Трансмиссивные (коньюгативные) плазмиды способны передаваться из одной клетки в другую (крупные плазмиды, имеющие tra-оперон),

v  Мобилизуемые плазмиды (мелкие, не несущие tra-оперон) способны передаваться в присутствии трансмиссивных плазмид, используя их аппарат конъюгации.

Изменчивость у прокариот:

Фенотипическая

Генотипическая

                а) мутационная

                б) рекомбинативная

                               - трансформация

                               - трансдукция

                               - конъюгация

}  Изменение бактериального генома могут происходить в результате мутаций и рекомбинаций.

}  Мутации – это изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, проявляющиеся наследственно закрепленной утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков

Мутационная изменчивость:

}  По протяженности повреждений мутации бывают:

    ● точечными, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, (последствия: замена аминокислоты, сдвиг рамки считывания, возникновение бессмысленного кодона),

    ●протяженными (аберрации).

}  Мутации разделяют на:

    ● хромосомные –  изменение двух и более участков хромосомы,

    ●генные –  изменение гена или цистрона: модификации оснований, делеции (выпадение нескольких пар нуклеотидов), транспозиции (перемещение группы нуклеотидов в пределах хромосомы), инсерция (разрыв путем вставки посторонней ДНК), дупликация (добавление нуклеотидных пар) и деформации спирали ДНК.

Мутации:

Спонтанные мутации (1 на 106):

Мутагены:

Физические (высокая температура, УФ, ионизирующее излучение, УЗ колебания).

2. Химические (окислители, алкилирующие соединения, ингибиторы синтеза предшественников н/к и самих н/к).

3. Биологические (живые вакцины, вирусы, токсины бактерий и гельминтов)

Системы репарации у бактерий:

Совокупность ферментов, катализирующих реакции коррекции повреждений ДНК, составляют системы репарации (световые и темновые). Известны три основных механизмов коррекции дефектов ДНК:

   ● непосредственная реверсия от поврежденной ДНК к исходной структуре;

   ● эксцизия («выпадение») повреждений с последующим восстановлением исходной структуры;

   ● активация механизмов, обеспечивающих устойчивость к повреждениям.

Рекомбинативаня изменчивость у бактерий:

Генетическая рекомбинация – взаимодействие между двумя геномами, которое приводит к образованию рекомбинаций ДНК и формированию дочернего генома, сочетающего гены обоих родителей.

Особенности рекомбинаций у бактерий определяются отсутствием истинного полового процесса и мейоза у прокариот и гаплоидным набором генов.

В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые этот материал воспринимают. В клетку-реципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки-донора, т.е. один или несколько генов. Образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включением фрагментов хромосомы донора.

Бактериофаги

По специфичности взаимодействия различают

- поливалентные (инфицируют родственные виды бактерий),

- моновалентные (инфицируют определенный вид бактерий),

- типовые фаги (инфицируют отдельные варианты бактерий).

- Вирулентные фаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу.

- Умеренные фаги взаимодействуют с бактериями по продуктивному или по интегративному типу.

При интегративном типе взаимодействия ДНК фага (профаг) встраивается в хромосому бактерии и передается ее потомству, такая культура бактерий называется лизогенной, сосуществование фага и бактерии – лизогенией.

-Лизогенные бактерии приобретают иммунитет к последующему заражению гомологичными или близкородственными фагами.

-Геном профага может придавать бактерии новые свойства (фаговая конверсия): морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и др.

-Умеренные фаги могут быть дефектными

Применение фагов

-В лабораторной диагностике при видовой идентификации патогенных бактерий – определение фаговара (фаготипирование). Эту методику используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование) – выявление патогенов одного фаговара от разных больных указывает на общий источник заражения.

-Для лечения и профилактики инфекционных заболеваний (брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, стафилококковый, стрептококковый и др. фаги).

-В генной инженерии в качестве векторов-переносчиков трансгенов.

Влияние физических факторов. Стерилизация

Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) — мезофилами, при высокой — термофилами.

К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов.

Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10— 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.

Действие излучения. Неионизирующее излучение — ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение — гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени.

Действие химических веществ. Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.

Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли).

Стерилизация – предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергшихся обработке.

Дезинфекция — процедура, предусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтожения до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании данного предмета. Как правило, при дезинфекции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.

Асептика – комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.

 Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса.

Стерилизация предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергающихся обработке.

Существует три основных метода стерилизации: тепловой, лучевой, химической.

Стерилизацию сухим жаром, лучевая стерилизация…

Механизмы передачи генетического материала у бактерий: конъюгация, трансдукция, трансформация.

Рекомбинация между геномами бактерий осуществляется 3-мя механизмами: конъюгацией, трансдукцией и трансформацией

Трансформация – передача генетической информации через выделенную из клетки-донора ДНК.

Трансформирующей активностью обладает только двунитчатая высокоспирализованная ДНК.

В клетку-реципиент проникает только одна нить ДНК, другая – в клеточной мембране подвергается деградации с освобождением энергии, необходимой для проникновения в клетку второй нити ДНК.

Интеграция с хромосомой требует наличия гомологичных участков с трансформирующей ДНК.

Процесс трансформации зависит от компетентности клетки-реципиента и состояния трансформирующей донорской ДНК.

Компетентность клеток бактерий (способность воспринимать трансформирующую ДНК) зависит от присутствия в ЦПМ особых белков, обладающих специфическим аффинитетом к ДНК. Компетентность зависит от фазы роста бактериальной культуры, вида бактерий. Может увеличиваться при обработке культуры раствором хлорида кальция при пониженной температуре.

Трансдукция – передача бактериальной ДНК посредством бактериофага.

     ●    Общая (неспецифическая) трансдукция – перенос бактериофагом фрагмента любой части бактериальной хромосомы.

      ● Специфическая трансдукция –  фаговая ДНК интегрирует в бактерию с образованием профага.

      ● Абортивная трансдукция. При абортивной трансдукции внесенный фрагмент ДНК донора не встраивается в хромосому реципиента, а остается в цитоплазме и там самостоятельно функционирует.

Конъюгация

Обязательное условие – трансмиссивная плазмида (F, R), обладающая tra-опероном.

 Способы получения энергии бактериями (дыхание, брожение). Ферменты бактерий. Идентификация бактерий по ферментативной активности.

ДЫХАНИЕ БАКТЕРИЙ

Аэробное дыхание:  акцептором водорода или электронов служит молекулярный кислород.

Анаэробное: акцептором служат нитраты, сульфаты, фумарат.

Брожение: донорами и акцепторами водорода являются органические соединения. По конечному продукту расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду

·         Облигатные аэробы могут расти только при наличии кислорода.

·         Микроаэрофилы нуждаются в кислороде для получения энергии, но переносят от 0,01 до 0,03 бар парциального давления кислорода (в воздухе 0,20 бар).

·         Облигатные анаэробы (клостридии ботулизма, газовой гангрены, столбняка, бактероиды и др.) растут на среде без кислорода. При наличии кислорода, образуются перекисные радикалы кислорода, токсичные для анаэробных бактерий, поскольку они не образуют соответствующие инактивирующие ферменты (каталазу, пероксидазу и супероксиддисмутазу).

·         Факультативные анаэробы могут расти как при наличии, так и отсутствии кислорода, поскольку они способны переключаться с дыхания в присутствии молекулярного кислорода на брожение в отсутствие молекулярного кислорода (Enterobacteriaceae).

·         Аэротолерантные бактерии (молочнокислые бактерии) растут при наличии молекулярного кислорода, но не используют его – они получают энергию с помощью брожения.

Особенности физиологии бактерий.. Рост и размножение. Фазы размножения.

Физиология микроорганизмов – раздел микробиологии, изучающий жизнедеятельность микробов, процессы их питания, обмена, дыхания, роста, размножения, закономерности взаимодействия с окружающей средой.

РАЗМНОЖЕНИЕ И РОСТ

Большинство бактерий размножаются бинарным делением.

·         Грамотрицательные бактерии делятся путем перетяжки в результате образования гантелевидных фигур, из которых затем образуются две одинаковые клетки.

·         Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки. Клетки расходятся в результате действия аутолитических ферментов, разрушающих сердцевину перегородки

Существует два подхода к определению числа клеток в конкретный момент:

Прямые методы (непосредственный подсчет клеток под микроскопом в счетных камерах или на фиксированных мазках).

Косвенные методы (высевы на плотные питательные среды, осаждение на мембранных фильтрах, определение биомассы, мутности суспензии, общего белка, поглощения кислорода и выделения углекислоты).

При условии пополнения питательного субстрата и отведения токсических продуктов обмена бактерии  выращивают в непрерывной культуре в специальных биореакторах – турбидостатах и хемостатах.

С помощью этой аппаратуры  культура  бактерий поддерживается в логарифмической стадии роста

 Основные принципы и условия культивирования бактерий. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам. Особенности культивирования грибов и простейших.

Условия культивирования микроорганизмов

состав питательной среды,

кислотность среды,

аэрация,

температура,

свет,

влажность.

Для выращивания аэробных форм микроорганизмов чаще всего используется метод поверхностного культивирования на плотных и жидких питательных средах. Питательные среды разливают тонким слоем в посуду с широким дном, обычно в чашки Петри. Для получения аэробного роста в большом объеме жидкой среды требуется дополнительная аэрация. Для этого используются различные устройства, обеспечивающие постоянное перемешивание среды путем встряхивания или вращения сосудов. Можно пропускать стерилизованный воздух через жидкость под давлением с помощью пористых разбрызгивателей или обеспечивать механическое перемешивание специальными механизмами.

Для роста строго анаэробных микроорганизмов нужно исключить попадание кислорода в среду инкубации. Для этого среды перед посевом кипятят, посевы выдерживают в герметически закрытых сосудах или в специальных вакуумных анаэростатах, из которых с помощью насосов выкачивается воздух, или воздух в них заменяется каким-нибудь инертным газом (например, азотом). В анаэростат можно добавлять различные вещества, поглощающие кислород – щелочной пирогаллол, хлорид одновалентной меди и др. Кроме того используют разные приёмы: выращивание в высоком слое среды; культивирование в вязких средах; выращивание в толще плотной среды.

При культивировании автотрофных микроорганизмов, использующих в качестве источника углерода углекислый газ, добавляют в среду NaHCO3.

Существует ряд требований, предъявляемых к питательным средам:

1.      среды должны содержать полный набор необходимых питательных веществ;

2.      среды должны быть изотоничными (для большинства микроорганиз-мов концентрация солей не должна превышать 0,5 %);

3.      кислотность среды должна быть нейтральной или слабощелочной (pН=6–8). В процессе культивирования микроорганизмов в среду могут выделяться метаболиты, изменяющие рН среды настолько, что рост микроорганизмов существенно замедляется или даже становится невозможным. Чтобы избежать изменения рН, в среду добавляют буферные системы, чаще фосфатные (они малотоксичны для микроорганизмов и используются ими также в качестве источника фосфора);

4.      среды должны быть стерильными.

Принципы и методы выделения чистых культур бактерий. Методы культивирования анаэробов. Внутривидовая идентификация бактерий (эпидемическое маркирование).

Выделение чистых культур микроорганизмов и последующее изучение их свойств, физиологических и биохимических процессов, ими осуществляемых – один из важнейших приемов микробиологического анализа. Чистая культура – это культура, содержащая только один вид микроорганизма, образ. Из одной клетки в определенной среде.

Методы выделения чистых культур основываются на разделении микробных смесей на отдельные клетки. Эти методы условно можно разделить на несколько групп:

1.      Методы, основанные на механическом разобщении отдельных клеток микробов в питательных средах (используют при первичном выделении микроорганизмов из материала).

2.      Методы предварительной обработки исследуемого материала физическими или химическими факторами, оказывающими избирательное антибактериальной действие или избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры различными факторами (например, при получении культур грамотрицательных бактерий в среды вносят антибиотики, подавляющие рост грамположительной микрофлоры).

3.      Методы, использующие способность некоторых микроорганизмов быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных.

4.      Выделение отдельных клеток под контролем глаза с помощью микроманипулятора.

Описанные методы не дают полной уверенности в чистоте выделенной культуры. Поэтому после выделения микроорганизмов в чистые культуры еще раз проверяют их чистоту. Для этого рассеивают их на плотные среды различного состава и наблюдают за характером и однородностью роста колоний. Одновременно проводят микроскопический контроль, при котором о чистоте культуры судят по однородности клеток в препарате.

Для выделения чистых культур патогенных микроорганизмов часто проводится заражение восприимчивых животных.

Сущность условий, необходимых для культивирования анаэробов, заключается в снижении парциального давления молекулярного кислорода.

Механические методы:

1. Посев уколом в столбик сахарного агара.

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.

3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиологическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают анаэробы.

Физические методы:

1. Анаэростат — создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелинового масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,

Химические методы

1.  Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пирогаллол.

2.  Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета - сернистое железо.

Биологический метод Фортнера

Чашку Петри с толстым слоем агара делят на 2 половины на одну половину засевают облигатный аэроб — «чудесную» палочку, на другую половину чашки засевают исследуемую анаэробную культуру. Чашку заливают растопленным парафином. Через 24 — 48 часов в чашке вырастают аэробы, затем, когда запас кислорода исчерпывается, начинают размножаться анаэробы.

С целью выявления эпидемической цепочки заболевания, в т. ч. для обнаружения источника инфекции, осуществляют внутривидовую идентификацию бактерий, которая заключается в определении фаготипа (фаговара), изучении антигенных и других свойств выделенных бактерий. Определение фаготипа - фаготипирование производят при стафилококковой инфекции, брюшном тифе, паратифе В.

Фаготипирование — один из методов эпидемиологического маркирования. Применяется для выявления источника инфекции. Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения. Предварительно фаготируется.

При внутривидовой идентификации бактерий, т. е. при определении фаговара (фаготипа) бактерий с помощью фаготипирования, на чашку с плотной питательной средой, засеянную чистой культурой возбудителя в виде «газона», наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Бактерии, чувствительные к фагу, лизируются (образуется стерильное пятно, «бляшка» или так называемая негативная колония фага).

На засеянные «газоном» стафилококки наносятся капли взвеси стафилококковых бактериофагов. Через сутки после инкубации в термостате видны стерильные зоны отсутствия роста бактерий (стерильные «бляшки») в результате размножения бактериофагов, вызывающих лизис этих бактерий.

Противомикробные препараты. Антибиотики: источники, классификация по химической структуре, механизму, спектру и типу действия. Способы получения.

Противомикробные лекарственные средства - это препараты, которые применяют при инфекционных заболеваниях для этиотропного лечения (направленного на причину болезни), а также (редко и осторожно) для профилактики заболевания.

     Обладают избирательностью действия

Классификация

1.       По спектру действия:

     - противовирусные

     - антибактериальные

           узкого спектра

           широкого спектра

2. По типу действия:

   - микробоцидные (вызывающие необратимые повреждения),

   - микробостатические (ингибируют рост и размножение).

3. По происхождению:

   - антибиотики (биологического происхождения, действуют только на клеточные микроорганизмы),

   - синтетические химиопрепараты (действуют на клеточные и неклеточные микроорганизмы).

      Антибиотики – противомикробные препараты биологического происхождения, их полусинтетические производные или синтетические аналоги, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (вирусам, бактериям, актиномицетам, грибам, водорослям, простейшим) или к злокачественным опухолям, избирательно задерживая их рост или полностью подавляя развитие.

Классификация антибиотиков по химическому строению:

1)       β-лактамы (бактерицидное действие)

¢  Пенициллины, чаще на грам+, инактивируются пенициллиназами (кроме оксациллина, метициллина), есть широкого спектра (ампициллин, амоксициллин),

¢  Карбопенемы (имипенем), широкого спектра, уст. к β-лактамазам

¢  Монобактамы (азтреонам), узкий спектр, очень активны против грам-, резистентны к β-лактамазам

2) Гликопептиды (ванкомицин, тейкопланин), крупные молекулы, на грам+, используют при резистентности или аллергии к β-лактамам.

3) Аминогликозиды (стрептомицин, гентамицин), сизомицин, тобрамицин,  бактерицидные, широкого спектра (особенно грам-, на некоторых простейших), несколько поколений.

4) Тетрациклины (тетрациклин, доксициклин), крупные молекулы, бактериостатические, широкий спектр, действуют на внутриклеточные паразиты (риккетсии, хламидии, микоплазмы, бруцеллы).

5) Макролиды (эритромицин, олеандомицин, азитромицин, кларитромицин), бактериостатические и бактерицидные, макроциклические молекулы, широкий спектр (в т.ч. на внутриклеточные паразиты).

6) Линкозамиды (линкомицин, клиндамицин), бактериостатические, спектр как у макролидов, особенно активны против анаэробных бактерий.

7) Левомицетин (хлорамфеникол), бактериостатические, токсичные, широкий спектр (в т.ч. на внутриклеточные паразиты).

8) Рифамицины (рифампицин), бактерицидные, широкий спектр (в т.ч. на внутриклеточные паразиты), очень эфективны против микобактерий.

9) Полипептиды (полимиксины), узкий спектр (грам-), очень токсичны (используют только наружно), сейчас не используются.

10) Полиены (амфотерицин В, нистатин), противогрибковые, токсичны, чаще применяют местно.