Эндокринология учебник Лавин

1

Приложение А Исследование функции эндокринных желез с помощью стимуляционных и супрессивных проб ……………………………………………………………...371

Приложение Б Нормальные концентрации гормонов, их метаболитов и некоторых других веществ в биологических жидкостях…………………………………………387

Пиложение В Ферменты, упоминающиеся в книге………………………………………….395

2

Глава 1. Радиоиммунологический анализ

Р. Ялоу

Этот метод очень широко используется в лабораторной диагностике. С помощью РИА в биологических жидкостях определяют концентрации гормонов, факторов роста, ферментов, аутоантител, маркеров злокачественных новообразований и других веществ (например, лекарственных средств и наркотиков).

I. Принцип. В основе РИА лежит феномен конкуренции: связывание антител с антигеном, меченным радиоактивным изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Методика РИА проста и включает следующие основные этапы:

А. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.

Б. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.

В. Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их надо отделить от свободного меченного антигена. Наиболее распространены два способа разделения:

1.К реакционной смеси добавляют вещество, повышающее ее плотность, например полиэтиленгликоль.

2.К реакционной смеси добавляют вещество с большой молекулярной массой, которое специфически связывается с антителами в составе иммунных комплексов. Для этого используют вторые антитела либо стафилококковый белок A.

В обоих случаях иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.

Г. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченного антигена.

Разработано множество вариантов РИА. Методика, описанная выше, называется жидкофазным РИА (все реагенты находятся в растворенном состоянии). Существует и твердофазный РИА, в котором антитела иммобилизируются на водонерастворимом носителе, например на полистироле. Особая разновидность метода — иммунорадиометрический анализ, в котором используются меченные антитела, а не меченный антиген.

Принцип РИА распространяется и на другие иммунохимические и неиммунохимические методы анализа. Например, в ИФА вместо радиоактивного изотопа в качестве метки используют ферменты, а в иммунофлюориметрическом анализе — флуоресцирующие вещества. В неиммунохимических методах роль антител выполняют реагенты, специфически связывающие определяемое вещество. Этими реагентами могут быть рецепторы гормонов или связывающие белки плазмы. Так, в радиорецепторном анализе тиреостимулирующих и тиреоблокирующих аутоантител используются очищенные рецепторы ТТГ, а для измерения уровня свободного T4 иногда применяется тироксинсвязывающий глобулин.

Все эти методы анализа называют методами конкурентного связывания.

II. Оценка результатов. В отличие от биологических методов анализа, РИА является количественным иммунохимическим методом и дает возможность точно измерить содержание вещества (антигена) в пробе. Результат РИА зависит только от соотношения компонентов реакции антиген—антитело.

А. Условия надежности результата РИА

1.При разведении пробы измеренная концентрация вещества должна уменьшаться пропорционально степени разведения.

2.Кривая зависимости уровня связывания антител с меченным антигеном от концентрации антигена в пробе должна совпадать с калибровочной кривой.

Если эти условия не выполняются, можно предположить, что на иммунохимическую реакцию влияют факторы, перечисленные ниже. Надо отметить, что правильно интерпретированный результат РИА может иметь диагностическое значение, даже если он не удовлетворяет формальным критериям надежности (например, из­за иммунохимических различий между стандартом и пробой).

Б. Факторы, неспецифически влияющие на иммунохимическую реакцию

1.pH. Скорость реакции антиген—антитело и стабильность иммунных комплексов обычно не зависят от pH в интервале 7,0—8,5. Как правило, в очень кислой или очень щелочной среде иммунные комплексы диссоциируют, хотя некоторые белки с основными свойствами лучше всего взаимодействуют с антителами при pH 4,0—6,0. Поэтому для каждой системы РИА подбирают оптимальный pH.

2.Состав реакционной смеси также влияет на реакцию антиген—антитело. Энергия взаимодействия антигена с антителом уменьшается при высокой концентрации солей в пробе или в реакционной смеси. Некоторые лекарственные средства (гепарин) и бактерицидные препараты (тиомерсал) подавляют иммунохимическую реакцию. Поэтому для разведения стандартов и проб используют один и тот же буферный раствор и учитывают возможные эффекты компонентов реакционной смеси.

В. Перекрестная иммунореактивность веществ со сходным строением

1.Гетерогенность молекулярных форм пептидных гормонов

3

а. Пептидные гормоны синтезируются в виде белков­предшественников, которые перед выбросом в кровь подвергаются процессингу. При этом образуется одна или несколько форм гормона, обладающих или не обладающих биологической активностью. Например, при процессинге секретина и ВИП образуется только по одной биологически активной форме каждого гормона. Напротив, гастрин, синтезируемый клетками антрального отдела привратника, поступает в кровь как в виде зрелого гормона, состоящего из 17 аминокислот, так и в виде биологически активного предшественника, содержащего 34 аминокислоты. Оба пептида определяются в одной и той же системе РИА.

б. На результаты РИА влияют биологически неактивные молекулярные фрагменты гормонов, такие, как C­ концевой фрагмент ПТГ. Концентрация этого фрагмента в сыворотке в норме превышает концентрацию зрелого ПТГ (ПТГ1—84), а при болезнях почек существенно увеличивается (даже у больных без вторичного гиперпаратиреоза). Поскольку для определения ПТГ обычно используют антитела к C­концевому фрагменту, правильная интерпретация результата требует оценки функции почек. Концентрацию ПТГ1—84 в плазме можно определить с помощью высокочувствительного иммунорадиометрического метода, основанного на использовании двух разных антител: к C­ и N­концевому фрагментам ПТГ. Антитела к C­концевому фрагменту иммобилизируют на полимерном носителе. Затем добавляют пробы или стандарты (растворы ПТГ1—84 в сыворотке, предварительно очищенной от ПТГ и его фрагментов) и меченные 125I антитела к N­концевому фрагменту ПТГ. Антитела, иммобилизированные на носителе, связывают как C­концевой фрагмент, так и ПТГ1—84, но антитела к N­концевому фрагменту связываются только с ПТГ1—84. Такой подход используют и в других случаях, когда в пробе присутствуют молекулярные фрагменты гормона.

в. У животных разных видов первичные структуры одного и того же пептидного гормона могут быть идентичными, но чаще различаются по одной или нескольким аминокислотам. Аминокислотные замены возникают

врезультате мутаций и, как правило, локализуются в участках молекулы гормона, не играющих первостепенной роли

вего биологической активности. Различия в первичной структуре определяют иммунореактивность гормона.

2. Гетерогенность других соединений а. Лекарственные средства и наркотики. Вещества, структурно сходные с препаратом, и его метаболиты могут

связываться или не связываться с антителами. Если измеряют содержание токсичного препарата, то необходимо знать, выявляет ли данная методика только активную форму препарата. Напротив, если требуется доказать употребление наркотика, то различия в иммунореактивности между самим наркотиком и его метаболитами можно не учитывать. Таким образом, требования к специфичности РИА зависят от цели анализа.

б. Ферменты. РИА позволяет измерять содержание фермента, но не его активность. Ингибиторы и активаторы фермента и присутствие субстрата не влияют на результат. В одной и той же системе можно определять как сам фермент, так и профермент и другие неактивные формы фермента. В зависимости от задач исследования эти особенности метода могут играть положительную или отрицательную роль, поскольку многие ферменты обладают видовой специфичностью, а биологическая активность фермента необязательно коррелирует с его иммунохимической реактивностью. Поэтому РИА следует рассматривать как дополнение к методам анализа ферментов, основанным на определении их активности, а не как замену этих методов.

III. Чувствительность и специфичность РИА

А. Чувствительность РИА очень высока. Некоторые методики выявляют очень низкие концентрации веществ, такие, как 10–14 моль/л. Чувствительность особенно важна при измерении базальных концентраций пептидных гормонов (эти концентрации обычно находятся в пределах от 10–13 до 10–10 моль/л), а также при определении гормонов непептидной природы, наркотиков и лекарственных средств, ферментов, бактериальных и вирусных антигенов.

Б. Специфичность РИА определяется специфичностью антител и может быть чрезвычайно высокой. Получены антитела и разработаны методики РИА, позволяющие дифференцировать антигены с малейшими структурными различиями, в том числе:

1.T3 и T4 (различаются одним атомом йода).

2.Кортизол и кортикостерон (различаются одним гидроксильным радикалом).

3.Инсулины человека и свиньи (различаются концевой аминокислотой B­цепи).

4.Инсулины свиньи, кашалота и собаки (имеют одинаковую последовательность аминокислот, но разную конформацию).

IV. Особенности применения РИА в клинике. В основе определения многих сотен эндогенных и экзогенных веществ лежит общий принцип, но требования к чувствительности метода и диагностическое значение результатов различаются.

А. Концентрации некоторых пептидных гормонов у одного человека меняются в очень широких пределах: под влиянием стимуляторов или ингибиторов секреции и в зависимости от времени суток уровень гормона может изменяться на 1—2 порядка. В таких случаях результаты РИА сами по себе не имеют первостепенного значения для диагноза. Пример: базальная концентрация гастрина в плазме у здоровых людей обычно < 50 пг/мл. У больных со сниженной кислотностью желудочного содержимого, с гастриномами (синдром Золлингера—Эллисона) или с нарушением регуляции продукции гастрина в привратнике (неопухолевая гипергастринемическая гиперхлоргидрия) базальный уровень гастрина значительно повышен и находится в пределах от 100 до 5000 пг/мл. Чтобы установить причину гипергастринемии, необходимо исследовать желудочную секрецию и провести дифференциальную диагностику синдрома Золлингера—Эллисона и неопухолевой гипергастринемической гиперхлоргидрии. Для дифференциальной диагностики применяют стимуляционные пробы с секретином или с пищевой нагрузкой. В/в введение секретина вызывает выброс гастрина из опухоли, но не из нормальных клеток привратника. Напротив, пищевая нагрузка стимулирует секрецию гастрина в клетках привратника, но не в клетках гастриномы. Стимуляционные и супрессивные пробы могут потребоваться и в других подобных случаях.

4

Б. Концентрацию гормона следует сопоставлять с концентрациями веществ, метаболизм которых регулируется данным гормоном, и веществ, регулирующих его секрецию. Например, продукция инсулина усиливается при повышении концентрации глюкозы и некоторых аминокислот в крови и снижается при гипогликемии. Уровень СТГ возрастает при стрессе и гипогликемии и снижается при гипергликемии. Высокий уровень АКТГ в плазме на фоне сниженного уровня кортикостероидов свидетельствует о первичной надпочечниковой недостаточности; если же содержание кортикостероидов повышено, следует заподозрить гипофизарный синдром Кушинга. Для уточнения результатов РИА нередко требуются стимуляционные и супрессивные пробы.

В. При определении непептидных гормонов (в частности, стероидных и тиреоидных) чувствительность метода очень важна, поскольку в норме концентрации этих гормонов очень низкие.

Г. При определении концентраций лекарственных средств, особенно препаратов с узким терапевтическим диапазоном, также требуется высокая чувствительность РИА.

Д. При определении антигенов вирусов и микроорганизмов (таких, как антиген вируса гепатита B или туберкулопротеид) надо учитывать, что их абсолютная концентрация в какой­либо биологической жидкости зависит не только от тяжести инфекции, но и от других факторов, например — от способа получения материала.

Е. Биологическая активность гормона, его фрагмента или аналога далеко не всегда соответствует его иммунохимической реактивности. Чтобы по результатам РИА судить о биологической активности гормона, нужно знать, в каких молекулярных формах существует гормон и какие из них можно определить с помощью данной методики РИА. Например, гастрин присутствует в сыворотке в виде зрелого гормона, состоящего из 17 аминокислот (Г17), и в виде биологически активного предшественника, содержащего 34 аминокислоты (Г34). Поскольку Г17 метаболизируется значительно быстрее, чем Г34, в плазме преобладает Г34. Обе формы гастрина стимулируют секрецию соляной кислоты в желудке, причем относительная активность Г17 в 3—5 раз превышает активность Г34. После в/в введения собакам эквимолярных количеств Г17 и Г34 общий объем выделившейся кислоты одинаков, хотя уровень Г34 в плазме в 3—5 раз выше уровня Г17. Таким образом, результат определения биологической активности гастрина зависит от методики анализа.

V. Заключение. Роль РИА и других иммунохимических методов анализа в диагностике болезней и в фундаментальных медико­биологических исследованиях трудно переоценить. Тем не менее при планировании и оценке результатов иммунохимических исследований надо принимать во внимание все их особенности и тонкости и ставить диагностические задачи с учетом реальных возможностей метода.

Литература

1.Nussbaum SR, et al. Highly sensitive two­site immunoradiometric assay of parathyrin, and its clinical utility in evaluating patients with hypercalcemia. Clin Chem 33:1364, 1987.

2.Yalow RS. Radioimmunoassay. Annu Rev Biophys Bioeng 9:327, 1980.

3.Yalow RS. Heterogeneity of peptide hormones: Its relevance in clinical radioimmunoassay. Adv Clin Chem 20:1, 1978.

4.Yalow RS. Heterogeneity of peptide hormones. Recent Prog Horm Res 30:597, 1974.

5.Yalow RS. Radioimmunoassay: Practices and pitfalls. Circ Res 32, 33(Suppl 1):1, 1973.

6.Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J Clin Invest 39:1157, 1960.

***********************************

5

Глава 2. Резистентность к гормонам

М. Геффнер

I. Историческая справка. Представление о резистентности к гормонам как о причине эндокринных болезней было впервые сформулировано Ф. Олбрайтом с сотрудниками в 1942 г. применительно к псевдогипопаратиреозу, при котором ткани нечувствительны к ПТГ. К настоящему времени известно множество синдромов резистентности и к другим гормонам.

II. Общие сведения

А. Ранее считали, что гормоны влияют только на клетки­мишени, удаленные от эндокринных желез (эндокринный механизм действия гормонов). Сейчас известно, что гормоны могут действовать на соседние клетки эндокринной железы (паракринный механизм) и даже на клетки, где они сами вырабатываются (аутокринный механизм). Резистентными к гормону могут быть любая из клеток­мишеней или все эти клетки.

Б. Факторы роста, такие, как фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста или эпидермальный фактор роста, обычно не относят к гормонам. Однако это разграничение лишено смысла, поскольку факторы роста регулируют не только клеточную пролиферацию и дифференцировку, но и обмен веществ в клетках­мишенях. В свою очередь, многие гормоны (например, инсулин и СТГ) обладают как метаболическими, так и рост­регулирующими эффектами.

В. Формы резистентности к гормонам. Принято различать три формы резистентности: пререцепторную

(вызванную факторами, присутствующими в крови), рецепторную (обусловленную нарушениями связывания гормона с рецептором) и пострецепторную (обусловленную нарушениями внутриклеточной передачи сигнала, возникающего при связывании гормона с рецептором). Эта классификация слишком схематична и, более того, неверна, так как присутствующие в крови факторы способны влиять как на функцию рецепторов, так и на пострецепторные процессы. Мы предлагаем иную классификацию, согласно которой нарушения чувствительности к гормонам могут быть разделены на внутренние и внешние.

1.Внутренние, или первичные, нарушения вызваны генетическими дефектами клеток­мишеней и сохраняются при культивировании этих клеток in vitro. Примером может служить инсулинорезистентность, обусловленная точечными мутациями гена рецептора инсулина. Обнаружено около 30 разных мутаций, которые нарушают связывание инсулина с рецептором, интернализацию гормон­рецепторного комплекса, аутофосфорилирование бета­ субъединицы рецептора или фосфорилирование других белковых субстратов.

2.Внешние, или вторичные, нарушения обусловлены факторами, присутствующими в крови, исчезают после удаления этих факторов и не воспроизводятся in vitro. В качестве примера опять приведем некоторые формы инсулинорезистентности. К внешним факторам, ослабляющим действие инсулина, относятся: избыток контринсулярных гормонов, аутоантитела, блокирующие рецепторы инсулина, уремия. Приобретенная инсулинорезистентность при ожирении и инсулинонезависимом сахарном диабете чаще всего вызвана именно внешними факторами. На это указывает восстановление чувствительности к инсулину после диетотерапии и медикаментозного лечения. Существуют и наследственные формы инсулинорезистентности, обусловленной внешними нарушениями. Об этом свидетельствуют семейные исследования в популяциях с высокой частотой инсулинонезависимого сахарного диабета (например, в племени индейцев Пима). В таких популяциях инсулинорезистентность является главным фактором риска инсулинонезависимого сахарного диабета. Вероятно, существует генетический дефект, который вызывает изменение состава сыворотки, приводящее к снижению чувствительности клеток­мишеней к инсулину. В табл. 2.1 внутренние и внешние причины инсулинорезистентности перечислены более подробно.

Г. Молекулярно­биологические исследования. За последнее десятилетие удалось локализовать и клонировать гены почти всех известных гормонов и факторов роста, их рецепторов и отдельных структурных звеньев пострецепторных сигнальных механизмов (см. табл. 2.2). Были открыты три универсальных механизма внутриклеточной передачи сигналов пептидных гормонов и доказано существование семейств рецепторов гормонов.

1.Внутриклеточная передача сигналов пептидных гормонов а. Аутофосфорилирование рецептора по остаткам тирозина (так называемая тирозинкиназная активность

рецептора) и фосфорилирование по тирозину других внутриклеточных белковых субстратов. С помощью этого механизма на клетки­мишени действуют инсулин, ИФР­I, эпидермальный фактор роста и тромбоцитарный фактор роста. Кроме того, сигналы инсулина и ИФР­I могут передаваться внутрь клетки с помощью второго посредника — инозит­фосфат­гликана.

б. Система цАМФ (аденилатциклазная система). Рецепторы пептидных гормонов, для которых вторым посредником служит цАМФ, структурно и функционально сопряжены с G­белками (белками, связывающими гуаниловые нуклеотиды). G­белки — это гетеротримеры, состоящие из субъединиц альфа, бета и гамма. Альфа­ субъединица любого G­белка обеспечивает его связывание с рецептором, содержит ГТФ­связывающий участок и обладает ГТФазной активностью. Различают несколько разновидностей альфа­субъединиц, в том числе — альфаs (Gsальфа) и альфаi (Giальфа), активирующие или инактивирующие внутриклеточный субстрат соответственно. Например, белок Gsальфа стимулирует аденилатциклазу, а белок Giальфа ингибирует этот фермент. Белок Gsальфа опосредует передачу сигналов ПТГ, ЛГ, ФСГ, ХГ, АКТГ, АДГ и глюкагона. Связывание этих гормонов с рецепторами приводит к фосфорилированию или дефосфорилированию многочисленных внутриклеточных белков­мишеней, в том числе — белков, участвующих в специфических клеточных реакциях.

в. Фосфоинозитидная система. Передача сигналов от многих рецепторов, сопряженных с G­белками, происходит с помощью инозитол­1,4,5­трифосфата и 1,2­диацилглицерина. Эти вещества образуются при гидролизе мембранного липида — фосфатидилинозитол­4,5­дифосфата. Инозитол­1,4,5­трифосфат вызывает

6

высвобождение кальция из внутриклеточных структур, а 1,2­диацилглицерин активирует протеинкиназу C. Инозитол­1,4,5­трифосфат и 1,2­диацилглицерин участвуют в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки и опосредуют действие многих гормонов, в частности — АДГ (через рецепторы типа V1) и бомбезина.

2.Семейства рецепторов. Молекулярно­биологические исследования вскрыли гомологию аминокислотных последовательностей различных рецепторов, помогли понять эволюцию рецепторов и объединить их в семейства. Например, внеклеточный домен рецептора СТГ относится к семейству, включающему рецепторы пролактина, интерлейкинов­2, ­3, ­4, ­6, ­7, эритропоэтина и гранулоцитарно­макрофагального колониестимулирующего фактора. Рецептор андрогенов локализуется внутри клетки и принадлежит к семейству лиганд­чувствительных регуляторов

транскрипции; это семейство включает также рецепторы ретиноевой кислоты, тиреоидных гормонов и 1,25(OH)2D3. После присоединения гормона к гормонсвязывающему домену такие рецепторы активируются и перемещаются в ядро. ДНК­связывающий домен активированного рецептора распознает регуляторную последовательность гена­ мишени (так называемый лиганд­чувствительный элемент гена), взаимодействует с ней и стимулирует транскрипцию. Молекулярно­биологические исследования позволили охарактеризовать генетические дефекты рецепторов, лежащие в основе резистентности к гормонам (см. табл. 2.2).

Д. Нарушения специфичности взаимодействия гормона с рецептором. При резистентности к какому­либо гормону его концентрация в сыворотке, как правило, возрастает (иногда на несколько порядков) в соответствии с принципом отрицательной обратной связи. Постоянно повышенный уровень гормона может привести к запуску неспецифического механизма действия гормона (к срыву специфичности). Гормон, концентрация которого повышена, будет связываться не только со своими специфическими рецепторами, но и с рецепторами гомологичных гормонов или факторов роста. Срыв специфичности наблюдается не только при резистентности к гормонам. Например, при диабете беременных избыток инсулина вызывает макросомию плода, действуя через рецепторы ИФР­ I. Некоторые опухоли секретируют ИФР­II, который связывается с рецепторами инсулина и вызывает гипогликемию. Избыток СТГ при акромегалии активирует рецепторы пролактина, что приводит к галакторее. Гиперинсулинемия при инсулинорезистентности вызывает гиперандрогению (синдром поликистозных яичников), acanthosis nigricans и гипертрофическую кардиомиопатию. Все эти эффекты инсулина опосредуются рецепторами ИФР­I.

III. Резистентность к пептидным гормонам А. Инсулин

1.Ожирение и инсулинонезависимый сахарный диабет. Почти у всех больных инсулинонезависимым сахарным диабетом и у всех лиц с ожирением имеется инсулинорезистентность, однако ее патогенез точно не установлен. Инсулинорезистентность при инсулинонезависимом сахарном диабете проявляется нарушениями центральных и периферических механизмов действия инсулина: он не подавляет гликогенолиз и глюконеогенез в печени и не стимулирует поглощение и утилизацию глюкозы в жировой и мышечной тканях. Периферическая инсулинорезистентность у лиц с ожирением выражена в меньшей степени, чем у больных инсулинонезависимым сахарным диабетом. Число рецепторов инсулина при инсулинонезависимом сахарном диабете и ожирении снижено, однако это снижение обусловлено постоянной гиперинсулинемией, имеет физиологический характер и не считается причиной инсулинорезистентности. При нормальном или сниженном уровне инсулина у больных инсулинонезависимым сахарным диабетом число рецепторов инсулина не уменьшается. У лиц с ожирением и у больных инсулинонезависимым сахарным диабетом выявлено обратимое нарушение тирозинкиназной активности рецепторов инсулина в скелетных мышцах. Стимулируемый инсулином транспорт глюкозы в мышцах и жировых клетках нарушен как при ожирении, так и при инсулинонезависимом сахарном диабете, однако количество чувствительного к инсулину мембранного белка­переносчика глюкозы GLUT­4 в скелетных мышцах больных инсулинонезависимым сахарным диабетом остается нормальным. В племени индейцев Пима и в других популяциях с высокой частотой инсулинонезависимого сахарного диабета ведется поиск генетических дефектов, которые могли бы служить причиной предрасположенности: дефектов гена инсулина, гена рецептора инсулина, гена GLUT­4. Этот поиск пока не дал существенных результатов. При обследовании семей, в которых наблюдаются случаи юношеского инсулинонезависимого сахарного диабета (MODY), были обнаружены мутации гена гексокиназы на 7­й хромосоме (см. гл. 43, п. V.А.3). Некоторые аллельные варианты этого гена оказались тесно сцепленными с гипергликемией.

2.Синдром множественных метаболических нарушений (синоним: метаболический синдром X). Компоненты синдрома: инсулинорезистентность, дислипопротеидемия, атеросклероз и артериальная гипертония. Недавние эпидемиологические исследования показали, что гиперинсулинемия, обусловленная инсулинорезистентностью, является самостоятельным фактором риска атеросклероза. Патогенетическая роль гиперинсулинемии в развитии этих заболеваний не вызывает сомнений, поскольку известно, что инсулин стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов, усиливает задержку натрия и воды почками, повышает симпатический тонус, увеличивает содержание холестерина ЛПОНП и уменьшает содержание холестерина ЛПВП. Механизм, посредством которого инсулин на фоне инсулинорезистентности вызывает все эти изменения, пока не открыт.

3.Внутренние (первичные) нарушения на уровне клеток­мишеней, как правило, приводят к тяжелой инсулинорезистентности. Такие нарушения описаны при некоторых редких наследственных синдромах.

а. Синдром инсулинорезистентности и acanthosis nigricans типа А

1) Клиническая картина: acanthosis nigricans; у молодых женщин — вирилизация, обусловленная гиперандрогенией яичникового происхождения.

2) Этиология: в некоторых случаях — мутации гена рецептора инсулина.

б. Синдром Рабсона—Менденхалла

1) Клиническая картина: как при синдроме инсулинорезистентности и acanthosis nigricans типа А, но включает еще дисплазию зубов, гиперплазию шишковидного тела и изменения других органов (например, дистрофию ногтей).

7

2) Этиология: в некоторых случаях — мутации гена рецептора инсулина.

в. Псевдоакромегалия

1)Клиническая картина: как при синдроме инсулинорезистентности и acanthosis nigricans типа А, но включает еще увеличение конечностей, огрубление черт лица, гипертрофию мышц, мышечные спазмы, увеличение межзубных промежутков и другие признаки акромегалии.

2)Этиология: возможно, мутации гена рецептора инсулина или другие дефекты клеток­мишеней.

г. Лепречаунизм (синдром Донохью)

1)Клиническая картина: синдром характерен для детей, родившихся от близкородственных браков; наследование аутосомно­рецессивное; внутриутробная и постнатальная задержка развития; низкорослость; гротескное лицо; липодистрофия; мышечная слабость; acanthosis nigricans; гиперандрогения яичникового происхождения; преждевременное половое развитие; гипертрофическая кардиомиопатия; смерть в молодом возрасте.

2)Этиология: мутации гена рецептора инсулина; возможно, в сочетании с дефектами рецепторов ИФР­I и эпидермального фактора роста.

д. Врожденная генерализованная липодистрофия (синдром Сейпа—Лоуренса)

1)Клиническая картина: как при синдроме инсулинорезистентности и acanthosis nigricans типа А, но включает еще атрофию жировой клетчатки по всему телу, спланхномегалию, гипертрофическую кардиомиопатию, акромегалию

игипертриглицеридемию.

2)Этиология: возможно, мутации гена рецептора инсулина или другие дефекты клеток­мишеней.

е. Сегментарная липодистрофия

1)Клиническая картина: сегментарная атрофия или гипертрофия жировой ткани; признаки, характерные для синдрома инсулинорезистентности и acanthosis nigricans типа А; гепатоспленомегалия; гипертрофическая кардиомиопатия; признаки акромегалии; гипертриглицеридемия.

2)Этиология: возможно, мутации гена рецептора инсулина или другие дефекты клеток­мишеней.

4. Внешние (вторичные) нарушения а. Физиологические состояния: пубертатный период (инсулинорезистентность — следствие повышенной

секреции СТГ), беременность, пожилой возраст.

б. Эндокринные болезни: синдром Кушинга (глюкокортикоиды), акромегалия (СТГ), феохромоцитома (катехоламины), глюкагонома (глюкагон), тиреотоксикоз, гипотиреоз, гиперпаратиреоз.

в. Другие патологические состояния: инфекция, стресс, голодание, уремия, цирроз печени, кетоацидоз.

г. Антитела, блокирующие рецепторы инсулина: обнаружены у лиц с аутоиммунными заболеваниями, в

частности — при синдроме инсулинорезистентности и acanthosis nigricans типа Б и атаксии­телеангиэктазии.

Б. СТГ

1. Общие сведения. Клонированы кДНК рецепторов СТГ человека, кролика, мыши, крысы, овцы, коровы и свиньи. Эти кДНК кодируют аминокислотную последовательность, включающую сигнальный пептид (18— 24 аминокислоты) и собственно рецептор (614—626 аминокислот). Зрелый рецептор СТГ состоит из внеклеточного гормонсвязывающего домена (содержит около 250 аминокислот), трансмембранного домена (10—20 аминокислот) и внутриклеточного домена (около 350 аминокислот). N­концевая аминокислотная последовательность СТГ­ связывающего белка, присутствующего в крови, идентична последовательности гормонсвязывающего домена рецептора СТГ. Как образуется СТГ­связывающий белок — путем альтернативного сплайсинга мРНК рецептора СТГ или путем протеолиза зрелого рецептора, — неизвестно. У человека обнаружен один ген рецептора СТГ, он локализуется на 5­й хромосоме и содержит не менее 87 000 нуклеотидов.

2. Внутренние (первичные) нарушения а. Карликовость Ларона

1)Клиническая картина: болезнь характерна для детей, родившихся от близкородственных браков; наследование аутосомно­рецессивное; задержка роста в постнатальном периоде и низкорослость у взрослых; диспропорции лица и черепа; высокий уровень СТГ в детском возрасте; низкий уровень ИФР­I; почти всегда значительное снижение уровня СТГ­связывающего белка; лечение соматропином малоэффективно.

2)Этиология. В одном из исследований у 2 из 9 больных выявили крупные делеции в гене СТГ. В другом исследовании обнаружили замену одной аминокислоты в гормонсвязывающем домене рецептора СТГ. Известно 3 случая, когда выпадение нескольких аминокислот в гормонсвязывающем домене было обусловлено возвратными нонсенс­мутациями гена рецептора СТГ. Еще один дефект выявлен у 36 из 37 больных из Эквадора: это мутация 180­

го кодона в 6­м экзоне гена рецептора СТГ, приводящая к нарушению сплайсинга мРНК рецептора и к выпадению 8 аминокислот из гормонсвязывающего домена. Наконец, описан больной, у которого имелись две аминокислотные замены во внутриклеточном домене рецептора СТГ.

б. Африканские пигмеи

1)Телосложение и обмен веществ. Очень низкий рост взрослых пигмеев, по­видимому, является приспособлением для выживания в джунглях; определенную роль может играть периодическое голодание. У африканских пигмеев уровень СТГ в сыворотке не повышен, а содержание ИФР­связывающего белка типа 3 и СТГ­ связывающего белка понижено. B­лимфоциты пигмеев, трансформированные вирусом Эпштейна—Барр in vitro, при стимуляции СТГ секретируют меньше ИФР­I, чем трансформированные B­лимфоциты африканцев нормального роста. Низкий уровень СТГ­связывающего белка обнаружен также у представителей другой популяции низкорослых людей — жителей горы Ок (Папуа — Новая Гвинея).

2)Механизм. В двух популяциях пигмеев выявили полиморфизм длины рестрикционных фрагментов гена рецептора СТГ, редко встречающийся в других африканских популяциях. Однако недавние исследования показали,

8

что нуклеотидная последовательность гена рецептора СТГ у пигмеев не отличается от последовательности этого гена

улюдей нормального роста. Таким образом, механизм резистентности к СТГ у пигмеев остается невыясненным.

3.Внешние (вторичные) нарушения. Обратимая резистентность к СТГ иногда наблюдается при голодании. Эта форма резистентности к СТГ легко моделируется в опытах на крысах (при исключении белка из рациона).

В. ИФР­I

1.Общие сведения. Основным источником ИФР­I является печень. Продукция ИФР­I в печени усиливается при повышении уровня СТГ. ИФР­I опосредует рост­стимулирующее действие СТГ и, таким образом, является типичным гормоном. Кроме того, ИФР­I играет важнейшую роль в аутокринной и паракринной регуляции разных функций клеток. ИФР­I и рецепторы ИФР­I обнаружены во многих тканях. Как ИФР­I, так и ИФР­II связываются с рецепторами ИФР­I, с рецепторами ИФР­II/маннозо­6­фосфата, а также (хотя и в меньшей степени) с рецепторами инсулина и активируют все перечисленные рецепторы. Рецептор ИФР­I сходен с рецептором инсулина и состоит из двух внеклеточных гормонсвязывающих альфа­субъединиц, содержащих богатые цистеином домены, и двух трансмембранных бета­субъединиц, содержащих тирозинкиназные домены. ИФР­I и ИФР­II присутствуют в плазме преимущественно в виде комплексов со специфическими связывающими белками. Наиболее распространен ИФР­ связывающий белок типа 3. Синтез этого белка с молекулярной массой 150 000, содержащего три полипептидные цепи, регулируется СТГ. Роль ИФР­связывающих белков не до конца ясна, хотя известно, что почти все они препятствуют связыванию ИФР с рецепторами и тем самым подавляют действие ИФР на клетки­мишени.

2.Внутренние (первичные) нарушения а. При обследовании детей с задержкой роста (но без пороков развития) в двух случаях обнаружили

резистентность к ИФР­I и повышение концентрации ИФР­I в сыворотке. Чтобы установить причину резистентности к ИФР­I, исследовали его связывание с аутологичными фибробластами. В одном случае уровень связывания ИФР­I с аутологичными фибробластами был в 2 раза ниже, чем с фибробластами детей без задержки роста. Во втором случае аутологичные фибробласты оказались резистентными к ИФР­I из­за нарушений продукции ИФР­I­связывающих белков и их связывания с клетками.

б. У нескольких больных с внутриутробной или постнатальной задержкой развития обнаружили дистальные делеции в длинном плече 15­й хромосомы либо кольцевую 15­ю хромосому; в любом случае хромосомная аберрация захватывала локус, кодирующий рецептор ИФР­I.

3.Внешние (вторичные) нарушения

а. Голодание приводит к обратимому снижению уровня ИФР­I и развитию преходящей резистентности к ИФР­I. Опыты на крысах показали, что при белковом голодании развивается резистентность как к ИФР­I, так и к СТГ.

б. Одной из причин задержки роста при ХПН является резистентность к ИФР­I, обусловленная повышением уровня ИФР­связывающих белков. В таких случаях резистентность к ИФР­I удается преодолеть с помощью высоких доз соматропина.

в. Сахарный диабет. В сыворотке детей, больных инсулинозависимым сахарным диабетом, обнаружено вещество, подавляющее действие ИФР­I. Предполагают, что резистентность к ИФР­I, вызванная этим веществом, служит причиной синдрома Мориака (задержки роста у детей с инсулинозависимым сахарным диабетом). При инсулинонезависимом сахарном диабете и ожирении наблюдается резистентность мышечной ткани к ИФР­I: поглощение глюкозы мышечными клетками in vitro не усиливается в присутствии ИФР­I.

Г. АКТГ

1. Общие сведения. Клонированы кДНК человеческого рецептора АКТГ и кДНК рецепторов МСГ — гормона, сходного с АКТГ. Ген рецептора АКТГ ACTHR/MC2R локализуется на 18­й хромосоме. Рецептор содержит 297 аминокислот и состоит из 4 субъединиц. Генетические дефекты рецепторов АКТГ или внутриклеточной передачи сигнала АКТГ приводят к резистентности к этому гормону и лежат в основе редких форм врожденной первичной надпочечниковой недостаточности.

2. Синдромы резистентности к АКТГ а. Изолированная резистентность к АКТГ (синонимы: семейный дефицит глюкокортикоидов, врожденная

резистентность к АКТГ). Этот синдром встречается редко (описано около 150 больных), наследуется аутосомно­ рецессивно и, как правило, обусловлен инактивирующими мутациями гена рецептора АКТГ. У некоторых больных такие мутации не обнаруживаются. Вероятно, в этих случаях причиной синдрома являются мутации других генов, нарушающие внутриклеточную передачу сигнала АКТГ. Клиническая картина: гиперпигментация, признаки глюкокортикоидной недостаточности, гипогликемия. При биопсии надпочечников выявляется гипоплазия или аплазия пучковой и сетчатой зоны коры надпочечников. Уровень АКТГ в плазме значительно повышен, а уровень кортизола снижен и не повышается при введении тетракозактида. Уровень альдостерона у большинства больных нормальный. Лечение кортикотропином и тетракозактидом неэффективно.

б. Синдром Оллгрова также наследуется аутосомно­рецессивно и, кроме резистентности к АКТГ, включает ахалазию кардии и нарушение слезоотделения (алакримию). Поэтому синдром называют также синдромом трех А (по первым буквам названий основных компонентов). Описано около 70 больных. Мутации гена рецептора АКТГ не выявлены ни у одного больного, но обнаружено сцепление с некоторыми генами на 12q13. Другие компоненты синдрома: гиперпигментация, признаки глюкокортикоидной недостаточности, тяжелые приступы гипогликемии в детском возрасте (иногда со смертельным исходом), неврологические нарушения, умственная отсталость, гиперкератоз ладоней и подошв.

Д. Гонадотропные гормоны

1. Общие сведения. Обнаружено и клонировано несколько генов, кодирующих рецепторы ЛГ и ХГ. Все эти гены локализуются на 2­й хромосоме. Ген рецептора ФСГ также клонирован; он локализуется на 14­й хромосоме. Рецепторы ЛГ и ХГ — одни из самых крупных рецепторов, сопряженных с G­белками. Каждый рецептор ЛГ и ХГ

9

состоит из внеклеточного домена, трансмембранного домена, содержащего 7 субъединиц, и внутриклеточного домена. Структура рецептора ФСГ изучена хуже. Рецепторы ЛГ и ХГ и рецепторы ФСГ обнаружены не только в половых железах, но и во многих других органах. Генетические дефекты рецепторов гонадотропных гормонов приводят к нарушениям полового развития и вторичному гипогонадизму.

2.Синдром резистентных яичников. Это редкая форма первичной яичниковой недостаточности, обусловленная нечувствительностью клеток яичников к гонадотропным гормонам. Клиническая картина: первичная или вторичная аменорея, первичное бесплодие, нормальное развитие внутренних и наружных половых органов. Уровень ФСГ в сыворотке повышен; уровни эстрогенов снижены незначительно. Часть эстрогенов синтезируется в яичниках, часть образуется из андрогенов в периферических тканях. Яичники обычно уменьшены, при биопсии в них обнаруживается множество примордиальных фолликулов, но атретические фолликулы отсутствуют. По этому признаку синдром резистентных яичников отличают от преждевременной менопаузы. Самая распространенная причина синдрома — мутации генов рецепторов ЛГ и ХГ. Другая причина — появление аутоантител, блокирующих рецепторы ЛГ, ХГ и ФСГ.

3.Точечные мутации гена рецептора ЛГ и ХГ у лиц с генотипом 46,XY могут быть причиной мужского псевдогермафродитизма, первичного гипогонадизма или микропении. Описано несколько больных мужского пола с первичной тестикулярной недостаточностью и микропенией, у которых введение человеческого ХГ лишь незначительно усиливало секрецию тестостерона. При этом в биоптате семенников обнаруживали нормальные количества клеток Лейдига и сперматогенные клетки на разных стадиях развития. Связывание человеческого ХГ с гомогенатом ткани семенников было ниже, чем в норме. Установили, что в таких случаях резистентность к ХГ обусловлена дефектами рецепторов ЛГ и ХГ на клетках Лейдига.

Е. АДГ

1.Общие сведения. Антидиуретическое действие АДГ опосредуется рецепторами типа V2, функционально

сопряженными с G­белками, а сосудосуживающее действие — рецепторами типа V1, сопряженными с фосфоинозитидной системой. Гены рецепторов АДГ клонированы; ген рецептора типа V2 локализуется на X­ хромосоме.

2. Нефрогенный несахарный диабет. Это заболевание может быть наследственным и приобретенным. В обоих случаях дистальные канальцы и собирательные трубочки почек резистентны к действию АДГ. Наследственный нефрогенный несахарный диабет — редкое, сцепленное с X­хромосомой заболевание. В семьях, где выявляется это заболевание, поражено 50% мужчин. Чаще наблюдается полная резистентность к АДГ, хотя встречаются варианты заболевания с частичной резистентностью. Приобретенный нефрогенный несахарный диабет может быть вызван любыми факторами, нарушающими связывание АДГ с рецепторами или внутриклеточную передачу сигнала АДГ. Распространенные причины приобретенного нефрогенного несахарного диабета:

а. Лекарственные средства: литий, демеклоциклин, диуретики (блокируют аденилатциклазу и образование цАМФ).

б. Электролитные нарушения: гипокалиемия стимулирует образование простагландина E2 и тем самым препятствует активации аденилатциклазы. Гиперкальциемия блокирует взаимодействие рецепторов АДГ с аденилатциклазой.

в. Осмотический диурез: сахарный диабет, уменьшение числа нефронов при нефрите.

г. Болезни почек: постобструктивный диурез, почечный канальцевый ацидоз, пиелонефрит, некроз почечных сосочков, серповидноклеточная анемия.

д. Тиреотоксикоз: усиление клубочковой фильтрации.

Ж. ПТГ

1. Общие сведения. Обнаружено 2 типа рецепторов ПТГ и ПТГ­подобных пептидов. Ген рецептора типа 1 (PTHR1) локализуется на коротком плече 3­й хромосомы, а ген рецептора типа 2 (PTHR2) — на длинном плече 2­ й хромосомы. Оба гена клонированы. Передача сигнала от рецепторов ПТГ опосредуется белком Gsальфа, ген которого локализуется в теломерной области длинного плеча 20­й хромосомы.

2. Синдромы резистентности к ПТГ. При всех этих синдромах на фоне повышенного уровня ПТГ

наблюдается гипокальциемия и гиперфосфатемия. Поэтому их обозначают общим термином псевдогипопаратиреоз. Описано несколько форм псевдогипопаратиреоза, и все они обусловлены внутренними нарушениями передачи сигнала ПТГ.

а. При псевдогипопаратиреозе типа Ia снижен синтез или нарушена активность субъединицы Gsальфа; наблюдается резистентность не только к ПТГ, но и ко многим другим гормонам (в частности, к ТТГ, глюкагону, гонадотропным гормонам). Описаны двое больных из одной семьи, у которых имелась точечная мутация в одном из аллелей, кодирующих Gsальфа.

б. При псевдогипопаратиреозе типа Ib сохраняется нормальная активность Gsальфа; резистентность к другим гормонам отсутствует. Возможная причина: дефект рецептора ПТГ.

в. При псевдогипопаратиреозе типа Ic активность Gsальфа не нарушена, но наблюдается резистентность к другим гормонам. Возможная причина: нарушение внутриклеточной передачи сигнала ПТГ на пострецепторном уровне.

Для псевдогипопаратиреоза типов Ia и Ic характерен комплекс симптомов, который принято называть наследственной остеодистрофией Олбрайта (лунообразное лицо, задержка роста, ожирение, брахидактилия, множественные очаги подкожного обызвествления или оссификации).

З. Ангиотензин II

1. Общие сведения. Ангиотензин II оказывает мощное сосудосуживающее действие; его рецепторы присутствуют в головном мозге, почках и гладких мышцах сосудов. В передаче сигнала ангиотензина II участвуют G­ белки и фосфоинозитидная система. В гладких мышцах сосудов преобладают рецепторы ангиотензина II типа 1. Ген

10