биохимия краткий курс часть 2

Поскольку ДНК в клетке находится в суперспирализованном состоянии, а матрицей служат одиночные цепи, то сначала необходимо подготовить матрицу. Это делают ферменты топоизомераза и хеликаза. Топоизомераза раскручивает суперспираль, освобождает ее от белков и превращает в дуплекс. Хеликаза превращает дуплекс в одиночные цепи. В синтезе дочерней цепи участвует ДНК-полимераза, но она может лишь удлинять уже существующие цепи. Поэтому сначала при участии праймазы образуется «затравка» или праймер, представляющий небольшой фрагмент РНК, к которому ДНК-полимераза по принципу комплементарности начинает пришивать дезоксиНМФ, строя дочернюю цепь. Синтез дочерней цепи начинается с 5`конца. При этом одна дочерняя цепь синтезируется непрерывно (она называется лидирующей), а другая (отстающая) в виде фрагментов, которые затем сшивает ДНК-лигаза.

Регуляция репликации и клеточного цикла.

Циклины и циклинзависимые протеинкиназы. Существует связь репликации с клеточным циклом. Биосинтез ДНК происходит в синтетическую фазу клеточного цикла. Клеточный цикл регулируется: в конце фазы G1 есть точка рестрикции (задержки), в которой накапливаются циклины, снимается ингибирование и наступает переход фазы G1 в фазу S, т.е. начинается цикл. В конце S-фазы клетка получает сигнал для перехода в фазу G2. В конце фазы G2 есть точка, в которой запускается митоз.

Продукты протоонкогенов и антионкогенов. Протоонкогены – это гены, способствующие пролиферации и тормозящие дифференцировку; антионкогены – это гены, способствующие дифференцировке и тормозящие пролиферацию. Соотношение экспрессии этих генов определяет одну из двух главных клеточных программ.

ФРК с рецепторами, ретиноат (ретиноевая кислота) и кальцитриол. Ретиноат снижает процессы пролиферации и увеличивает дифференцировку. Большинство ФРК через свои рецепторы активируют процессы пролиферации и снижают дифференцировку. Кальцитриол увеличивает дифференцировку и снижает пролиферацию

гемопоэтических клеток и клеток некоторых опухолей.

Под воздействием различных факторов могут происходить изменения в генетической информации, при этом нарушаются нуклеотидные последовательности в ДНК – возникают мутации. Факторы, вызывающие мутации, называют мутагенами. Некоторые из них могут способствовать канцерогенезу. Они могут быть физическими (излучения, высокая температура), химическими (прооксиданты, алкиляторы) и биологическими (вирусы, бактерии, глисты). Замена одного нуклеотида другим может привести к синтезу белка, в котором одна аминокислота заменена другой. В большинстве случаев нарушение генетической информации приводит к протеинопатиям, при которых нарушен синтез специфических белков (при серповидноклеточной анемии синтезируется дефектный гемоглобин S, в результате чего эритроциты приобретают измененную форму, что приводит к нарушению транспорта кислорода). Если эти белки обладают ферментативной активностью, то такие протеинопатии называют энзимопатиями.

Процесс, позволяющий живым организмам восстанавливать повреждения, возникающие в ДНК, называют репарацией. Все репарационные механизмы основаны на том, что ДНК – двухцепочечная молекула, т.е. в клетке есть две копии генетической информации. Если нуклеотидная последовательность одной из двух цепей оказывается

11

поврежденной, информацию можно восстановить, так как вторая (комплементарная) цепь сохранена. Повреждения, затрагивающие обе цепи ДНК, при которых нарушается структура нуклеотидов комплементарной пары, не репарируются. При возникновении ошибки из цепи ДНК вырезается поврежденный участок, на его месте образуется брешь, на месте которой ДНК-полимераза достраивает цепь ДНК, а ДНК-лигаза «пришивает» синтезированный фрагмент к цепи ДНК. Репарация необходима для сохранения генетического материала на протяжении всей жизни. Нарушение репарационных систем могут быть причиной многих наследственных болезней, например, пигментной ксеродермы, при которой появляется сверхчувствительность к ультрафиолету и в 1500 раз возрастает риск рака кожи.

1.3. ТРАНСКРИПЦИЯ

Транскрипцией называют синтез всех видов РНК (матричной, рибосомальной, транспортной и малых РНК) по матрице ДНК. При этом матрицей является не вся цепь ДНК, а лишь небольшой ее участок, соответствующий гену. Субстратами для синтеза цепи РНК выступают НТФ. Синтез РНК, как и синтез ДНК, протекает с затратами энергии, необходимая для синтеза энергия освобождается при гидролизе НТФ, содержащих макроэргические связи. Катализирует транскрипцию РНК-полимераза. Особенностью данного фермента является то, что он предварительно «узнает» тот участок ДНК, который соответствует определенному гену. Участки ДНК, с которыми связывается РНК-полимераза для того, чтобы начался процесс транскрипции, называются промоторами. Фермент вместе с растущей цепью РНК постепенно перемещается вдоль участка молекулы ДНК, пока не будет распознан терминирующий участок – последовательность нуклеотидов, сигнализирующая об окончании информации относительно транскрибируемого гена.

Считывание информации в процессе синтеза РНК всегда происходит только с одной цепи ДНК, другая цепь остается нетранскрибируемой (рис. 6). Следует отметить, что основанием, комплементарным аденину, в цепи РНК будет урацил, а не тимин, как при репликации ДНК.

ДНК	– Т–	А–	Т –	С – С – А–			G–	Нетранскрибируемая цепь
	●	●	●	●	●	●	●
	– А– Т –А –G –G					–Т –С–
РНК	– U–	А – U –		С –	С – А –		G

Рис.6. Комплементарность при транскрипции

Продуктом транскрипции являются различные виды про-РНК. Дело в том, что ген внутри неоднороден, он состоит из экзонов, несущих генетическую информацию, и интронов, которые не несут информацию, и разделяют экзоны. Во время транскрипции переписываются как экзоны, так и интроны. Синтезированная молекула про-РНК подвергается затем посттранскрипционной «доработке» – процессингу (рис. 7). При этом происходит удаление нуклеотидных последовательностей, соответствующих интронам (сплайсинг, катализируемый рибозимами – катализаторами РНКовой природы), а также

12

синтез характерных для большинства РНК концевых последовательностей и метилирование некоторых оснований.

Регуляция транскрипции включает несколько механизмов.

Метилирование генов приводит к тому, что ген не подвергается прочитыванию, и его экспрессия тормозится.

Изменение структуры хроматина (гистоновый механизм). Пока ДНК находится в комплексе с белками, информация не реализуется. Для реализации информации, содержащейся в ДНК, необходимо удалить гистоновые белки. Это осуществляется, при участии ферментов протеинкиназ. В настоящее время считается, что наиболее частый случай – не фосфорилирование, а ацетилирование гистоновых белков.

Рис. 7. Сплайсинг РНК

Основной механизм регуляции транскрипции –это взаимодействие белковых транскрипционных факторов с регуляторными участками ДНК, другими транскрипционными факторами и белками. Перед каждым геном находится промотор, состоящий из двух участков. Один из участков промотора определяет место начала транскрипции, второй – её частоту. К регуляторным элементам относятся энхансеры (регуляторные участки ДНК, увеличивающие экспрессию гена), сайленсеры (регуляторные участки ДНК, которые снижают экспрессию) и регуляторные участки ДНК, реагирующие на гормоны, белки клеточного (теплового) шока, металлы, ксенобиотики, а также участки определения тканевой специфичности. Взаимодействие транскрипционных факторов с энхансерами, изменяет конформацию ДНК (происходит образование петли). При этом все транскрипционные факторы и гормон-рецепторные комплексы оказываются связанными с белковым комплексом, («коактиватор»). Он приходит в активное состояние и активирует базальный транскрипционный комплекс. В состав базального транскрипционного комплекса

13

входит фермент РНК-полимераза, который при активации взаимодействует с промотором и далее идёт процесс транскрипции: образование про-РНК на матрице ДНК.

Возможно ингибирование малыми РНК, также в регуляции транскрипции участвуют гормоны и СТС.

Ранние и поздние ответы обусловлены временем появления белка (ранние ответы – белок обнаруживается в клетке не позднее, чем через 30 минут). Транскрипционные факторы входят в ядро и воздействуют на регуляторный участок "раннего" гена. В результате "ранний" ген экспрессируется: происходит транскрипция и образуется мРНК; зрелая мРНК выходит из ядра в цитоплазму, на рибосомах синтезируется белок, который является транскрипционным фактором для ряда "поздних" генов. Этот белок заходит в ядро и воздействует на регуляторные участки "поздних" генов. "Поздние" гены экспрессируются: на них образуются про-мРНК, затем в результате сплайсинга образуются мРНК, которые выходят в цитоплазму; с мРНК на рибосомах будут синтезироваться белки. Возникают поздние ответы.

1.4. БИОСИНТЕЗ БЕЛКА

Включает в себя 5 этапов:

1.Рекогниция (узнавание) и активация аминокислот

2.Инициация

3.Элонгация

4.Терминация

5.Фолдинг и посттрансляционная модификация 2, 3 и 4 этапы называют трансляцией. Во время трансляции происходит перевод

последовательности нуклеотидов мРНК в последовательность аминокислот синтезируемой полипептидной цепи. В основе такой передачи информации лежит биологический (генетический) код – способ шифровки последовательности аминокислот в ППЦ в виде последовательности нуклеотидов. Код триплетен (одну аминокислоту кодирует триплет нуклеотидов – кодон), код вырожден (т.е. одну аминокислоту могут кодировать несколько триплетов), код непрерывный (триплеты следуют друг за другом непрерывно, между ними нет «запятых», то есть триплетов, разделяющих соседние кодоны); код неперекрывающийся и универсальный (он характерен для всех организмов – от простейших до человека).

Важная роль в процессе трансляции принадлежит тРНК (рис.8.), в молекулах которых имеются центры связывания как с определенным кодоном мРНК (антикодоны), так и с аминокислотой, шифруемой этим кодоном. Для каждой аминокислоты имеется своя тРНК. Все тРНК имеют конформацию клеверного листа, получающуюся сочетанием спирализованных и неспирализованных участков молекулы. 3`конец тРНК является центром связывания аминокислот.

Активация и узнавание аминокислот сводится к образованию аминоацил-тРНК (аатРНК), она сопряжена с гидролизом АТФ до АМФ. Реакцию катализируют аминоацил-тРНК- синтетазы. Для каждой из 20 аминокислот имеется свой фермент. Одна из петель тРНК необходима для связывания тРНК с ферментом активации аминокислот.

Биосинтез белка осуществляется на рибосомах. До трансляции рибосомы находятся в виде большой и малой субъединиц. На этапе инициации происходит образование

14

функционально активной рибосомы. При этом соединяются большая и малая субъединицы, мРНК, для этого необходима энергия ГТФ и белковые факторы инициации. В образовавшейся рибосоме выделяют А-центр (аминоацильный) и П-центр (пептидильный). На этапе инициации в П-центр приносится метионил-тРНК. Синтез белка начинается с метионина и от N-конца к С-концу. Концевой метионин часто отщепляется еще в процессе элонгации.

На этапе элонгации в А-центр рибосомы при участии ГТФ приносится аа-тРНК, антикодон которой комплементарен кодону мРНК, стоящему в А-центре. Затем аминокислота из П-центра (сначала это метионин) переносится на аминокислоту, стоящую в А-центре, и присоединяется к ней пептидной связью. В последствии из П-центра а А-центр будет переноситься пептид. Реакцию катализирует большая субчастица рибосомы. После транслокации – перемещения рибосомы относительно мРНК на один кодон – тРНК из П- центра освобождается, а пептид, связанный с тРНК, оказывается в П-центре. Для транслокации требуется энергия ГТФ. Описанная последовательность событий элонгации повторяется: к следующему кодону мРНК присоединяется новая аа-тРНК, антикодон которой будет комплементарен кодону мРНК, стоящему в А-центре и т.д.

Рис. 8. Строение тРНК

Завершающий этап трансляции – терминация – наступает тогда, когда в А-центре окажется один из терминирующих кодонов. При этом происходит гидролиз сложноэфирной связи между полипептидом и последней тРНК.

После трансляции происходит фолдинг с участием шаперонов и пострансляционная модификация. Она включает ограниченный протеолиз (например, превращение проферментов в ферменты), различные варианты химической модификации: фосфорилирование, гидроксилирование и др.

15

1.5. МЕДИЦИНСКИЕ АСПЕКТЫ МАТРИЧНЫХ СИНТЕЗОВ

Индукция – это увеличение синтеза мРНК и белка, репрессия – снижение синтеза мРНК и белка под влиянием какого-либо фактора. Основные формы индукции: субстратная, гормональная, лекарственная, окислительно-восстановительная и при клеточном шоке. Основные формы репрессии: катаболитная, гормональная, лекарственная и окислительновосстановительная.

Регуляция биосинтеза белка у прокариот осуществляется в соответствии с моделью оперона на уровне транскрипции. У эукариот регуляция происходит на всех 7 этапах: 5 этапов реализации наследственной информации: репликация, транскрипция, процессинг проРНК, трансляция, фолдинг, посттрансляционная модификация белка и 2 этапа катаболизма: распад мРНК до нуклеотидов и распад белка до аминокислот.

Существует большая группа веществ, ингибирующих синтез ДНК, РНК и белков. Некоторые из них нашли применение в медицине для лечения инфекционных болезней и опухолей, некоторые для человека оказались токсинами. Противоопухолевые антибиотики нарушают структуру ДНК, ингибируя репликацию и (или) транскрипцию, в результате чего прекращается деление клеток. Лекарственные средства этой группы не обладают абсолютной избирательностью по отношению к раковым клеткам, поэтому являются довольно токсичными для быстроделящихся нормальных клеток (клетки кроветворной системы, слизистой тонкого кишечника, волосяные фолликулы).

Препараты, ингибирующие синтез РНК и белка, обладают противобактериальным действием. Сюда относят широко применяемые в клинике антибиотики. Например, рифампицин ингибирует РНК-полимеразу, применяется для лечения туберкулеза. Этот препарат не влияет на РНК-полимеразу эукариотических клеток. Ингибиторами трансляции являются: тетрациклин (нарушает элонгацию), эритромицин, стрептомицин (нарушают инициацию).

В развитии патологии играют роль наследственность и среда. Все болезни условно можно разделить на 3 группы:

наследственные болезни, в развитии которых на 100% "виновны" гены – например, фенилкетонурия, гемофилия;

"чисто" экологические болезни, в развитии которых на 100% "виновны" факторы внешней среды (ожоги, электротравмы, отравления);

мультифакторные (экогенетические) болезни (их большинство), в которых "повинны" и гены, и факторы внешней среды.

При мультифакторных болезнях существует наследственная предрасположенность, реализуемая при внешних воздействиях. К мультифакторным (экогенетическим) болезням относят атеросклероз, сахарный диабет, язвенную и гипертоническую болезни и другие.

К основным типам наследственной патологии относятся:

грубые дефекты (уродства);

наследственные болезни;

сниженная устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям.

Наиболее редко встречаются грубые дефекты, чаще наследственные болезни и

наиболее часто происходит снижение устойчивости к неблагоприятным воздействиям, в частности к вирусам.

16

Вирусы вызывают инфекционные заболевания (грипп, гепатит, СПИД) и участвуют в злокачественной трансформации клеток. Вирусы – это не организмы, а инертный комплекс молекул: У вирусов нет клеточной организации, всех субклеточных частиц, метаболизма, энергетики – это «контейнеры» с нуклеиновой кислотой; Они неспособны к самостоятельной репликации. У вирусов только одна нуклеиновая кислота – ДНК (вирусы оспы, герпеса, вирусного гепатита В, аденовирусы) или РНК (вирусы кори, краснухи, бешенства, ВИЧ, стоматита, полиомиелита, ящура, гепатита А).

Проникновение вирусов в клетку происходит путём связывания с рецепторами плазматической мембраны и эндоцитоза.

Молекулярные механизмы действия вирусов зависят от типа вируса. Ретровирусы размножаются в клетке путем обратной транскрипции. Вирусный геном (провирус) в форме дуплекса ДНК встраивается в хромосому клетки хозяина с помощью интегразы. В результате двуцепочечная ДНК вируса представляет собой дополнительный набор генов клетки, который реплицируется вместе с ДНК хозяина при делении. Для образования новых ретровирусных частиц провирусные гены транскрибируются. Одни из них становятся геномом нового потомства ретровирусов, а другие используются для трансляции белков, необходимых для сборки вирусных частиц.

Последствия заражения вирусом – инфекционные болезни (острые – грипп, хронические – герпес, медленные – СПИД). В других случаях, происходит нарушение специфических функций клеток (при полиомиелите – нейронов). Возможен канцерогенез – превращение нормальной клетки в злокачественную.

Вирус включает клеточный онкоген и переносит его в другие клетки – действует как «вор и диверсант». Клеточный ген называется протоонкогеном, он кодирует белки, участвующие в важных регуляторных клеточных механизмах. Онкогенная вирусная форма такого регуляторного гена могла возникнуть в ходе мутации нормального клеточного двойника. При повторном встраивании этого гена в хромосому (при ретровирусной инфекции) присутствие онкогена приведет к синтезу аномального регуляторного белка, или к синтезу чрезмерного количества белка с последующим нарушением клеточной регуляции.

Особое внимание заслуживает вирус иммунодефицита человека в связи с широким распространением и высокой летальностью при синдроме приобретённого иммунодефицита. ВИЧ в диаметре имеет размер около 100 нм. На периферии ВИЧ содержатся поверхностные гликопротеины, соединённые с липидной мембраной. Центральная часть ВИЧ состоит из РНК и как минимум трёх ферментов: обратная транскриптаза, интеграза и протеаза.

ВИЧ поверхностными гликопротеинами присоединяется к CD4 и хемокиновым рецепторам Т-хелперов и макрофагов. Путем эндоцитоза ВИЧ попадает в клетку. Обратная транскриптаза ВИЧ на вирусной РНК синтезирует комплементарную ДНК (кДНК), интегрируемую в геном клетки. В результате синтезируются структурные и регуляторные вирусные белки, которые стимулируют транскрипцию и трансляцию вирусной мРНК. Вирусные частицы покидают лимфоцит с частью мембраны лимфоцита, образующей липидную оболочку вируса. Размножение вируса в клетке приводит к тому, что, в конечном счете, она погибает. Через 7–10 лет, когда количество Т-лимфоцитов уменьшается в 4–5 раз, появляются явные и тяжёлые симптомы недостаточности иммунной системы – вирусные, грибковые и бактериальные инфекции. Диагностика ВИЧ проводится с помощью ПЦР или иммуноферментного анализа. Лечение ВИЧ инфекции: ингибиторы обратной транскриптазы,

17

ингибиторы входа ВИЧ в клетку, ингибиторы протеазы. Лечение только приостанавливает болезнь. Вакцины от ВИЧ пока нет, поэтому важна профилактика.

Для лечения вирусных инфекций не применяют антибиотики. Существуют специальные противовирусные лекарства, например интерфероны. Это небольшие белки-гликопротеины, которые секретируются некоторыми клетками позвоночных в ответ на заражение вирусом и препятствуют распространению вирусной инфекции. У человека В-лимфоцитами и макрофагами синтезируются -интерфероны, фибробластами -интерфероны, Т- лимфоцитами -интерферон. Связываясь с рецепторами на плазматической мембране зараженных клеток, эти белки стимулируют синтез ферментов, способных разрушать мРНК вирусов и прекращать синтез белков на рибосомах. Кроме того, интерфероны способствуют активации рибонуклеазы, разрушающей мРНК и рРНК клетки, способствуют инактивации ИФ2 (фактор инициации). В результате синтез всех белков в инфицированных клетках прекращается, они погибают вместе с вирусами. Таким образом, организм жертвует частью клеток для выздоровления. Интерфероны получают промышленным путем с использованием техники клонирования генов и применяют для лечения гриппа, ОРВИ, полиомиелита, герпеса, гепатита и некоторых видов опухолей.

В настоящее время широкое распространение получили прионовые инфекции. Прионы – это белковые молекулы, кодируемые генами и существующие в клетках, где могут выполнять физиологические функции, например, в мозге они обеспечивают устойчивость к апоптозу и стимулируют рост нейритов (аксонов). Однако при наличии доминантных мутаций, иногда в старости и при заражении (передаче конформации между молекулами одного белка) прионы, сохраняя свою первичную структуру, способны перейти

внерастворимые фибриллы и затем – в амилоидные агрегаты. Для них характерны:

большое количество βструктур, высокая устойчивость к денатурации (при нагревании, облучении, действии ультразвука или химических веществ) и пептидазам (в том числе и пищеварительным);

инфекционность.

Инфекционные прионы вызывают болезни у человека (куру, иногда болезнь Крейцфельдта-Якоба), коров («коровье бешенство») и овец (скрепи или почесуха). При этих патологических процессах воспаления и иммунных реакций нет, т.к. прионы являются собственными белками организма, но медленно развиваются губчатая энцефалопатия, неврологические нарушения (нарушения речи, зрения, памяти), деменция и смерть. Очень опасными являются распространение инфекции у коров («коровье бешенство», особенно в Великобритании и некоторых странах Западной Европы), вероятность заражения людей и отсутствие лечения. Доказана связь между прионовыми болезнями животных и болезнью Крейцфельдта-Якоба у людей. Прионовые болезни могут передаваться алиментарным путем и парентерально.

Нарушение матричных синтезов лежит в основе канцерогенеза. Под действием мутаций, амплификации, вирусов или транспозиций протоонкогены превращаются в онкогены (это гены, способствующие пролиферации клеток и тормозящие дифференцировку). Самые известные онкогены: Ras, гены теломеразы, гены тирозинкиназ, других протеинкиназ.

Клетка становится злокачественной, если в ней, кроме того, произошла инактивация антионкогена (например, гена р53). Антионкогены с помощью белков (р53) тормозят деление клеток, и способствуют их дифференцировке. Белок р53 появляется в клетке при

18

повреждении ДНК и останавливает клеточный цикл перед митозом, не разрешая передать испорченный геном дочерним клеткам. Ген р53 включает программу апоптоза.

В процессе злокачественной трансформации происходит активация генов метастазирования и подавление генов, ингибирующих метастазирование. Метастазы возникают из клеток, которые отрываются от опухоли, попадают в кровь, лимфу, а потом и в другие органы, где дают начало новым опухолям. Эта стадия называется прогрессия опухоли.

Механизм транслокации генов между хромосомами, соединение хромосом приводит к появлению новых генов, которых нет в норме, что также способствует канцерогенезу. Например, филадельфийская хромосома при остром лейкозе – это остаток 22-ой хромосомы после транслокации в 9-ю хромосому в лимфоцитах.

Злокачественная трансформация клетки человека происходит при сочетании:

активации теломеразы;

инактивации антионкогена (например, р53)

активации онкогена ras или других онкогенов.

Продукты экспрессии онкогенов – онкобелки (тирозинкиназы, транскрипционные факторы, особенно ранних генов, ФРК и др.). Это белки сигнал-трансдукторных систем клетки. Поэтому современная терапия опухолей называется сигнал-трансдукторная терапия. При лечении необходимо подавить экспрессию онкогена или вызвать образование белка антионкогеном. Для такой терапии используют блокаторы рецепторов, ингибиторы тирозинкиназ, белка Ras и др.

1.6. МОЛЕКУЛЯРНАЯ МЕДИЦИНА И ФАРМАЦИЯ

Молекулярная медицина использует методы генетической инженерии.

1.Секвенирование генома– определение последовательности нуклеотидов при расшифровке геномов. Вначале ДНК разрезают на фрагменты бактериальными рестриктазами, затем происходит гибридизация с помощью ДНК-микрочипов. ДНКмикрочипы – это пластина, на которой помещены микроячейки. Каждая микроячейка содержит искусственно синтезированный олигонуклеотид, соответствующий фрагменту определенного гена. На поверхности ячеек происходит комплементарное взаимодействие матрицы и исследуемой пробы ДНК.

2.ПЦР используется в диагностике инфекционных и онкологических заболеваний. Метод позволяет в несколько раз сократить время постановки диагноза, идентифицировать вирусы, раковые клетки, обнаружить которые в обычной практике невозможно (диагностика по 1–2 клеткам, одному волосу, геномная дактилоскопия и т.д.). Метод ПЦР дает возможность избирательно синтезировать in vitro небольшие участки ДНК и за 3–4 часа получить миллионы копий. Объектами для выделения ДНК могут быть кровь, биоптат ткани, слюна, моча, околоплодные воды, лейкоциты, корни волос, соскоб ротовой слизистой, сперма.

3.Трансгеноз – перенос генов в другие клетки и организмы. Теоретически подходят многие клетки: фибробласты, лимфоциты, гепатоциты, эндотелиальные, мышечные, стволовые клетки костного мозга. Запрещены для “пересадки генов” половые клетки (семенники и яичники).

19

Для развития медицины важно установить патогенез наследственных и мультифакторных заболеваний. «Нокаут генов» – направленное разрушение определенного участка с помощью вектора. Вектор – это ДНК, способная встраиваться в геном. Создано множество линий мышей с «нокаутированными» генами, которые используются в качестве моделей для изучения различных заболеваний. Например, на мышах создана модель болезни Альцхаймера и установлено, что в гене белка-предшественника амилоида существует мутация – аминокислота валин замещена на аминокислоту фенилаланин.

Генотерапия возможна путём in vivo– это инъекция «терапевтического гена» непосредственно в ткани пациента с использованием вирусов, липосом, полимерных микросфер.

Для генотерапи ex vivo необходимо:

получение клеток от больного,

перенос нужного гена для исправления дефектного,

отбор и наращивание клеток,

инфузия или трансплантация клеток пациенту.

ДНК-вакцины–это не чужеродный белок, поэтому при их введении меньше нагрузка на иммунитет, меньше осложнений и опасности стать носителем каких-либо вирусов. Такие вакцины легче готовить, хранить, транспортировать (ДНК стабильнее белка). Кроме того, возможна модификация уже готовых вакцин, можно получить одну вакцину от нескольких заболеваний.

Основной постулат молекулярной медицины: – “Для каждой болезни есть молекулярная мишень и её можно использовать для диагностики и/или лечения, т.е. для лекарственного воздействия”. В настоящее время главными лекарственными мишенями являются рецепторы (45%), затем идут ферменты (28%) и гормоны (11%).Традиционный способ получения лекарств – это скрининг биологической активности природных соединений, или химическая модификация уже известных. Новые методы разработки лекарств появились с возможностью манипулирования молекулами ДНК и с расшифровкой генома человека. Уже с начала 80х годов получают рекомбинантные лекарственные препараты с помощью биотехнологических методов. Получены рекомбинантные соматотропин, инсулин, соматостатин, цитокины. Рекомбинантные ИФ и интерлейкин2 применяются при лечении рака почки и злокачественной меланомы, заболеваний, практически не поддающихся традиционной противоопухолевой терапии. Рекомбинантные гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин назначают после применения цитостатиков.

Для получения рекомбинантных лекарств используются некоторые микроорганизмы, например E. coli. Получение инсулина включает несколько этапов. Выделение гена (химикоферментный синтез гена проинсулина + регуляторный участок), встраивание гена в плазмиду. Для этого из неё удаляют часть ДНК рестриктазами, смешивают ген и плазмиду и с помощью ДНК-лигаз создают рекомбинантную кольцевую плазмиду. Такая плазмида является вектором (проводником) гена в клетку, ею инфицируют E. coli. Трансформированная кишечная палочка имеет ген проинсулина человека. Создаются условия для экспрессии этого гена, затем выделяют, очищают синтезированный белок и получают генно-инженерный инсулин человека.

Более безопасным методом получения лекарств белково-пептидной природы является использование трансгенных животных в качестве биореакторов. Например, трансгенные

20