MaltsevSciD

единицы	10								I1
									I2
									I3
									I4
.									I5
, отн	1
									I6
рассеяния	0.1
Интенсивность	0.01
							I3
	1E-3
	10	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60
				Угол рассеяния, градусы

Рис. 2.12. Индикатрисы вытянутого эллипсоида, моделирующие эксперимент на поляризационном сканирующем проточном цитометре.

51

Рис. 2.13. Электронная система сканирующего проточного цитометра.

52

Приведенные результаты показывают, что индикатрисы, измеряемые на ПСПЦ, различаются при разных условиях прохождения падающего и рассеянного излучения через поляризационные элементы. Это различие может служить мерой несферичности частицы, так как для сферической частицы индикатрисы I1, I4, I5 совпадают и равны S11. К настоящему времени даже персональные компьютеры с наибольшими вычислительными возможностями не позволяют проводить полный анализ влияния характеристик несферических частиц на индикатрисы светорассеяния. Проведенный в данном разделе анализ возможностей поляризационного сканирующего проточного цитометра открывает дорогу к практическому созданию такого цитометра и экспериментальной проверке его работоспособности.

2.6.Электронная система сканирующего проточного цитометра

Вэтом разделе мы рассмотрим один из вариантов электронных систем сканирующего проточного цитометра. Такая система представлена на Рис. 2.13. Сигналы измеряются с помощью фотоэлектронного умножителя Hamamatsu Photo Sensor II5702-01. Предусилитель с шириной полосы пропускания 200 кГц помещен внутрь ФЭУ. Далее сигнал усиливается и фильтруется с помощью низкочастотного фильтра (фильтр Чебышева 4-ого порядка с затуханием 3 дВ на частоте 70 кГц). Сигнал отцифровывается с помощью аналого-цифрового преобразователя, включенного в контроллер PC+. Сбор данных синхронизируется внутренним счетчиком контроллера PC+. Начало измерения может инициироваться или триггерным импульсом, или программно. Данные отцифровываются с частотой 140 кГц. Другой ФЭУ (Hamamatsu Photo Sensor Module H5702-01) используется для измерения импульса светорассеяния в триггерном канале СПЦ. Импульсы усиливаются, фильтруются и затем смешиваются с сигналом ФЭУ, измеряющего светорассеяние. Так как точность измерения индикатрисы зависит от точности определения положения частицы внутри зоны регистрации, момент пересечения частицей триггерного луча определеяется с точностью до нескольких сотен наносекунд. Типичный сигнал сканирующего проточного цитометра обратной конфигурации показан на Рис. 2.13.

53

Для точного управления запуском азотного лазера было изготовлено специальное устройство, которое аналогово синхронизировалось с максимумом триггерного сигнала. Точность синхронизации была лучьше 1 мкс. Устройство состоит из двух частей. Первая часть измеряет амплитуду триггерного сигнала, и обеспечивает проходные ворота запускающему импульсу с помощью порогового устройства. (trigger level comparator на Рис. 2.13). Вторая часть измеряет производную триггерного сигнала. Когда частица входит в лазерный луч, сигнал нарастает, а затем уменьшается, достигая нулевого значения в момент максимума входного сигнала. В это время и компаратор и выдает запускающий импульс для азотного лазера. С помощью котроллера устанавливается время задержки между этим импульсом и импульсом, который непосредственно запускает азотный лазер. Величина задержки зависит от расстояния между триггерным лучом и точкой фокусировки азотного лазера. Точность выставления задержки – 1 мкс. При измерении флуоресценции один триггерный луч перекрывается. При этом излучение азотного лазера предварительно фокусируется в точку этого триггерного луча. При этом задействованы два канала аналого-цифрового преобразователя и типичный сигнал показан на Рис. 2.15.

2.7. Программное обеспечение сканирующего проточного цитометра

54

	.единицы	0.5
		0.0
				Сигнал рассеяния
	, отн	-0.5
	сигнала	-1.0				Триггерные
						импульсы
		-1.5
	Амплитуда
		-2.0
		-2.5
		200	250	300	350	400	450	500
				Время, отн. единицы
	Рис. 2.14. Типичный сигнал сканирующего проточного цитометра
	обратной конфигурации.

55

Интенсивность, отн. единицы

3
					Канал светорассеяния
2					Канал флуоресценции
1
					Триггерный
0	Пролетная				импульс
	Индикатриса
-1	Светорассеяния				Импульс
					флуоресценции
-2
-3	100	150	200	250	300	350	400	450	500
50

Время, отн. единицы

Рис. 2.15. Измерение флуоресценции с использованием импульсного лазера на сканирующем проточном цитометре обратной конфигурации.

56

Рис. 2.16. Блок-схема управления и обработки данных сканирующего проточного цитометра.

57

Рис. 2.17. Схема обработки индикатрисы, выполненная в среде графического программирования LabView. Запрограммирован алгоритм поиска максимумов и минимумов индикатрисы, вычисления параметров индикатрисы, определение размера и показателя преломления анализируемой частицы.

Все программное обеспечение СПЦ написано в среде National Instruments Inc.'s LabView 4.0 графического программирования. Исполнительная программа LabView 4.0 работает на IBM совместимом персональном компьютере в операционной системе Windows 95.

Среда графического программирования LabView обладает уникальными возможностями для управления экспериментом и обработки результатов измерений. Гибкая структура и универсальность программ, написанных в LabView, позволяет быстро адаптировать программное обеспечение для проведения любого эксперимента. На Рис. 2.16 приведена блок-схема сканирующего проточного цитометра. Каждый элемент блок-схемы выполняет определенную функцию, связанную с сбором данных АЦП или обработкой измеренных индикатрисс. Например, элемент “ADC init” инициализирует АЦП, получение данных производится во время работы элемента “Get Data”, работа элемента “Trig” связана с обработкой триггерного сигнала, размер и показатель преломления частицы вычисляется при работе элемента “Size Refr. I” и т.д. Каждый элемент представляет из себя определенную подпрограмму, которая выполняется в установленной последовательности, задаваемой в головной программе. Для примера на Рис. 2.17 приведена принципиальная схема “Size Refr. I”. В этой схеме заключен оригинальный алгоритм поиска максимумов и минимумов индикатрисы, основанный на анализе формирования индикатрисы при изменении размера и показателя преломления частицы.

2.8. Выводы к Главе 2.

Данный этап создания инструментальных основ сканирующей проточной цитометрии характеризуются следующим: 1) разработан сканирующий проточный цитометр в двух конфигурациях; 2) определены основные технические характеристики оптической и электронной систем сканирующего проточного цитометра; 3) экспериментально проверена возможность сканирующего проточного цитометра измерять индикатрисы одиночных частиц.

Определено дальнейшее развитие сканирующей проточной цитометрии в свете использования светорассеяния при анализе одиночных частиц, а именно,

предложена схема поляризационного сканирующего проточного цитометра. Промоделировано измерение шести комбинаций элементов матрицы рассеяния несферической частицы на поляризационном сканирующем проточном цитометре.

Продемонстрирована высокая эффективность использования оптической системы сканирующего проточного цитометра для измерения «задержанной» флуоресценции.

Уникальные возможности сканирующей проточной цитометрии измерять светорассеивающие свойства и флуоресценцию одиночных частиц со скоростью до 500 частиц в сек. накладывают жесткие требования к времени обработки результатов измерений. Как правило проточный цитометр комплектуется сортером, который сортирует анализируемые частицы по результатам измерений в различные приемные устройства. Очевидно, что использовать систему сортировки возможно только при наличии эффективных алгоритмов обработки результатов измерений. Решению данной проблемы посвящена следующая глава.

1. Разработан сканирующий проточный цитометр в двух конфигурациях;

2.Определены основные технические характеристики оптической и электронной систем сканирующего проточного цитометра;

3.Экспериментально проверена возможность сканирующего проточного цитометра измерять индикатрисы одиночных частиц.

4.Предложена схема поляризационного сканирующего проточного цитометра – проточного цитометра следующего поколения.

5.Продемонстрирована высокая эффективность использования оптической системы сканирующего проточного цитометра для измерения «задержанной» флуоресценции.

60