Методичка БФХ / 3 часть

Ферментативная кинетика и катализ

Ферменты..

Кинетическое описание ферментативных процессов.

Процессы, протекающие в присутствии биологических катализаторов – ферментов, - имеют исключительно важное значение в современной биотехнологии. Это объясняется не только широким применением ферментов, но и тем, что процессы в живой природе протекают почти исключительно ферментативным путём. Таким образом, количественное изучение и кинетическое описание ферментативных реакций создают научные основы процессов инженерной энзимологии, а для микробиологических производств дают возможность обосновать выбор оптимального режима биосинтеза и открывают принципиальные пути регулирования и управления жизнедеятельностью микроорганизмов.

где, E – фермент; S – субстрат; ES – промежуточный фермент-субстратный комплекс; P – продукт; k₁; k_-1; k₂ – константы скорости элементарных реакции в уравнении.

Постулаты (ограничения)

1. Образуется фермент-субстратный комплекс

2. Самая медленная стадия – реакция катализа

k₂ << k₁; k₂<< k_-1

3. Комплекс EP не образуется, вторая стадия не обратима (реакция идёт при очень большом избытке субстрата)

[S] >> [E]; [S] >> [P]

4. С каждым активным центром фермента связывается одна молекула субстрата

5. При анализе кинетических характеристик ферментных реакций можно пользоваться концентрациями, а не активностями вследствие разбавленности раствора.

Дифференциальная форма Михаэлиса-Ментен

Наиболее простое допущение, принимаемое при выводе уравнения по схеме (1), заключается в предположении, что фермент-субстратный комплекс, всё время находится в равновесии с исходными веществами, то есть что равновесие на первой стадии устанавливается очень быстро и не нарушается частичным превращением комплекса ES в продукт с высвобождением фермента в форме, свободной от субстрата. В этом случае константу равновесия первой стадии принято обозначать через K_S, относя её, однако, не к образованию, а к распаду фермент-субстратного комплекса. Очевидно, константа нестойкости комплекса ES:

(2)

связана с константами схемы (1) равенством

(3)

k₂ << k₁, k_-1

Скорость ферментативного превращения субстрата равна скорости образования продукта, то есть скорости второй стадии, если концентрация субстрата много больше концентрации фермента. что обычно наблюдается на практике. Тогда при [S] >> [E₀]:

(4),

где, E₀ обозначена концентрация фермента в начальный момент времени в начальный момент времени превращения.

[S₀] ≈ [S] Изменение концентрации S можно пренебречь, концентрация ES будет лимитироваться концентрацией E.

В ходе реакции, если нет посторонних эффектов, будет соблюдаться равенство:

(5),

поскольку фермент, первоначально внесённый в реакционную массу, будет присутствовать в ней либо в свободном виде, либо в виде комплекса с субстратом.

Из уравнения (2):

(6)

, подставляя в (6)

Интегральная форма равнения.

,

Ингибирование
Однокомпонентное ингибирование
Полностью конкуретное ингибирование (поражение адсорбционного центра)		- константа диссоциации EJ
Полностью неконкуретное ингибирование [S] >> [E] J поражает каталитический центр или изменяет конформацию
Двухкомпонентное ингибирование
Взаимозависимое полностью конкурентное
Взаимозависимое полностью конкурентное
Взаимозависимое полностью неконкуретное
Ингибирование субстратом		Если низкие концентрации [S]: Если высокие концентрации [S]:
Ингибирование продуктом Продукт ингибирует фермент по полностью конкурентному типу
Обратная изомеризация фермента (переход в неактивную форму)		[S] высокая [S] низкая
Необратимая инактивация фермента		kин – константа скорости
Влияние кислотности среды на кинетику ферментных реакций Может поражать адсорбционный центр, может поражать каталитический центр, но при этом может образовывать продукт		[H^+]>>Kв [H^+] << Kа вр

Основные положения теории фермент-субстратного комплекса. Вывод дифференциальной формы уравнения Михаэлиса-Ментен. Уравнение Бригса-Холдейна. Типы координат, используемые для анализа кинетических констант биохимических реакций в биотехнологии.

Понятие об ингибиторах/активаторах. Однокомпонентное (полностью конкурентное, полностью неконкурентное) ингибирование. Графическая интерпретация ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка, Диксона. Двухкомпонентное полностью конкурентное (взаимозависимое, взаимонезависимое) ингибирование, полностью неконкурентное взаимозависимое ингибирование.

Вывод уравнение и особенности нахождения каталитических констант в случаях обратимой изомеризации фермента в неактивную форму, ингибирования субстратом, активации фермента.

Интегральная форма уравнения Михаэлиса-Ментен. Особенности ее графической интерпретации в случае ингибирования продуктом. Влияние температуры на скорость ферментативных реакций. Применение интегральной формы уравнения Михаэлиса-Ментен в случае необратимой инактивации фермента. Влияние рН на скорость ферментативных реакций.

Задача 1. Определите значения кинетических параметров (методом де Мигуэл Марино и Тамари) гидролиза метилового эфира N-ацетил-L-валина, катализируемого α-химотрипсином, исходя из данных таблицы. [E]₀=3,8*10^-5 моль/л

[S]0, моль/л	r0, моль/л*с
0,200	4,57*10^-6
0,124	3,83*10^-6
0,091	3,33*10^-6
0,071	2,97*10^-6
0,060	2,67*10^-6

Задача 2. Определите значения кинетических параметров (методом Иди-Хофсти) гидролиза бутирилхолина, катализируемого холинэстеразой исходя из данных таблицы. [E]₀=5,0*10^-6 моль/л

[S]0, моль/л	r0, усл.ед.
10,00*10^-4	5,55
2,50*10^-4	4,45
0,91*10^-4	2,94
0,50*10^-4	2,09

Задача 3. Определите значения кинетических параметров (методом Иди-Хофсти) гидролиза метилового эфира N-бензоил-L-аминомасляной кислоты, исходя из данных таблицы. [E]₀=2,16*10^-6 моль/л.

[S]0, моль/л	r0, моль/л*с
2,24*10^-3	4,25*10^-7
1,49*10^-3	3,52*10^-7
1,12*10^-3	3,10*10^-7
0,90*10^-3	2,71*10^-7
0,75*10^-3	2,45*10^-7

Задача 4. Исходя из данных таблицы определите кинетические параметры (методом де Мигуэл Марино и Тамари) гидролиза N-ацетил-L-норвалина, катализируемого α-химотрипсином. [E]₀=2,62*10^-7 моль/л.

[S]0, моль/л	r0, моль/л*с
4,00*10^-2	9,70*10^-7
2,00*10^-2	7,77*10^-7
1,33*10^-2	6,51*10^-7
1,00*10^-2	5,50*10^-7
0,80*10^-2	4,80*10^-7

Задача 5. Исходя из данных таблицы определите кинетические параметры (методом де Мигуэл Марино и Тамари) гидролиза бактериальных клеток, катализируемого лизоцимом. [E]₀=5,72*10^-8 моль/л.

[S]0, мг/мл	r0, ед.опт.пл./с
6,53*10^-2	1020*10^-6
8,40*10^-2	1110*10^-6
11,2*10^-2	1180*10^-6
15,5*10^-2	1310*10^-6

Задача 6. Определите значения кинетических параметров (методом Иди-Хофсти) гидролиза этилового эфира N-транс-циннамоил-L-тирозина исходя из данных таблицы. [E]₀=3,1*10^-9 моль/л.

[S]0, моль/л	r0, моль/л*с
0,36*10^-3	1,94*10^-7
0,18*10^-3	1,84*10^-7
0,12*10^-3	1,75*10^-7
0,090*10^-3	1,67*10^-7
0,072*10^-3	1,59*10^-7

Задача 7. Определите К_М и r_max (методом Иди-Хофсти) для процесса со следующими кинетическими характеристиками:

[S]0, моль/л	r0, моль/л*мин
0,002	0,045
0,020	0,285
0,060	0,460
0,100	0,505

Задача 8. Определите К_М и r_max (методом методом де Мигуэл Марино и Тамари) для реакции восстановления пирувата, если известно, что:

[S]0, моль/л	r0, моль/л*мин
20,0*10^-6	3,15*10^-6
29,0*10^-6	3,70*10^-6
40,0*10^-6	4,10*10^-6
50,0*10^-6	4,39*10^-6

Задача 9. Определите К_М и r_max (методом Иди-Хофсти) для реакции гидролиза бактериальных клеток, катализируемой лизоцимом, если известно, что:

[S]0, мг/мл	r0, ед.опт.пл./с
1,17*10^-^2	380*10^-6
1,87*10^-^2	516*10^-6
3,73*10^-^2	800*10^-6
7,46*10^-^2	1100*10^-6

Задача 10. Определите К_М и r_max (методом де Мигуэл Марино и Тамари) для реакции гидролиза, катализируемой трипсином, если известно, что

[S]0, моль/л	r0, моль/л*с
1,00*10^-2	32,5*10^-7
0,80*10^-2	28,1*10^-7
0,67*10^-2	24,5*10^-7
0,55*10^-2	21,5*10^-7
0,50*10^-2	21,3*10^-7

Задача 11. Определите К_М и r_max (методом Иди-Хофсти) для реакции гидролиза N-ацетил-L-аланил-L-фенилаланина, катализируемого

α-химотрипсином, если известно, что:

[S]0, моль/л	r0, моль/л*с
0,153*10^-2	4,94*10^-7
0,0765*10^-2	4,20*10^-7
0,0510*10^-2	3,74*10^-7
0,0383*10^-2	3,02*10^-7

Задача 12. Определите К_М и r_max (методом де Мигуэл Марино и Тамари) для процесса со следующими кинетическими характеристиками:

[S]0, моль/л	r0, моль/л*мин
0,002	0,09
0,020	0,57
0,060	0,92
0,100	1,01

Задача 13. Приведенные ниже данные были получены при изучении ингибирования, вызываемого L-β-окси-β-(трео)-метиласпартатом. Определите тип ингибирования и все возможные кинетические характеристики процесса, если известно, что [E]₀= 1*10^-5 моль/л.

[S]0, моль/л	r0, моль/л*мин
	[I] = 0	[I] = 5*10^-4 моль/л
0,5*10^-4	14,0*10^-3	6,0*10^-3
5,0*10^-4	92,0*10^-3	40,0*10^-3
25,0*10^-4	150,0*10^-3	120,0*10^-3

Задача 14. Приведенные ниже данные были получены при изучении ингибирования в системе с β-метиласпартазой. При этом в качестве субстрата использовался L-трео-β-метиласпартат. Определите тип ингибирования и все возможные кинетические характеристики процесса, если известно, что [E]₀= 2,5*10^-5 моль/л.

[S]0, моль/л	r0, моль/л*мин
	[I] = 0	[I] = 5*10^-4 моль/л
1,0*10^-4	26,0*10^-3	10,0*10^-3
15,0*10^-4	136,0*10^-3	86,0*10^-3
50,0*10^-4	165,0*10^-3	142,0*10^-3

Задача 15. Бензоат 1,2,5-триметилпиперидол-4 (β-изомер) является ингибитором гидролиза бутиролхолина. Определите тип ингибирования и все возможные кинетические характеристики процесса исходя из данных таблицы. [E]₀ = 6,2*10^-6 моль/л.

[S]0, моль/л	r0, усл. ед.
	[I] = 0,05*10^-4 моль/л	[I] = 0,20*10^-4 моль/л
10,00*10^-4	4,77	2,86
2,50*10^-4	3,78	2,28
0,91*10^-4	2,56	1,52
0,50*10^-4	1,79	1,06

Задача 16. Установлено, что α-кетоглутарат является ингибитором реакции, катализируемой N-метил-глутамат-дегидрогеназой. Определите тип ингибирования и все возможные кинетические характеристики процесса исходя из данных таблицы. [E]₀=4,5*10^-2 мг/мл.

[S]0, моль/л	r0, моль/л*мин
	[I] = 6*10^-4 моль/л	[I] = 30*10^-4 моль/л
1,67*10^-4	1,67*10^-6	1,00*10^-6
1,00*10^-4	1,43*10^-6	0,77*10^-6
0,500*10^-4	1,04*10^-6	0,45*10^-6

Задача 17. При исследовании свойств холинэстеразы обнаружен ингибитор ее активности. Определите тип ингибирования и все возможные кинетические характеристики процесса, исходя из данных таблицы. [E]₀ = 10,0*10^-6 моль/л.

[S]0, моль/л	r0, усл. ед.
	[I] = 0,10*10^-4 моль/л	[I] = 0,30*10^-4 моль/л
10,00*10^-4	4,00	2,38
2,50*10^-4	3,18	1,85
0,91*10^-4	2,16	1,24
0,50*10^-4	1,49	0,87

Задача 18. Установлено, что α-кетоглутарат является ингибитором реакции окисления N-метил-L-глутамата. Определите тип ингибирования и все возможные кинетические характеристики процесса исходя из данных таблицы. [E]₀=6*10^-2 мг/мл.

[S]0, моль/л	r0, моль/л*мин
	[I] = 0	[I] = 6*10^-4, моль/л
1,00*10^-4	1,67*10^-6	1,43*10^-6
0,625*10^-4	1,43*10^-6	1,18*10^-6
0,417*10^-4	1,25*10^-6
0,330*10^-4		0,83*10^-6