21

ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Кафедра биологии имени академика Е.Н.Павловского

"УТВЕРЖДАЮ"

Заведующий кафедрой биологии

профессор

А.Ф.НИКИТИН

" "_________ 2013г.

Доктор медицинских наук профессор

Никитин А.Ф.

Л Е К Ц И Я N 9

по биологии тему

" ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ЭУКАРИОТНОЙ КЛЕТКИ"

для курсантов и слушателей I курса 2 факультета

по специальности «Медико-профилактическое дело»

Обсуждена на заседании кафедры

" "___________________ 2013 г.

Протокол n__________________

САНКТ - ПЕТЕРБУРГ

2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Под жизненным циклом клетки понимают период существования клетки от момента образования ее в результате деления материнской клетки до окончания следующего деления или до гибели. Это понятие распространяется лишь на соматические клетки многоклеточных организмов, так как применительно к одноклеточным организмам применимо понятие жизненного цикла, которое охватывает все стадии развития одноклеточных организмов в ходе их онтогенеза. Хотя жизненные циклы клеток многоклеточных организмов могут существенно отличаться, тем не мене можно выделить и общие для них структурно-функциональные изменения по ходу жизненных циклов. Большой универсальностью отличаются и молекулярные механизмы регуляции клеточного цикла, которые были открыты лишь в последние два десятилетия.

В лекции рассматриваются следующие вопросы:

1. Общая характеристика жизненного цикла эукариотной клетки;

2. Митоз, эндомитоз и их биологическое значение.

3. Регуляция клеточного цикла:

4. Гибель клетки. Апоптоз и его биологическое значение

1. Как отмечалось выше период существования клетки от момента образования ее путем деления или до гибели, называется жизненным циклом клетки или клеточным циклом. ее в результате деления материнской клетки до окончания следующего У разных клеток многоклеточных организмов жизненные циклы имеют существенные особенности. Это связано с дифференциацией и специализацией клеток многоклеточных организмов, в результате чего клетки приобретают разную способность к делению. По этому признаку клетки многоклеточных подразделяют на три группы: непрерывно делящиеся клетки; клетки, сохранившие способность к делению, но реализующие ее лишь под влиянием определенных воздействий; клетки, необратимо утратившие способность к делению (табл.1).

Таблица 1

Характеристика клеток организма человека по признаку способности их к делению

Характеристика признака	Примеры
Непрерывно делящиеся клетки	Эмбриональные клетки на ранних стадиях развития, камбиальные эпителиальные клетки кишки, клетки базального росткового слоя кожи, стволовые клетки крови и др.
Клетки, сохранившие способность к размножению, но реализующие ее лишь под влиянием определенных воздействий	Гепатоциты, лимфоциты, эпителиальные клетки почек, легких, клетки поджелудочной и щитовидной желез и другие дифференцированные клетки, а также «покоящиеся» стволовые клетки нервных, костных, мышечных и других тканей.
Клетки, необратимо утратившие способность к делению.	Нейроны, кардиомиоциты, клетки хрусталика

. Важнейшей частью жизненного цикла клеток, сохранивших способность к делению, служит митотический цикл или пролиферативный цикл. В течение митотического цикла протекают процессы, в результате которых из одной клетки образуются две новые

В митотическом цикле выделяют два тесно связанных между собой периода: период подготовки клетки к делению (интерфаза) и период деления (митоз).

Важнейшим событием периода подготовки клетки к делению служит репликация ДНК. В связи с этим указанный период подразделяется на три периода: G1 - постмитотический, или пресинтетический; S- cинтетический и G2- постсинтетический , или премитотический. Продолжительность синтетического и постсинтетического периодов, а также митоза для разных клеток отличается большим постоянством, каким бы не был интервал между их делениями. Например, у млекопитающих длительность S-периода интерфазы составляет 6-10 часов, G₂-периода -2-5 часов, митоза 1-1,5 часа. В то же время длительность пресинтетического периода у разных типов клеток варьирует в очень широких пределах: от нескольких минут и часов до года и более, как, например, в клетках печени человека. В этот период клеткой «принимается решение» о продолжении очередного митотического цикла или о выходе из него и вступлении в период пролиферативного покоя или G₀. Обычно выход непрерывно делящейся клетки из митотического цикла связан либо с вступлением ее на путь дифференциации и специализации, либо с переходом такой клетки в «дремлющее» состояние, когда она прекращает делиться в течение длительного срока. Конкретные причины выхода клетки из митотического цикла отличаются большим разнообразием и многие их них неизвестны. В одних случаях ими могут быть гормональные влияния, в других -недостаточное действие факторов роста, или недостаток ресурсов, необходимых для подготовки клетки к делению и т.п.

Для клеток, сохранивших способность к размножению, выход из митотического цикла обратим, так как под действием внешних сигналов они могут входить в него снова. Такими сигналами в организме млекопитающих и человека обычно служат белковые факторы роста и другие естественные митогены, стимулирующие деления клеток. Связываясь со специфическими рецепторами клетки, они активируют их, и тем самым инициируют передачу сигнала к генам, запускающим прохождение клеткой митотического цикла (подробнее см. главу 5). При этом, как только клетка пройдет в конце пресинтетического периода, так называемую точку рестрикции (R), она без задержки проходит и другие фазы клеточного цикла, независимо от внешних условий. Иными словами точка рестрикции обозначает момент перехода к безостановочному продолжению митотического цикла, когда неблагоприятные внешние условия, в том числе недостаточное действие факторов роста, уже не могут препятствовать его завершению.

В различные периоды интерфазы в клетке происходят существенные изменения ее структуры и функциональной активности, характеристика которых представлена в табл.2.

Таблица 6.2.

Характеристика структурно-функциональных изменений клетки в различные периоды интерфазы.

Периоды интерфазы	Содержание структурно-функциональных изменений
Пресинтетический(G1)	- завершение формирования ядрышка; - интенсивный синтез РНК и белков; - восстановление набора клеточных органелл, бывшего в материнской клетке до ее деления; - синтез холестерола; - образование химических предшественников ДНК; -синтез ферментов, участвующих в репликации; - рост клеток за счет увеличения объема цитоплазмы до достижения ими нормальных размеров.
Синтетический (S)	-рост клетки в основном за счет роста ядра; -репликация ДНК, которая запускается белками – активаторами S - фазы, поступающими в ядро из цитоплазмы; репликация ДНК осуществляется сразу во многих точках, однако ни в одной из них этот процесс не инициируется более одного раза; - интенсивный синтез белков гистонов, необходимых для построения хроматина, в результате чего их количество удваивается; -удвоение кинетохорных белков; -удвоение центриоли клеточного центра и образование двух диплосом;
Постсинтетический (G2 )	-интенсивный синтез РНК, АТФ и белков, особенно тубулинов, участвующих в формировании веретена деления; -увеличение массы цитоплазмы и рост объема ядра; - трансформация центра организации трубочек: исчезновение сателлитов на материнской диплосоме, покрытие центриолей в обеих диплосомах фибриллярным гало, от которого в профазе начнут отрастать митотические микротрубочки; -исчезновение цитоплазматических микротрубочек; - усиление деления митохондрий; - накопление и активация митоз стимулирующего фактора.

Митоз подразделяют на четыре, последовательно переходящие друг в друга стадии, обозначаемые как профаза, метафаза, анафазы и телофаза. Структурно-функциональные изменения клетки в различные стадии митоза представлены в табл. 2

Таблица 2

Характеристика структурно-функциональных изменений клетки в различные стадии митоза

Стадия митоза	Содержание структурно-функциональных изменений
Профаза	- образование кинетохор – специальных белковых структур, имеющих вид пластинок или дисков, располагающихся в зонах центромер хромосом. На каждую сестринскую хроматиду приходится по одному кинетохору. В ходе митоза кинетохоры сестринских хроматид располагаются оппозитно, при этом каждый из них связывается со своим пучком микротрубочек;. - конденсация хромосом, которые укорачиваются, утолщаются и становятся видимыми в световой микроскоп. В начале профазы сестринские хроматиды связаны друг с другом на всем их протяжении с помощью белков-когезинов, а в конце-только в области центромеры ( кинетохоров); - прекращение синтеза РНК и распад ядрышек, что связано с инактивацией всех генов ядерного генома; - резкое снижение синтеза белка; - разрушение ядерной ламины в результате деполимеризации белков ламинов, фрагментация ядерной мембраны с образованием микропузырьков, исчезновение поровых комплексов; - распад мембран эндоплазматического ретикулума и дезинтеграция аппарата Гольджи; - разрушение цитоплазматических микротрубочек, составной части интерфазного цитоскелета; - образование аппарата деления или веретена деления. В образовании веретена деления участвуют: полярные тельца и кинетохоры хромосом Вначале до разрушения ядра, происходит деление центросомы и расхождение образовавшихся центросом с находящимися в них диплосомами к полюсам клетки, при этом каждая центросома становится полюсом или полярным тельцем образующегося веретена деления. От полюсов , являющихся центрами организации микротрубочек, своими «+»-концами отрастают микротрубочки. Вначале от полюсов отходят радиальные микротрубочки (астральные микротрубочки) образуя вокруг них фигуру, которая получила название “лучистое сияние”. После разрушения ядра часть микротрубочек направляется к центромерам хромосом, где связывается с кинетохорами (кинетохорные микротрубочки), другие, так называемые межполюсные микротрубочки, растут в направлении противоположного полюса, но до него не доходят. Рост микротрубочек, отходящих от центросом, обусловлен полимеризацией белка тубулина; - активное перемещение хромосом и их расположение по экватору клетки. Механизм движения хромосом связан с непрерывным изменением длины кинетохорных микротрубочек, идущих в противоположных направлениях от сестринских хроматид каждой хромосомы, и тянущих их в разные стороны.
Метафаза	-завершение формирования веретена деления и выстраивание хромосом в экваториальной плоскости клетки таким образом, что центромерные участки их оказываются обращенными к центру веретена, а плечи – к периферии. Такое расположение хромосом носит название “материнской звезды” (характерно только для клеток животных). Удержание хромосом в экваториальной плоскости обеспечивается равным натяжением кинетохорных микротрубочек, отходящих от кинетохоров сестринских хроматид к противоположным полюсам веретена. - активация анафаза стимулирующего фактора и убиквитинзависимое разрушение митоз стимулирующего фактора.
Анафаза	- разрушение белков когезинов, соединяющих сестринские хроматиды и быстрое «как по команде» расхождение хромосом к полюсам клетки. При движении хромосом они принимают V-образную форму. Вершина их направлена в сторону полюсов деления, а плечи - к центру веретена. Движение хромосом осуществляется, главным образом, за счет энергии, выделяющейся при деполимеризации кинетохорных микротрубочек со стороны их + конца. Дополнительное расхождение хромосом достигается за счет удаления полюсов друг от друга в результате удлинения полярных микротрубочек.
Телофаза	- деконденсация хромосом и увеличение их объема; - образование вокруг хромосом на каждом из полюсов клетки ядерной мембраны. Этот процесс начинается в местах контактов хромосом с мембранными пузырьками, в стенки которых встраиваются белковые комплексы ядерных пор. Через ядерные поры внутрь пузырьков проникают белки ламины, образующие ядерную ламину. Сливаясь между собой, такие пузырьки образуют двухмембранные компартменты, окружающие каждую хромосому, которые получили название микроядер или кариомер. В результате слияния кариомер друг с дургом в клетке образуется два дочерних ядра; - формирование ядрышек. Этот процесс протекает после образования ядерной мембраны; - восстановление мембранных структур клетки: эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи; - разрушение митотического аппарата, распад астральных и полюсных микротрубочек; - деление клеточного тела или цитокинез. Указанный процесс осуществляется путем впячивания плазматической мембраны внутрь клетки с образованием борозды деления. Вначале появляется кортикальное скопление микрофиламентов, формирующих акто-миозиновое сократимое кольцо. Затем взаимное скольжение актиновых и миозиновых компонентов кольца приводит к прогрессирующему вдавлению плазматической мембраны и к перетяжке клетки надвое.

Биологическое значение митотического цикла состоит в том, что он обеспечивает образование дочерних клеток, наследственная информация которых полностью идентична информации материнской клетки. Это достигается путем репликации ДНК и удвоения хромосом в интерфазе митотического цикла, а также посредством равномерного распределения их в процессе митоза . Благодаря митотическому циклу у многоклеточных организмов осуществляются процессы роста, обновления тканей, регенерации и вегетативного размножения.

2. На основе митотического цикла сформировался ряд механизмов, с помощью которых количество ядерной ДНК, и, следовательно, скорость обменных процессов в клетке могут быть значительно увеличены. Один из них связан с репликацией ДНК, не сопровождающейся в дальнейшем разрушением ядерной оболочки, дезинтеграцией ядрышка, образованием веретена деления и цитокинезом, хотя хромосомы при этом проходят цикл спирализации и деспирализации, благодаря чему количество их удваивается. Этот вариант митоза механизм получил название эндомитоза, или эндоредупликации. Повторные эндомитозы могут приводить к возникновению гигантских клеток с полиплоидным ядром, содержащим увеличенное количество ДНК. Примером таких клеток служат мегакариоциты (гигантские клетки кост¬ного мозга) человека, которые начинают формировать кровяные пластинки, лишь достигнув определенного уровня полиплоидии (16-32n) в результате нескольких эндомитозов.

Другой механизм увеличения количества ДНК в клетке, получивший название политении, заключается в многократной репликации ДНК, не сопровождающейся формированием хроматид на основе ее дочерних молекул, в результате чего образуются гигантские многонитчатые (политенные) хромосомы, превышающих по своим размерам обычные хромосомы в сотни и более раз. Такие хромосомы обнаруживаются, например, в неделящихся клетках слюнных желез некоторых насекомых. К увеличению содержания ДНК в клетке приводит митотическое деление ядра (кариокинез), не сопровождающееся разделением цитоплазмы (цитотомией), следствием чего является образование дву-и многоядерных клеток. При последующем митотическом делении такой двуядерной клетки хромосомные наборы ядер объединяются в метафазе, приводя к образованию двух дочерних полиплоидных клеток. Например наличие полиплоидных - тетра- (4n) и октаплоидных (8n) клеток - нормальное явление в некоторых органах человека ( печень, поджелудочная железа, слюнные железы и др.).

Биологическое значение эндомитоза, политении и других механизмов, обеспечивающих увеличение количества ДНК в клетке, состоит в том, что все они приводят к экстракопированию генов, в результате чего гены оказываются повторенными в клетке более, чем два раза. За счет этого интенсифицируются обменные процессы, протекающие в клетке, и достигается существенное усиление ее функциональной активности.

3. Закономерное прохождение клеткой фаз митотического цикла контролируется регуляторными молекулярными механизмами, которые сформировались на ранних стадиях эволюции и отличаются большим сходством у всех известных эукариот.

Ведущую роль в поочередной смене фаз клеточного цикла играют специфические ферменты циклинзависимые протеинкиназы или Сdk. Идентифицировано несколько изоформ киназ, каждая из которых обозначается соответствующими арабскими цифрами, например Сdk1, Сdk2, Сdk3 и др. Основная функция киназ заключается в фосфорилировании и, как следствие этого, изменении биологической активности белков, обеспечивающих прохождение клеткой митотического цикла. Молекулы циклинзависимых киназ постоянно присутствуют в клетке и сами по себе неактивны. Их активация происходит лишь при связывании с ними специальных белков – циклинов (Ц). Свое название указанные белки получили в связи с тем, что содержание их на протяжении клеточного цикла меняется циклическим образом. Это означает, что изменения содержания циклинов в пределах одного митотического цикла закономерно повторяются и в последующих циклах. Циклины, также как Сdk, представлены разными формами, которые обозначаются соответствующими латинскими буквами, например, циклин А, циклин D, циклин Е и т.д. Важное свойство белков- циклинов состоит в том, что каждый из них способен связываться и образовывать комплексы лишь с определенными «своими» Сdk. Например циклин В образует комплексы с Сdk 2, циклин D с Сdk4 и Сdk6 и т.п. Некоторые Сdk активируются более чем одним циклином. В этом случае по ходу митотического цикла циклины, как бы «передают» такие Сdk друг другу, что поддерживает их в активированном состоянии длительное время. Именно закономерные изменения комбинаций циклинов и циклинзависимых киназ в составе комплексов в различные стадии периода подготовки клетки к делению и в ходе митоза определяют последовательность прохождения клеткой митотического цикла. Выделяют четыре группы комплексов циклинов и Сdk, каждый из которых действует лишь на определенной стадии митотического цикла: G1-CDK, G1/S-CDK, S-CDK,- M-CDK.

Таблица 3

Характеристика комплексов циклин-Сdk, действующих на разных стадиях митотического цикла

Стадия митотического цикла	Название комплекса	Состав комплекса
		Циклин	Циклинзависимая киназа
Пресинтетический	G1-CDK	Циклин D	Cdk4, Cdk6
	G1/S-CDK	Циклин E	Cdk2
Синтетический	S-CDK	Циклин А	Cdk2
Постсинтетический	G2-CDK	Циклин А	Cdk2 Cdk1
Митоз	M-CDK	Циклин В	Cdk2*

* У дрожжей Cdk1

В дополнение к циклинам ферментативная активность циклинзависимых протеинкиназ регулируется специфичными по отношению к ним протеинкиназами и фосфатазами, а также белками, служащими ингибиторами комплексов циклин-Сdk. По мере необходимости белки- ингибиторы могут активироваться и блокировать взаимодействие Cdk со «своими» циклинами, подавляя тем самым, ферментативную активность киназ. В клетках млекопитающих выделяют два класса белков ингибиторов: cip/kip и INK4. Класс cip/kip включает белки p21, p27 и p57, которые ингибируют биологическую активность всех комплексов циклин-Сdk, благодаря чему указанные белки способны останавливать прохождение клеточного цикла на любой его стадии. Белки класса INK4 (р15, р16, р18, р19) действуют более специфично. Они ингибируют ферментативную активность комплексов циклин D- Сdk4/6, которые функционируют только на стадии G1.

После завершения митоза, в начальной стадии пресинтетического периода, белки циклины в клетке обнаружить не удается. Первыми в ответ на действие факторов роста в клетке синтезируется циклин D, который образует комплексы с киназами Сdk4, Сdk6, и Сdk2. Указанные Сdk в результате активации их циклином D наиболее активно функционируют на начальном этапе постмитотического периода. Они фосфорилируют белки, необходимые для прохождения клеткой пресинтетического периода, и перехода ее к следующей стадии интерфазы. Важнейшим субстратом такого фосфорилирования служит белок Rb – ингибитор транскрипционного фактора E2F. Свое название белок Rb получил в связи с тем, что мутации гена, кодирующего этот белок, вызывают у человека злокачественное наследственное заболевание глаз - ретинобластому.

В покоящихся клетках нефосфорилированный белок Rb связан с транскрипционным фактором E2F-DP и ингибирует его биологическую активность. Фосфорилирование белка Rb приводит к освобождению фактора E2F из состава комплекса. После чего транскрипционный фактор E2F транспортируется из цитоплазмы в ядро, где инициирует экспрессию большой группы генов, кодирующих ключевые ферменты синтеза дезоксирибонуклеотидов и репликации ДНК, а также генов циклинов Е, А, В и Сdk2 (рис.6.7). Экспрессия указанных генов способствует образованию пререпликативных комлексов в сайтах начала репликации ДНК и обеспечивает переход клетки из G1 в S период и дальнейшее прохождение ею митотического цикла. Ведущую роль в этом играет комплекс циклин Е-Сdk2, функция которого заключается в фосфорилировании белков пререпликативного комплекса, что сопровождается прохождением клеткой точки рестрикции и необратимым переходом ее из G1 в S период. Наряду с этим активированная Сdk2 в комплексе с циклином Е, действуя совместно с комплексами циклин D-cdk4/6, осуществляет дополнительное фосфорилирование белка RB, способствуя тем самым максимальной экспрессии генов, контролирующих прохождение клеткой митотического цикла.

Кроме циклина D большую роль в механизме, запускающем вхождение клетки в митотический цикл, играет так называемый SCF белок, синтез которого, также как и синтез циклина D инициируется действием факторов роста. Функция SCF белка, обладающего убиквитинлигазной активностью, заключается в разрушение белка р27- одного из ингибиторов комплексов циклин D-Сdk4/6, результатом чего служит инициация процессов, связанных с вхождением клетки в митотический цикл.

В начале синтетического периода циклин Е разрушается и основные внутриклеточные процессы S периода митотического цикла протекают под влиянием комплексов циклин А-Сdk2/Сdk1. Действие активированной Сdk2. в составе комплекса с циклином А заключается в дополнительном фосфорилировании и активации белков репликативного комплекса, благодаря чему достигается сразу два эффекта. Указанные белки начинают активно синтезировать ДНК, но при этом теряют способность повторно связываться с любой точкой начала репликации ДНК. Благодаря этому обеспечивается лишь однократная репликация ДНК в любом из многочисленных репликонов эукариотических хромосом.

В постсинтетический период, на фоне действия комплексов циклин А-Cdk1, интенсифицируется образование митоз стимулирующего фактора (МСФ), представляющего собой комплекс Cdk1 и циклина B. Однако на протяжении большей части постсинтетического периода он остается неактивном. И лишь в конце этого периода, когда указанный фактор активируется, клетка вступает в митоз. В результате действия МСФ осуществляется фосфорилирование многочисленных клеточных белков, изменения функциональной активности которых во многом определяют характер основных процессов, протекающих в про- и метафазу митоза ( табл.4).

Таблица 4

Белки, фосфорилируемые под действием МСФ, и связанные с этим эффекты.

Название фосфорилируемых белков	Эффекты, связанные с фосфорилированием указанных белков
гистон Н1 и другие хромосомные белки	конденсация хромосом
белки ядерной ламины и другие белки	деполимеризация белков ламинов и распад ядерной мембраны на фрагменты, замыкающиеся в микропузырьки; распад мембран ЭПС и комплекса Гольджи
тубулины	полимеризация тубулинов, рост микротрубочек и образование веретена деления
миозины	невозможность взаимодействия белков миозинов с актином в результате чего предупреждается преждевременное наступление цитотомии
анафаза стимулирующий фактор	активация анафаза стимулирующего фактора и инактивация МСФ.

Ведущую роль в инициации процессов, протекающих в ана- и телофазу митоза, играет активация МСФ анафаза стимулирующего фактора (АСФ) или АPF (от англ. anaphase promoting factor). Указанный фактор представляет собой убиквитинлигазу и обладает способностью избирательно присоединять молекулы убиквитина – белка с небольшим молекулярным весом, к другим белковым молекулам, тем самым, как бы оставляя на ни них «метку». В результате такие «меченые» белки захватываются протеосомами и разрушаются их протеолитическими ферментами. В анафазу митоза под влиянием АPF разрушаются белки когезины, удерживающие сестринские хроматиды, благодаря чему хроматиды получают возможность расходиться к противоположным полюсам клетки. Под действием АPF разрушается также циклин В, что приводит к инактивации МСФ и, как следствие этого, к дефосфорилированию протеинфосфатазами белков, фосфорилированных в про- и метафазу митоза. В результате в телофазе происходит деконденсация хромосом, восстановление ядерных оболочек, а на заключительном этапе телофазы осуществляется цитотомия. Иными словами в телофазу митоза протекают процессы сходные с событиями про- и метафазы митоза, но как бы с «обратным знаком».

Таким образом, общий принцип действия молекулярных механизмов, регулирующих митотический цикл клетки, заключается в стимуляции комплексами циклин-Сdk, процессов свойственных «своей» фазе, ингибировании активности комплексов циклин-Сdk предшествующей фазы и образовании или активации комплексов следующей фазы.

В процессе клеточного цикла обеспечивается постоянный контроль состояния наследственного материала клетки: ДНК и хромосом. Большую роль в этом играет белок р53, который служит транскрипционным фактором генов, отвечающих за остановку клеточного деления, (например, гена белка р21, являющегося ингибитором всех комплексов циклин – Сdk), а также генов, запускающих апоптоз.

Белок р53 синтезируется постоянно, но в обычных условиях его активность оказывается весьма низкой. При нарушениях структуры ДНК и хромосом активность указанного белка значительно возрастает, в результате чего наступает длительная задержка клеточного цикла для устранения имеющихся повреждений. Если устранить повреждения клетке не удается, то белок р53 приводит в действие механизмы апоптоза (генетически запрограммированной гибели клетки) и такая клетка погибает.