Методическая разработка № 14

ТЕМА: Иммунологические методы диагностики. Реакции лизиса: бактериолиза, цитолиза (гемолиза), РСК, РТСК; реакции нейтрализации: токсина антитоксином ин витро и ин виво; реакции преципитации в геле, жидкой среде; иммуноферментный (ИФА); радиоиммунный (РИМ); реакция иммуноблоттинга (РИБ); реакция нейтрализации вирусов в культуре ткани (ЦПД, цветная проба).

Мотивационная характеристика темы:Реакции лизиса, относят к наиболее специфичным, сугубо иммунологическим методам. Обе фазы реакции происходят только лишь в том случае, когда имеет место полное соответствие антигена антителу. Для правильного течения реакции необходимы четкие количественные соотношения, для чего используют ингредиенты с заранее определенными титром и рабочей дозой. Другие реакции преципитации, нейтрализации с несколькими вариантами также подчиняются аналогичным законам, но отличаются дополнительными компонентами, условиями, характером результата. Диапазон применения этих реакций огромен, от санитарно-гигиенического контроля, определения фальсификации продуктов, диагностики до судебной экспертизы. Знакомство с ними – главное назначение темы.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ:

Продемонстрировать варианты практического использования учения об иммунитете в иммунодиагностике. Научить разным методам, пониманию их сущности, технике постановки и расшифровке результатов обследования пациентов с помощью современных иммунодиагностических проб.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ И ВВОДНОГО

КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ

1. Комплемент, его структура, функции, участие в иммунных реакциях лизиса.

2. Классический и альтернативный путь активации.

3. Реакция гемолиза, сущность, техника, назначение как индикатора.

4. Реакция бактериолизиса ин витро. Ингредиенты, схема постановки, правила учета.

5. Реакция бактериолизиса ин виво (феномен Исаева-Пфейффера).

6. Реакция связывания комплемента (РСК): определение титра и рабочей дозы комплемента, антигена, гемолитической сыворотки, схема постановки реакции, этапы, оценка результатов. РТСК, сущность, назначение.

7. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Определение токсина, его силы, титра антитоксической сыворотки, варианты постановки реакций: ин витро – флокуляция, ин виво.

8. Варианты постановки реакции нейтрализации в вирусологии; на лабораторных животных, в культуре ткани, на развивающихся куриных эмбрионах. Особенности учёта, индикаторы.

9. Реакции преципитации в пробирках, капиллярах геле. Приготовление антигена.

10. Иммунологические реакции с меченными диагностическими компонентами: иммуноферментный метод диагностики (ИФА), радиоиммунный метод (РИМ), иммуноблоттинг (ИБ).

11. Критерии серо- или иммунодиагностики: диагностический титр, нарастание титра антител, специфическое подавление (торможение).

12. Определение периода болезни с помощью иммунодиагностики (раздельное определение иммуноглобулинов М и G) с учетом сроков и уровня их появления.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОМ ПРОТОКОЛА ЗАНЯТИЯ И ЕГО ОФОРМЛЕНИЕМ

№	Наименование учебного элемента (задания)	Методическое решение	Регламент протокола
1.	Механизм реакции связывания комплемента - РСК	Приложение 1 Учебная литература	Зарисовать схему в протокол. Прочесть и оценить
2.	Подготовительное титрование: а) комплемента б) антигена в) гемолитической сыворотки	Приложение 2 Приложение 3 Приложение 4	Записать в протокол схемы
3.	Приготовление гемолитической системы (индикаторной системы)	Приложение 5	Записать в протокол схемы
4.	Постановка реакции торможения РСК - РТСК	Приложение б	Записать в протокол и оценить результат готовой реакции
5.	Реакция нейтрализации бактери- альных токсинов: а) определение токсигенности б) определение титра анатоксина и антитоксической сыворотки	Приложение 7 Приложение 8,9	Записать в протокол схемы постановки и оценить готовые результаты
6.	Реакция преципитации в жидкой среде и геле	Приложение 10	Записать в протокол, зарисовать
7.	Радиоиммунологический метод (РИМ)	Приложение 11	Записать в протокол
8.	Иммуноферментный метод анализа (ИФА)	Приложение 12	Записать в протокол схему и результат
9.	Метод иммуноблоттинга	Приложение 13	Заполнить и записать в протокол
10.	Итоговый тестовый контроль	Приложение 14.

Приложение 1

Схема постановки основного опыта РСК

Ингредиенты	Опыт	Контроль сыворотки	Контроль антигена на антикомпле-ментарность	Контроль антигена на гемотоксичность
1. Диагностическая система
Сыворотка крови больного, инактивированная при +56 C° 30 мин., мл	0,5	0,5	-	-
Антиген в рабочей дозе, мл	0,5	-	0,5	0,5
Комплемент в рабочей дозе, мл	0,5	0,5	0,5	-
Физ. раствор 0,85 %	-	0,5	0,5	1,0
Инкубировать в термостате при 37 C° 60 мин.
2. Индикаторная система (гемолитическая)
Гемолитическая сыворотка в рабочей дозе, мл	0,5	0,5	0,5	0,5
Эритроциты барана 3 % взвесь, мл	0,5	0,5	0,5	0,5
Инкубировать в термостате при 37С° 60 мин.
Соединить IиIIсистемы Выдержать при +37С° 60 мин.
Результаты РСК (пример)	+ + + +	-	-	-
Результат гемолиза	-	+	+	-

Оценку РСК проводят по четырехплюсовой системе:

+ + + + Полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная РСК.

+ + + Неполная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета; положительная РСК.

+ + Частичная задержка гемолиза, осадок эритроцитов незначительный, надосадочная жидкость красно-розового цвета, прозрачная; слабо положительная РСК.

+ Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная РСК.

- Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная РСК.

Приложение 2

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (В ПРИСУТСТВИИ АНТИГЕНА)

Ингредиенты	Пробирки						Контроли антигена
	1	2	3	4	5	6	Гемотокс.	Антикомпл
Комплемент 1:10	0,05	0,1	0,12	0,15	0,18	0,25	-	0,25
Физ.раствор, мл	0,45	0,4	0,38	0,35	0,32	0,25	0,5	0,25
Антиген, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.
Гемолитическая система, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.
Учет результатов	Задержка гемолиза		Гемолиз				Задержка гемолиза	Гемолиз

Титр комплемента 0,12 (минимальное количество, дающее гемолиз в гемосистеме).

Рабочая доза 0,15 (чуть больше титра, для гарантии).

Приложение 3

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ АНТИГЕНА НА АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЕ

Действие

Ингредиенты	Пробирки							Контроль антигена на гемотоксичность
	1	2	3	4	5	6	7
Антиген, мл	0,05	0,1	0,15	0,18	0,20	0,23	0,25	0,25
Физ.раствор 0,85 %, мл	0,45	0,4	0,35	0,32	0,30	0,27	0,25	0,5
Комплемент 1:10, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.
Гемолитическая система, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.
Учёт результатов	Гемолиз			Задержка гемолиза				Задержка гемолиза

Титр антигена — то минимальное количество АГ, которое не мешает гемолизу. Это 0,18 мл. Рабочая доза должна быть в 2 раза меньше, это – 0,09 мл.

Приложение 4

СХЕМА ТЕТРИРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

Ингредиенты	Пробирки
	1	2	3	4	5	6	7
Физ. раствор 0,85 %, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Гемолитическая сыворотка 1:50, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	В дез.р.
Разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400
Эритроциты барана 3 % взвесь, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.
С^׀1:10 в раб. титре	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.
Учёт результатов	Гемолиз					Задержка гемолиза

Титр гемолитической сыворотки — то максимальное разведение, которое даёт гемолиз. Это 1: 1600. Рабочий титр должен быть концентрированнее титра в 3-4 раза, т.е. рабочий титр - 1: 400.

Приложение 5

Приготовление гемолитической системы

1. Отдельно готовят 3% взвесь эритроцитов барана: З мл, отмытых в 0,85 % физиологическом растворе эритроцитов помещённых в 97 мл. физ. раствора.

2. В отдельной колбе готовят гемолитическую сыворотку с учетом рабочего титра.

3. К 3% взвеси эритроцитов барана добавляют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем титре. Гемолитическая система готовится за 15-20 мин. до постановки реакции. Для, сенсибилизации подготовленную систему устанавливают в термостат при +37С° на 15-20 мин.

Приложение 6

Реакция торможения связывания комплемента - ртск

Принцип метода.При наличии неполных антител в сыворотке крови больного возможна блокада ими антигена (диагностикума) и получение ложных отрицательных результатов. Для контроля в этом случае ставят РТСК с применением в качестве дополнения заведомо положительной иммунной сыворотки с полными антителами.

Схема постановки РТСК

Ингредиенты	Опыт РСК	Контроль положительн. АТ	Опыт РТСК
Сыворотка крови больного, инактивирована при + 56 С° 30 минут	0,5	-	0,5
Антиген в рабочей дозе, мл.	0,5	0,5	0,5
Физиол. раствор 0,85 %, мл.	-	0,5	-
Комплемент в рабочей дозе, мл.	0,5	0,5	0,5
Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут
Заведомо положительная иммунная сыворотка, инактивированная при + 56 С° 30 мин.	-	0,5	0,5
Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут
Гемосистема (готовая), мл	1,0	1,0	1,0
Инкубировать при + 37С° 45 —60 минут
Результат	Гемолиз	Гемолиза нет	Гемолиз

Условие: у больного есть неполные антитела.

Приложение 7