2015Сибирский НИИ сыроделия, сборник научных трудов

Таблица 4

Распределение лактобактерий, выделенных из растительных объектов по органолептическим показателям

Вкус и аромат,	Кол-во штам-	% от общего	Внешний вид,	Кол-во штам-	% от общего
баллы	мов	числа штам-	консистенция,	мов	числа штам-
		мов	баллы		мов
1	0	0,00	1	0	0,00
2	1	5,26	2	5	26,32
3	6	31,58	3	14	73,68
4	5	26,32
5	7	36,84

Таблица 5

Штаммы L. lactis, выделенные из растительных объектов, перспективные для использования в производственных целях

	Кол-во отобран-	% от всех выделенных	% от выделенных штам-	Номера отобранных
	ных штаммов	штаммов	мов L. lactis	штаммов
				Р14-11
				Р14-13
	6	31,58	46,15	Р14-14
				Р14-35
				Р14-30
				Р14-50

Из объектов животного происхождения было выделено 34 штамма лактобактерий. Источниками выделения служили: коровье молоко, козье молоко, пчелиный хлеб, а также алтайские национальные (чеген, курут) самоквасные продукты.

Среди выделенных штаммов 32 штамма оказались мезофильными, 2 штамма – термофильными. По форме клеток: 31 штамм имели кокковидную форму, 3 штамма – палочковидную. Выделенные штаммы были идентифициро-

ваны как: 16 штаммов – L. lactis ssp. lactis, 13 щтаммов – L. lactis ssp. diacetilactis; 2 штамма – L. lactis ssp. cremoris; 2 штамма – термофильные молочнокислые палочки, 1 штамм – мезофильные молочнокислые палочки.

Все штаммы были проверены на время образования сгустка и титруемую кислотность.

По времени образования сгустка 43,75 % выделенных штаммов L. lactis (большая часть) свернули обрат за 18 ч; 37,5% – в течение 19–24 ч; доля слабых штаммов составила 18,75 %. У большинство штаммов L. diacetilactis (более 69 %) время образования сгустка составило 18 ч., в равном соотношении (по 15 %) обнаружены штаммы сворачивающие обрат за 19–24 ч и свыше 24 ч.

По кислотообразованию основную группу среди L. lactis (более 43 %) составили штаммы со средней активностью кислотообразования (70–90 оТ), штаммов, которые обладали кислотностью более 90 оТ – 31% от общего числа. Из L. diacetilactis основная доля (более 53 %) пришлась также на штаммы, об-

111

ладающие средней способностью кислотообразования. 30,77 % L. diacetilactis оказались сильными кислотообразователями (свыше 90 оТ).

Штаммы L. diacetilactis были проверены по таким критериям как: время образования сгустка, активность кислотообразования, активность газо- и ароматообразования (рис. 1, 2).

Рис. 1.Процентное соотношение штаммов L. diacetilactis по активности газообразования

По газообразованию у большинства штаммов высота поднятия сгустка была в пределах 1-2 см.

При проверке на ароматообразование у большинствоа штаммов (53,85 %) окраска в ходе реакции реакции произошла в течение 10–15 минут (штаммы средней активности). 15% штаммов обладали активной способностью к ароматообразованию (окрашивание проявлялось через 5–10 минут. У 30,77 % окрашивание так и не проявилось.

Рис. 2. Процентное соотношение штаммов L. diacetilactis по активности ароматообразования

112

Штаммы L. lactis ssp. cremoris были проверены на время образования сгустка, на активность кислотообразования и на активность ароматообразования (табл. 6).

						Таблица 6
		Технологически-ценные свойства L. cremoris
№	Название	Время образова-		Активность	кислотообра-	Активность ароматообра-
	штамма	ния сгустка, ч		зования, оТ		зования, мин
1	Н14-22	20,00	± 0,00	85,00 ± 1,73		12,33 ± 0,33
2	Н14-23	28,00	±	70,00 ± 1,53		12,00 ± 0,00

Выделенные молочнокислые палочки также были проверены на время образования сгустка и активность кислотообразования (табл. 7).

Таблица 7

Технолологически-ценные свойства выделенных молочнокислых палочек

	№	Название	Отношение к тем-	Время образования	Активность кислотообра-
		штамма	пературе	сгустка, ч	зования
1		Н14-24	мезофил	22,00 ± 0,00	76,67 ± 0,67
2		Н14-26	термофил	18,00 ± 0,00	140,67 ± 1,86
3		Н14-27	термофил	20,00 ± 1,00	65,33 ± 0,88

Все штаммы, выделенные из объектов животного происхождения, были продегустированны в чистом виде и оценены по бальной системе. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8

Распределение лактобактерий, выделенных из объектов животного происхождения, по органолептическим показателям

	Вкус и аромат,	Кол-во штам-	% от общего	Внешний вид,	Кол-во штам-	% от общего
	баллы	мов	числа штам-	консистенция,	мов	числа штам-
			мов	баллы		мов
	1	0	0,00	1	1	2,94
	2	5	14,70	2	7	20,59
	3	6	17,65	3	26	76,47
	4	9	26,47
	5	14	41,18

Исходя из данных, полученных в ходе дегустации, большую часть (более 29 %) составили штаммы, набравшие максимальное количество баллов по 2-м показателям (вкус, аромат; внешний вид, консистенция). Более 30 % штаммов проявили низкие показания в ходе дегустации.

В результате из всех штаммов, выделенных из объектов животного происхождения, было выбрано 10 штаммов, что составило 29, 41 % от общего количества выделенных штаммов.

113

Среди 10 отобранных штаммов, выделенных из объектов животного происхождения, 5 штаммов – L. lactis, 3 штамма – L. diacetilactis, 1 штамм – L. cremoris, 1 штамм – термофильная палочка.

Отобранные штаммы, которые могут быть перспективными для использования в производственных целях при составлении бактериальных заквасок представлены в таблице 9.

Таблица 9

Штаммы, выделенные из объектов животного происхождения, перспективные для применения в производстве

	L. lactis	L. diacetilactis	L. cremoris	Термофильные
				палочки
Кол-во отобран-	5 из 16	3 из 13	1 из 2	1 из 2
ных штаммов
% от выделенных	31,25	23,08	50	50
штаммов
Номера штаммов	КМ14-16	КМ14-18	Н14-23	Н14-26
	КМ14-45	ПХ14-36
	КМ14-46	КМ15-59
	КМ14-48
	КМ15-60

Было проведено сравнение штаммов L. lactis и L. diacetilactis, выделенных из растительных и животных объектов по технологически-ценным свойствам с целью выявить отличаются ли штаммы по свойствам, в зависимости от источника выделения.

Штаммы L. lactis сравнивались по таким показателям как время образования сгустка и активность кислотообразования.

По данным, полученным в ходе наших исследований, получилось, что по времени образования сгустка чуть более активными являются штаммы, выделенные из источников животного происхождения (рис. 3).

Рис. 3 Сравнение L. lactis, выделенных с растительных и животных объектов по времени образования сгустка

114

По титруемой кислотности, штаммы выделенные из растительных источников, имеют больший процент по средней кислотности (70–90 оТ), но всё же сильную группу кислотообразователей составляют в основном штаммы животного происхождения (рис. 4).

Рис. 4. Сравнение штаммов L. lactis растительного и животного происхождения по активности кислотообразования

Штаммы L. diacetilactis сравнивали по активности газо- и ароматообразования. По способности к газообразованию более активными являются штаммы, выделенные из растительных объектов (рис. 5).

Рис. 5. Сравнение штаммов L. diacetilactis растительного и животного происхождения по активности газообразования

По способности к ароматообразованию результаты разделились: в группе, в которой окрашивание происходит в течение 5–10 мин (сильные штаммы), преобладали растительные штаммы, а в группе, где реакция проявлялась через 10–15 мин, преобладали штаммы животного происхождения (табл. 10).

115

Таблица 10

Сравнение штаммов L. diacetilactis по активности ароматообразования

Время окрашивания, мин	% от штаммов растительного	% от штаммов животного
	происхождения	происхождения
нет окрашивания	60,00 %	30,77 %
1–5	0,00 %	0,00 %
5–10	20,00 %	15,38 %
10–15	20,00 %	53,85 %

Также проводилось сравнение всех штаммов растительного и животного происхождения по дегустационной оценке (рис. 6).

Рис. 6. Сравнение выделенных штаммов растительного и животного происхождения по дегустационной оценке

По наивысшей оценке за органолептические показатели штаммы растительного и животного происхождения имели практически равное процентное соотношение.

Таким образом, в качестве объектов естественного происхождения, для выделения чистых культур молочнокислых бактерий, могут использоваться источники животного и растительного происхождения. Технологически-ценные штаммы, перспективные для создания бактериальных заквасок и препаратов, можно получать и с растительных и с животных объектов. Конечно, стоит учитывать, что по одним показателям более активными являются растительные штаммы, по другим – штаммы животного происхождения. Поэтому при выборе штаммов, необходимо руководствоваться тем, для каких именно целей будет использоваться данный штамм и какие свойства от него нам требуются.

116

БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОЛОЧНОЙ ОТРАСЛИ

УДК 637.325:543.54

Разработка технологии производства молокосвертывающего препарата для сыроделия. 7. Исследование полипептидного состава и протеолитической специфичности препаратов говяжьего пепсина методом электрофореза

В.В. Ельчанинов, к.т.н., А.Д. Коваль, к.т.н. А.Н. Белов, к.т.н.

ФГБНУ «Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия», Барнаул

Продолжение серии публикаций, посвященных разработке технологии производства жидкого молокосвертывающего ферментного препарата (МФП) для сыроделия [1-5].

Работа выполнена в рамках НИР (Тема № 10.02.03.06), целью которой является создание технологии получения жидкого препарата говяжьего пепсина. Задачей очередного этапа работы было исследование полипептидного состава и протеолитической специфичности жидкого препарата говяжьего пепсина (ГП).

Материалы и методы.

Определение молокосвертывающей активности (МА) молокосвертывающих ферментных препаратов и подготовку препаратов жидкого говяжьего пепсина производили в соответствии с ранее опубликованными методиками [1-6].

Исследуемые препараты.

1.ГП-СибНИИС - зкспериментальный жидкий образец говяжьего пепсина.

Исследовался свежеприготовленный препарат и препарат, хранившийся при температуре 5-100С в течение 7 месяцев.

2.ГП-МЗСФ - коммерческий препарат сухого говяжьего пепсина производства (ОАО "МЗСФ", Россия). Использовался в качестве контрольного пре-

парата говяжьего пепсина. Контрольный препарат (сухой порошок) хранился при температуре 5-100 С в течение 7 месяцев.

Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ЭФ-ДСН). Полипептидный состав образцов молокосвертывающих препаратов и фер-

мент-субстратных смесей (ФСС) исследовали методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия по методу Laemmli [7,8]. В качестве маркеров молекулярной массы (ММ) использовали стандартную белковую смесь производства фирмы "Amersham Biosciences" (Швеция), которая имела следующий состав: фосфорилаза b (94,0 кДа); бычий сывороточный альбумин (67,0 кДа); овальбумин (43,0 кДа); карбоангидраза (30,0 кДа); соевый ингибитор трипсина (20,1 кДа); α-лактальбумин (14,4 кДа). Для детектирования белков на пластинах полиакриламидного геля, использовали краситель Coomassie Brillian Blue R- 250. Денситометрические параметры полученных элекрофореграмм получали с помощью программы OneDScan (v.1.3, "Scanalytics", США).

117

Подготовка образцов для исследования полипептидного состава. Экс-

периментальный жидкий препарат ГП фильтровали через ячейки Minisart-plus

0,45 мкм (Sterile, CA-membrane, GF-prefilter) производства фирмы "Sartorius Stedim Biotech" (Германия). Сухой ГП (ОАО "МЗСФ) разводили дистиллированной водой из расчета 1 гр/50 мл, перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре и фильтровали с использованием Minisart-plus и обессоливали.

Для обессоливания использовали мини-колонки HiTrap Desulting Column (5 ml), производства "GE Healthcare" (Швеция). Процедуру обессоливания проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Обессоленные образцы концентрировали. Перед концентрированием в обессоленных образцах определяли оптическую плотность при длине волны 280 нм (D280).

Для концентрирования использовали ячейки для ультрафильтрации Vivapore 5ml Concentrator ("VIVA Science", США) с отсечкой по молекулярной массе - 7,5 kD. Ячейку заполняли раствором обессоленного МФП с известным значением D280 и концентрировали в течение 2-8 часов при температуре 8-100 С, до значений D280 = 8-10 единиц оптической плотности.

Сконцентрированные препаратов МФП смешивали 1:1 с буфером для образца (0,125 М TRIS-HCl, 4% додецилсульфат Na, 20% (объем/объем) глицерол, 0,2 М дитиотреитол, 0,02% бромфеноловый синий, рН=6,8), выдерживали на кипящей водяной бане в течение 120 секунд и охлаждали до комнатной температуры. Подготовленные образцы исследовали в течение дня или хранили в замороженном состоянии (-200С) не более 1 недели.

Подготовка образцов для исследования протеолитической специфич-

ности. Контрольный препарат – порошок говяжьего пепсина ("ОАО МЗСФ") готовили следующим образом. Готовили 1% раствор ферментного препарата в 0,04 М Na-ацетатном буфере (рН=5,6). МА полученного раствора составляла ~1000 УЕ/мл. По этому значению МА (~1000 УЕ/мл) нормировали экспериментальный жидкий препарат ГП. Перед исследованием растворы ферментов прогревали на водяной бане при 350С в течение 15 минут.

В качестве субстрата использовали 1% раствор казеина по Гаммерстену. Для подготовки раствора субстрата в мерную, 100-мл колбу вносили 1,0 гр. казеина и 3,8 гр. Na3PO4 х 12 H2O, добавляли 80 мл дистиллированной воды и перемешивали при комнатной температуре до полного растворения казеина. Полученный раствор титровали 1,0 М HCl до рН=5,6 и доводили объем до 100 мл.

Подготовка образцов фермент-субстратной смеси (ФСС). В пробирки отмеряли по 5,0 мл субстрата (1% раствора казеина по Гаммерстену) и инкубировали 15 минут в водяном термостате при 350С. Затем в пробирки вносили по 0,1 мл исследуемого ферментного препарата, тщательно перемешивали и отмечали время начала инкубации при 350С.

Отбирали аликвоты сразу после смешивания компонентов ФСС (0 минут) и через 180 минут инкубации. Аликвоты смешивали 1:1 с буфером для образца, быстро перемешивали, выдерживали на кипящей водяной бане в течение 120 секунд и охлаждали до комнатной температуры. Подготовленные таким обра-

118

зом образцы исследовали в течение дня или хранили в замороженном состоянии (-200С) не более 1 недели.

Подготовка образцов казеина по Гаммерстену. Аликвоты 1% раствора казеина по Гаммерстену разводили 1:1 буфером для образца, перемешивали, выдерживали на кипящей водяной бане в течение 120 секунд и охлаждали до комнатной температуры. Подготовленные образцы исследовали в течение дня или хранили в замороженном состоянии (-200С) не более 1 недели

Математическую обработку первичных экспериментальных данных и построение диаграмм проводили с использованием табличного редактора Microsoft Excell®.

Результаты и обсуждение.

Исследование полипептидного состава. Результаты исследования полипептидного состава и протеолитической специфичности препаратов ГП производства ОАО МЗСФ (ГП-МЗСФ) и опытного образца ГП (ГП-СибНИИС) методом ЭФ-ДСН представлены на Рисунках 1 и 2.

									Рисунок 1. – Результаты исследо-
									вания полипептидного состава и
								94,0	протеолитической специфичности
								67,0	препаратов ГП методом ЭФ-ДСН.
									Препарат ГП-СибНИИС – свеже-
								43,0	приготовленный.
									Обозначения треков:
								30,0	1	- 180 минут инкубации ГП-МЗСФ
									2	- 0 минут инкубации ГП-МЗСФ
								20,1	3	- казеин по Гаммерстену
									4	- 0 минут инкубации ГП-
									СибНИИС
								14,4	5	-180 минут инкубации ГП-
								ММ	СибНИИС
								(кДа)	6	- маркеры молекулярной массы
									7	– ГП-МЗСФ
1	2	3	4	5	6	7	8
									8	– ГП-СибНИИС

Справа указаны значения молекулярных масс маркеров.

Контрольный (ГП-МЗСФ) и опытный (ГП-СибНИИС) препараты (Рисунок 1, треки №№ 7-8) имеют близкий качественный состав. В каждом препарате присутствуют: один основной компонент с ММ ~17 кДа (маркерный полипептид, обнаруживается во всех коммерческих препаратах натурального говяжьего пепсина), по 4 минорных компонента с ММ в диапазоне 33-42 кДа и 4-5 низкомолекулярных компонентов с ММ в диапазоне 14-9 кДа.

Количественный состав контрольного и опытного препаратов имеют отличия: относительное содержание основных компонентов (ММ 17 кДа), различается в 1,71 раза (ГП-МЗСФ – 42,0%, ГПСибНИИС – 71,7%.

119

		Рисунок 2. – Результаты исследова-
		ния полипептидного состава и про-
	94,0	теолитической специфичности пре-
	67,0	паратов ГП методом ЭФ-ДСН. Пре-
	43,0	парат ГП-СибНИИС – хранился 7
		месяцев при температуре 5-10		0	С.
	30,0	Обозначения треков:
		1	– ГП-МЗСФ
		2	– ГП-СибНИИС
	20,1	3	– 180 минут инкубации ГП-МЗСФ
		4	– 0 минут инкубации ГП-МЗСФ
	14,4	5	– казеин по Гаммерстену
		6	– маркеры молекулярной массы

ММ7 – 180 минут инкубации ГП-

								(кДа)	СибНИИС
									8 – 0 минут инкубации ГП-
1	2	3	4	5	6	7	8

СибНИИС Справа указаны значения молеку-

лярных масс маркеров.

Количественно отличается и содержание полипептидных компонентов с ММ<14 кДа. Предположительно, низкомолекулярные примеси обоих препаратов, являются белками тканей желудков КРС, использованных в качестве сырья, а также продуктами их частичного протеолиза пепсинами, образующимися в процессе экстракции, активации и формулирования молокосвертывающих препаратов. Суммарное относительное содержание этих компонентов в ГПМЗСФ и ГП-СибНИИС составляет, соответственно, 48,4% и 23,6%.

Высокое содержание балластных белковых примесей в препаратах ГПМЗСФ и ГП-СибНИИС обусловлено тем, что для их получения используются методы грубой очистки - одностадийного высаливания и макрофильтрация. Получение МФП, имеющих более гомогенный полипептидный состав, предполагает использование, более совершенных биотехнологических схем и высокоселективных методов очистки белков, что неизбежно ведет к удорожанию продукта. Однако высокая степень очистки МФ необходима лишь в том случае, когда балластные примеси проявляют нежелательную ферментативную активность, негативно влияющую на качество сыра. Если балластные белки коагуляционно неактивны и не проявляют негативной с точки зрения сыроделия, ферментативной - прежде всего протеолитической и липолитической - активности, то их присутствие в МФП вполне допустимо. Различия в количественном и качественном составе препаратов ГП-МЗСФ и ГП-СибНИИС объясняются, вероятно, различиями в технологии производства.

В процессе длительного хранения препарата ГП-СибНИИС (Рисунок 2, треки №№ 1-2), его полипептидный состав претерпевает незначительные количественные и качественные изменения. Относительное содержание полипептидов с ММ в диапазоне 33-42 кДа уменьшается в 3,29 раза (с 4,6% до 1,4%). Меняется и качественный состав этих фракций – с 4 компонентов в исходном препарате до 2-х в препарате, хранившемся в течение 7 месяцев.

120