Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Самостійна робота 3.docx
Скачиваний:
37
Добавлен:
12.06.2018
Размер:
24.79 Кб
Скачать

Самостійна робота №3

1. Начало формы Конец формы

1.Трансгенні організми— різні організми, які мають у складі свого геному чужорідні гени інших організмів та які отримують за допомогою методів генної інженерії. У цей час генна технологія швидко розвивається. У різних сферах господарської діяльності людини використовують трансгенні бактерії — як для клонування генів і виробництва білка, так і реконструювання (напр. для оздоровлення рослин). Бактерії, що живуть у рослинах і стимулюють утворення кришталиків льоду, були змінені з холод-плюс на холод-мінус рослини. Такі бактерії почали захищати вегетативні частини рослин від морозу. У бактерії, що утворюють симбіоз з коренями кукурудзи, були введені гени від інших бактерій, які кодують токсин для шкідливих комах. У природі існують бактерії, що можуть розщепити будь-яку органічну речовину. Бактерії відбирають за здатністю розщеплювати певну речовину, а згодом ця здатність підсилюється внаслідок біотехнології. Таким шляхом були створені бактерії, які поїдають нафту, що розлилася внаслідок техногенних катастроф. Бактерії використовують для бактеріального синтезу, напр. для виробництва амінокислоти фенілаланіну.

Широке використання рекомбінантних бактерій у сільському господарстві, промисловості, захисті навколишнього середовища обмежувалося побоюванням того, що такі бактерії можуть замінити природні мікроорганізми в екосистемах із виникненням несприятливих наслідків. Наразі розроблено методи визначення, вимірювання і навіть блокування активності цих клітин у навколишньому середовищі. Зручним об’єктом для генетичних маніпуляцій виявилися рослини, тому що їх клітини можна вирощувати в культурі, де з кожної клітини отримують цілу рослину.

Здійснюються роботи зі створення біоінженерних рослин, які могли б мати такі властивості: високу пристосованість до умов зовнішнього середовища; містити більшу кількість необхідних для людини поживних речовин; тривалий час зберігатися без псування. Розробляються Т.о., здатні продукувати в інтересах людини хімічні речовини та ЛЗ. Реконструйовано картоплю для продукції альбуміну людини. Передбачається, що в майбутньому рослини зможуть утворювати у своєму насінні такі білки, як гормони людини.

Швидкими темпами розвивається біоінженерія тварин. Яйцеклітину поміщають у спеціальну мішалку разом із чужорідною ДНК і дрібними силікон-карбідними голками. Голки роблять множинні отвори в оболонці, крізь які ДНК потрапляє в клітину. За допомогою цієї технології бичачий гормон росту був уведений у яйцеклітини багатьох видів тварин. Завдяки цій технології отримано великі риби, корови, свині, кролики, вівці. Трансгенні тварини створено для виробництва продуктів медичного значення. Ланцюговим інструментом для генетичних досліджень стали трансгенні мишіВони дають важливу інформацію при плануванні генної терапії у людини. Науковці, що вивчають м’язову дистрофію Дюшена, виділили ген і його продукт — нормальний білок дистрофін, який є відсутнім у хворих. Запропоновано спосіб забезпечення хворих дітей дистрофіном. Але що буде, якщо дистрофін потрапить в інші тканини, або його буде утворюватися занадто багато? Для вирішення цих питань виведено трансгенні миші, у м’язах яких міститься дистрофіну в 50 разів більше, а також відбувається продукція цього білка в інших тканинах. Дистрофін не викликає у таких мишей патологічних відхилень. Трансгенні миші виявилися вкрай необхідними при вивченні моногенних хвороб, злоякісних пухлин і навіть мультифакторіальних хвороб людини. Проте трансгенна технологія є неточною, тому що введення ДНК не спрямовано у певний локус хромосоми. Ген, що переноситься, може порушити функцію іншого гена або потрапити під контроль інших генів. Навіть якщо трансген вставляється в хромосому й експресується, його ефект може бути перекритий таким самим геном клітини-хазяїна. Тому розроблено технологію більш точного «націлювання» гена (gene targeting), за якої ген, що вводиться, займає місце свого двійника у хромосомі клітини-хазяїна. При цьому використовується природний процес гомологічної рекомбінації. Внаслідок такої технології заміняють інактивованим геном активний ген у мишей і простежують ефект його відсутності навіть у ембріона. Так вивчають функцію білків імунної системи, механізм взаємодії онкогенів у виникненні пухлини, розвиток генетичних захворювань. «Націлювання» гена — складна методологія, вона не спрацьовує у заплідненій яйцеклітині ссавців. Ген можна ввести тільки в клітини на ранніх етапах розвитку зародка, до його імплантації у стінку матки. Клітини такого зародка тотипотентні, і багато генів у них ще не експресовані. «Націлювання» гена має велике значення при створенні моделей генетичної патології у тварин. Важливо те, що вчені ідентифікують версію людського алеля, який викликає хворобу у тварин. Потім відповідний людський мутантний алель переносять в ембріональні стовбурові клітини і, нарешті, схрещують тварин, гомозиготних за інактивованим геном. Тварин з «виключеним» геном використовують у вивченні складних хвороб, в яких задіяно багато генів. Так, напр., вивчають атеросклероз шляхом інактивації сполучення генів, продукти яких контролюють ліпідний метаболізм.

Незважаючи на те, що перші трансгенні сільськогосподарські тварини були отримані в 1985 р введенням екзогенної ДНК в пронуклеус зигот, до теперішнього часу не розроблено ефективного методу, який би міг бути використаний для створення генетично модифікованих тварин незалежно від виду і від цілей експерименту.

Розробка нових ефективних методів переносу генів в ембріональні і соматичні клітини тварин, а також вдосконалення існуючих підходів залишається актуальним завданням.

Серед великої різноманітності способів впровадження екзогенної ДНК в геном тварини можна виділити наступні, які знайшли широке застосування в практиці трансгенозу:

- метод мікроін`єкції,

- опосередкований ретровирусами перенесення генів,

- використання модіфіцірованньгх ембріональних стовбурових клітин,

- перенос трансформованих ядер генеративних і соматичних клітин,

- використання сперміїв і сперматогонієв як переносників ДНК.

Серед інших способів доставки екзогенної ДНК в організм тварин можна відзначити використання ліпосом, аденовірусних векторів, а також метод високошвидкісний ін`єкції. Однак ці методи не знайшли широкого застосування внаслідок їх недостатньої стабільності, а також відсутності інтеграції трансгени в геном.

Мікроін`єкції рекомбінантної ДНК в запліднені ооцити багатоклітинних тварин поки залишаються найбільш популярним способом введення чужих генів в організм тварин. Незважаючи на те, що метод вимагає високої кваліфікації і дорогого устаткування, простота і надійність окупають всі його недоліки. Першою і найбільш добре розробленої експериментальної системою для отримання трансгенних тварин з`явилася миша. Донорних самок мишей з експериментальної суперовуляція схрещують з самцями-виробниками, через 12 год виділяють запліднені яйцеклітини і поміщають їх в культуру. Далі в більший їх двох пронуклеусов (зазвичай чоловічий) ін`єктують рекомбинантную ДНК. Ті, що пережили ін`єкцію яйцеклітини пересаджують самкам-реципієнтам. Тільки частина трансплантованих ооцитів продовжує розвиватися до народження дитинчат.

На частоту інтеграції екзогенної ДНК при використанні методу мікроін`єкції впливають такі фактори, як чистота вводиться зразка, форма і концентрація ДНК, склад буферного розчину для мікроін`єкції, якість ембріонів, а також спосіб пересадки ембріонів реципієнтам (не хірургічний, хірургічний, лапароскопічний).

Трансгенних тварин в потомстві ідентифікують різними методами, найчастіше ПЛР, і схрещують для отримання трансгенних ліній. Деякі з трансгенних тварин виявляються мозаїчними (статеві клітини не містять екзогенної ДНК), тому при схрещуванні трансгенним виявляється менша частина потомства першого покоління, ніж розрахункові 50%.

У ряді випадків гомозиготні лінії отримати не вдається, оскільки 5-15% трансгенних инсерций в гомозиготному стані летальні, так як инсерция іноді порушує життєво-важливі частини геному.

Точний механізм, що забезпечує інтеграцію ін`єктувати ДНК в хромосоми клітки-мішені, невідомий, однак аналіз структури вбудованої ДНК дозволяє виявити деякі моменти. Інтеграція відбувається випадковим чином в один хромосомний локус, який може містити від одного до декількох тисяч тандемних копій інтегрованої ДНК.

Близько 30% отриманих первинних трансгенних тварин, як правило, виявляють ту чи іншу ступінь мозаїчності, що може бути наслідком інтеграції екзогенної ДНК після завершення першого циклу реплікації. Ступінь інтеграції екзогенної ДНК в геном, тобто число трансгенних тварин від загальної кількості народжених тварин, при використанні методу мікроін`єкції в залежності від виду тварин коливається в незначних межах 5-15%.

Найбільш важливим з урахуванням витрат, потрібних для отримання одного трансгенної тварини, є показник загальної ефективності трансгенозу, який розраховується як відношення числа отриманих трансгенних тварин до загальної кількості пересаджених ембріонів, виражене у відсотках. Величина цього показника для ссавців також відносно постійна і становить в середньому від ~ 0,5% у свиней і корів до ~ 2% у мишей.

Ретровірусних вектори також використовуються для отримання трансгенних тварин. Інфікування пре- імплантаційних ембріонів рекомбінантними ретровирусами - відносно нескладна ефективна процедура. Восьмиклітинну морулу звільняють від яєчної оболонки і поміщають в культуральну чашку з фібробластами, що продукують рекомбінантний ретровірус. Інфіковані ембріони, які досягли стадії бластули, імплантують псевдобеременностью самкам.

В результаті формуються трансгенні організми, мозаїчні за кількістю і локалізації встроек рекомбінантної ДНК в геном. Тому для отримання чистих ліній далі необхідний масштабний аутбридинг. Недоліком методу є обмеження вставки екзогенної ДНК ~ 8 тнп, внаслідок чого трансгени може виявитися позбавленим прилеглих регуляторних послідовностей, необхідних для його експресії, а в деяких випадках інтеграція в вихідний локус нестабільна.

Сучасні методи перенесення нових генів можна розділити на дві групи. До першої групи відносять методи введення генів за допомогою природних векторів (на основі Ті-, Ri-плазмід, вірусів і віроїдів), а до другої – прямі методи введення чужорідної ДНК у геном вищих рослин (пряма трансформація ізольованих протопластів, мікроін’єкції, електропорація, упакування в ліпосоми, біолістика та інші) (Рис. 10).

Серед методів першої групи найчастіше використовують відносно простий і зручний метод “листових дисків”. Суть методу полягає в тому, що із листків рослини нарізають смужки або диски. Їх заражають агробактеріями і сумісно культивують на твердому або рідкому середовищах. Спочатку агробактерія потрапляє до місця пошкодження і приєднується до клітини. Контакт з пошкодженою рослиною “включає” гени vir- і Т-області. Індуктором цих процесів є ацетосирингон пошкоджених частин рослини. Через 4-5 годин починається перенесення Т-ДНК Ті-плазміди в клітину рослини, що закінчується через 8-9 годин від моменту попадання бактерії на поверхню рослини.

Потім диски відмивають від бактерій рідким живильним середовищем з антибіотиком – для елімінації бактерій, трохи підсушують фільтрувальним папером і поміщають на живильні середовища для регенерації, які містять селективний агент для відбору трансгенних регенерантів. Цей метод з незначними модифікаціями з успіхом застосований для генетичної трансформації самих різних видів класу дводольних.

«Пряме перенесення генів» має ряд переваг:

по-перше, зникає потреба вводити рекомбінантну ДНК до складу плазмідної ДНК;

по-друге, прямий метод перенесення генів ефективний для клітин однодольних.