Лабораторные работы / !Лабораторная работа №2 ТМД

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2 ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БИОПРОБ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА

СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ

1. ИСХОДНЫЕ ДАННЫЕ К ВЫПОЛНЕНИЮ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

1.1. Цель работы

Освоить метод спектрофотомерии в режиме прохождения света, ознакомиться с оборудованием для проведения исследований. Исследовать оптические свойства биопроб на основе полученных спектров. Определить концентрацию вещества в растворе с помощью метода спектрофотометрии.

1.2. Используемое оборудование

1.Оптоволоконный спектрометр Ocean Optics USB 4000.

2.Дейтериево-вольфрамовый источник света (200-2000 нм) DT-MINI-2-GS

3.Оптоволоконные кабели (2 шт)

4.Коллиматоры (2 шт.)

5.Штатив для кювет с биопробой.

6. Кюветы с различной концентрацией перманганата калия KMnO4 в воде. 7. Программа управления спектрометром SpectraSuite.

1.3. Программа работы

1. Ознакомиться с теоретическими основами измерения параметров биопроб, законом Бугера-Ламберта-Бера.

2. Ознакомиться со структурной схемой спектрометра Ocean Optics USB 4000, основными его частями и принципом управления.

4.Откалибровать спектрометр.

5.Измерить спектры пропускания биопроб.

6.Проанализировать полученные спектры. Определить концентрацию вещества в каждом образце.

7.Составить отчет по работе.

1.4. Содержание отчета

1.Название работы.

2.Цель работы.

3.Приборы и материалы.

4.Программа работы.

5.Блок-схема установки на базе спектрометра.

7.Принцип работы спектрометра.

8.Полученные спектры пропускания и поглощения образцов. Анализ данных

спектров.

9.Расчет концентрации перманганата калия в воде для каждой из образцов пробы. 10. Вывод по работе.

2.КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ

2.1.Оптические методы определения параметров биопроб.

Воснове большинства оптических методов исследования лежит взаимодействие падающего света с исследуемой биологической средой, в результате которого изменяются параметры светового потока.

Свет представляет собой электромагнитные волны. Электромагнитный спектр излучения с длинами волн от 1·10-11 до 3·10-10 см условно разбит на отдельные области. Излучения так называемой оптической области спектра простираются от ультрафиолетовой области (УФ) радиации ~1,0 нм) до инфракрасных излучений (ИК) с длиной волны до 1 мм:

Границы диапазонов весьма условные.

Спектральный диапазон современных фотометрических приборов, работающих медицинских лабораториях, как правило, ограничивается диапазоном видимого света, ближнего ультрафиолетового и ближнего инфракрасного диапазона.

Границы диапазонов весьма условные.

Спектральный диапазон современных фотометрических приборов, работающих медицинских лабораториях, как правило, ограничивается диапазоном видимого света, ближнего ультрафиолетового и ближнего инфракрасного диапазона.

Классификация фотометрических методов 1. Классификация по спектральным характеристикам оптического излучения:

а) Фотометрические – методы, применяющие для исследования световой поток с широким диапазоном длин волн.

б) Спектрофотометрические – методы, использующие световой поток с узким диапазоном длин волн Δλ < 10 нм).

2. Классификация по виду взаимодействия вещества с излучением:

а) Абсорбционная фотометрия – методы изучающие поглощение светового потока при его прохождении через биообъект.

б) Нефелометрия – методы изучающие рассеивание света в объекте.

в) Турбидиметрия – метод анализа мутных сред, основанный на измерении интенсивности света прошедшего через исследуемый объект.

г) Рефлектометрия – метод анализа основанный на измерении интенсивности света отраженного от исследуемого объекта.

д) Эмиссионная фотометрия – методы, изучающие излучение света веществом.

е) Люминисцентная фотометрия – методы, изучающие собственное свечение вещества при его возбуждении различными способами.

3. Классификация методов по объектам исследования:

а) Методы исследования биопробы и жидкости (аналитические) б) Методы, предназначенные для исследования организма.

Фотометрические методы исследования базируются на способности жидких сред (растворов) или тканей поглощать и/или рассеивать, отражать электромагнитное излучение и даже излучать электромагнитные волны под действием световой энергии или в результате химической реакции.

На рис. 1 показано изменение интенсивности потока световой энергии при прохождении света через раствор (а) и дисперсную среду (б) с толщиной поглощающего слоя L, где:

I0 – интенсивность падающего потока световой энергии;

Iот – интенсивность потока световой энергии, отраженной от стенки кюветы;

Iп – интенсивность потока световой энергии, поглощенной окрашенным раствором; Iр – интенсивность потока световой энергии, рассеянного дисперсной средой;

I – интенсивность потока световой энергии, прошедшего через слой исследуемого вещества.

а б Рисунок 1. Явления, возникающие при прохождении а) через прозрачный раствор, б) через дисперсную среду (пояснения в тексте).

Если не учитывать поглощение потока световой энергии стенками кюветы, то интенсивность падающего светового потока I0 при прохождении кюветы с раствором и дисперсной средой разлагается на составляющие следующим образом:

I0 =Iот + Iп + I – для раствора,

I0 =Iот + Iп + Iр + I – для дисперсной среды.

Вфотометрии Iот, как правило, компенсируется или учитывается. Рассмотрим подробнее наиболее часто используемые методы. Метод абсорбционной фотометрии

Воснову абсорбционного метода анализа положен обобщенный закон Бугера – Ламберта – Бера.

Ниже рассматриваются явления пропускания и поглощения световой энергии. Пропускание (Т) – это отношение интенсивности потока световой энергии I,

прошедшего через слой исследуемого вещества (рис. 2), к интенсивности падающего потока световой энергии I0:

Т=I / I0.

Рисунок 2. Прохождение светового потока через кювету с раствором

Поглощение или оптическая плотность (D) – это величина, равная

D = lg(l/T) = lg(I0/I)

Согласно закону Бугера – Ламберта – Бера при облучении раствора монохроматическим излучением с длиной волны λ, поглощение излучения Dλ пропорционально концентрации поглощающего вещества в растворе С (моль/г) и толщине поглощающего слоя L:

Dλ =aλ CL,

где aλ – коэффициент поглощения, являющийся константой и характеризующий поглощающие свойства вещества при данной длине волны λ.

Если концентрация раствора С выражена в молях на литр, то коэффициент поглощения аλ принято называть молярным коэффициентом поглощения и обозначать его как. ελ. Закон Бугера – Ламберта – Бера можно записать в других формах:

lg (I0/I) = ελ L,

или

I = I0 еxp(-ελL).

Важнейшим свойством при использовании абсорбционных измерителей является аддитивность величины Dλ, которая позволяет при исследовании растворов, представляющих смесь «n» химически не реагирующих между собой веществ, записать:

где Ii – интенсивность светового потока, прошедшего через раствор i-го компонента смеси, Dλi - величина оптической плотности i-го компонента раствора.

Величина пропускания Т обычно измеряется в процентах и меняется в диапазоне от 0 до 100%. Оптическая плотность D – оценивается в Беллах.

Чувствительность и погрешность фотометрического анализа во многом зависят от правильного (оптимального) выбора длины волны, на которой производятся измерения, от спектра поглощения исследуемого вещества в растворе, спектра поглощения применяемых реактивов и спектра поглощения стандартных калибровочных растворов.

3. ОПИСАНИЕ УСТАНОВКИ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

Для проведения лабораторной работы используется установка на базе оптоволоконного спектрометра Ocean Optics USB4000 (рис. 1). Установка включает в себя источник света Ocean Optics DT-MINI-2GS (рис.2) соединенный со спектрометром с помощью оптоволоконных проводов (рис. 3) с использованием штатива для биопроб.

Источник света DT-NINI-2GS излучает электромагнитные волны в УФ, видимом, ИК областях спектра, которые попадают в 1-й оптоволоконный провод, к концу которого присоединен коллиматор (рис. 4).

Рисунок 4 – Вид собранной установки (а) для исследования оптических свойств биопроб и принцип функционирования оптоволоконного спектрометра Ocean Optics USB4000 (б).

Коллиматор позволяет равномерно осветить кювету с биопробой, после чего свет ослабляется биопробой и попадает во второй коллиматор, который фокусирует световой пучок на торец второго волновода. Затем свет из второго волоконно-оптического кабеля попадает в спектрометр через разъем SMA 905.

На рисунке 5 показано прохождения света в спектрометре через ассиметричную скрещенную схему Черни-Тернера, не имеющую подвижных частей, которые могут подвергаться износу или ломаться.

Разъем SMA 905 (1) обеспечивает точное позиционирование конца оптического волокна, а также является держателем входной щели (2) поглощающего фильтра (3). Далее свет попадает на коллимирующее зеркало (4) и отражаясь от него попадает в виде параллельного пучка на дифракционную решетку (5). Дифракционная решетка разлагает свет на спектр, который попадает на фокусирующее зеркало (6), которое фокусирует спектры первого порядка в плоскости детектора. Цилиндрические собирающие линзы (7) установлены на детекторе фокусируют свет на более короткие элементы детектора, что позволяет повысить эффективность собирания света. В качестве детектора применяется линейная ПЗС матрица, состоящая из 3648 элементов. Конфигурация спектрометра настроена на измерение спектра в диапазоне 350850 нм.

Рисунок 5. Схематическое изображение внутренних элементов спектрометра USB4000

Программа SpectraSuite (рис. 6), установленная на персональный компьютер позволяет управлять работой спектрометра.

Рисунок 6. Интерфейс программы SpectraSuite c отображенным спектром.

4. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ВЫПОЛНЕНИЮ РАБОТЫ

4.1. Подготовка установки к работе

1.Ознакомится с инструкцией к спектрометру.

2.Собрать установку в соответствие с рисунком 4. Для этого необходимо подсоединить первый волновод одним концом к источнику света, а второй конец к коллиматору. Второй волновод также одним концом подсоединить к коллиматору, а другим концом к спектрометру. После этого подсоединить спектрометр через USB провод

ккомпьютеру, запустить программу управления спектрометром и включить дейтериевую и галогенную лампы источника света.

4.2.Калибровка спектрометра

Откалибровать спектрометр. Для этого необходимо задать спектрометру максимально темное и светлое состояния. Выполнение данной процедуры позволит перейти в режим работы спектрометра на пропускание.

4.3. Проведение измерений и анализ полученных данных

1. Получить спектры в режиме измерения интенсивности в относительных единицах (режим Scope).

2. Экспортировать данные в файл в формате ASCII.

3. Получить спектры в режиме пропускания (режим Transmittance). 4. Получить спектры в режиме поглощения (режим Absorbance).

5. Провести измерения спектров в соответствии с п. 1,2,3 для проб №1-5. 6. Измерить размеры кюветы (Параметр L).

7. Охарактеризовать полученные спектры.

8. Определить концентрацию KMnO4 в воде используя измеренные значения интенсивности света (режим Scope) или пропускания (режим Transmittance) на длине волны 546 нм (коэффициент молярного поглощения раствора перманганата калия aλ = 2420 дм3∙моль-1∙см-1 при λ = 546 нм). В режиме Transmittance значения пропускания (t) отображаются в %, где t=T∙100%.

5.ВОПРОСЫ К ЗАЩИТЕ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

1.Какие диапазоны длин волн применяются для определения концентрации веществ в лабораторной диагностике?

2.Запишите закон Бугера-Ламберта-Бера.

3.Как определить концентрацию искомого вещества в биопробе?

4.Какой тип спектрометра используется в лабораторной работе?

5.Какой элемент в установке позволяет равномерно осветить биопробу?

6.Дайте определение нефелометрии.

7.Дайте определение эмиссионной фотометрии.

8.Дайте определение турбидиметрии.

9.Чем отличается фотометрический метод от спектрофотометрического?

10.В чем заключается цель проведения данной лабораторной работы?

11.В каком диапазоне длин волн работает используемый в работе спектрометр?

12.Какие длины волн излучает источник света?

13.В чем отличие полученных спектров для различных проб?

14.Через какие элементы (в какой последовательности) проходит свет в данной установке?

6.ЛИТЕРАТУРА

1.Ю. А. Ершов. Основы анализа биотехнических систем. Теоретические основы БТС: учебное пособие. Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2011. – 526 c.

2.В.Г. Гусев Получение информации о параметрах и характеристиках организма и физические методы воздействия на него: учебное пособие – М: Машиностроение,

2004. – 597 с.

3.http://oceanoptics.com/product/usb4000-vis-nir/