Лабораторные работы / !Лабораторная работа №3 ТМД

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3 ИЗМЕРЕНИЕ ТОЛЩИНЫ ВОЗДУШНОГО ЗАЗОРА В СЧЕТНОЙ КАМЕРЕ С

ПОМОЩЬЮ МЕТОДА СПЕКТРОСКОПИИ

1. ИСХОДНЫЕ ДАННЫЕ К ВЫПОЛНЕНИЮ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

1.1. Цель работы

Освоить метод спектроскопии в режиме отражения света, ознакомиться с оборудованием для проведения исследований. Измерение спектров наблюдаемой интерференционной картины. Определение толщины зазора между двумя стеклянными пластинами.

1.2. Используемое оборудование

1.Оптоволоконный спектрометр Ocean Optics USB 4000.

2.Дейтериево-вольфрамовый источник света (200-2000 нм) DT-MINI-2-GS

3.Оптоволоконный пробник (1 шт)

4.Склеенные предметное и покровное стекла с воздушной прослойкой.

5. Программа управления спектрометром SpectraSuite.

1.3. Программа работы

1. Ознакомиться с теоретическими основами измерения параметров биопроб, законом Бугера-Ламберта-Бера.

2. Ознакомиться со структурной схемой спектрометра Ocean Optics USB 4000, работающим в режиме отражения, его основными частями и принципом управления.

4.Откалибровать спектрометр.

5.Измерить спектры интерференционных картин в различных областях зазора.

6.Проанализировать полученные спектры. Определить толщину воздушного

зазора.

7.Составить отчет по работе.

1.4. Содержание отчета

1.Название работы.

2.Цель работы.

3.Приборы и материалы.

4.Программа работы.

5.Блок-схема установки на базе спектрометра.

7.Принцип работы спектрометра.

8.Полученные спектры интерференционных картин. Анализ данных спектров.

9.Расчет толщины воздушного зазора. 10. Вывод по работе.

2.КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ

2.1.Камера для подсчёта клеток в биологических образцах.

Счетные камеры — приборы для подсчета форменных элементов крови, мочи и цереброспинальной жидкости, а также микроорганизмов. Камеры предложены французским физиологом Малассе (L. Ch. Malassez) в 1874 г.

Камеры представляют собой толстое предметное стекло с углублением, на дне которого выгравирована счетная сетка; над углублением накладывают шлифованное покровное стекло. Постоянная высота камеры обеспечивается плотным притиранием покровного и предметного стекол до образования радужных ньютоновых колец (полосы интерференции).

Структурными элементами всех типов сеток являются большие и малые квадраты. Сетки различных типов - Тома, Бюркера, Предтеченского, Тюрка, Нейбауэра, Горяева, Фукса-Розенталя и др.- отличаются различным группированием больших и малых квадратов.

Известные величинывысота камеры, площадь сетки и ее делений и разведение взятой для исследования кровипозволяют высчитать количество форменных элементов в определенном объеме (1 мкл) крови (или другой среды).

Различают открытые и закрытые камеры. В закрытой камере покровное стекло притирают после ее заполнения, и при этом в нее могут попасть пузырьки воздуха. Такие камеры. (Тома — Цейсса с сеткой Тома, Дунгера с особой сеткой) неудобны в работе и не используются.

Рисунок 1. Схема открытой счетной камеры для подсчета кровяных клеток (а — общий вид; б — вид сбоку): 1 — пластинки с выгравированными сетками; 2 — продольные желобки; средняя часть пластинки ниже боковых на 0,1 мм (глубина камеры) и разделена поперечным желобком (3); 4 — покровное стекло.

Открытые камеры (рис. 1) заполняются после притирания покровного стекла. Они имеют две сетки на одном предметном стекле. Пластинки с выгравированными сетками отграничены желобками одна от другой, а также от остальной части предметного стекла. Наличие желобков дает возможность регулировать заполнение камер. Некоторые камеры снабжены металлическими зажимами, фиксирующими покровное стекло.

Рисунок 2. Схема сетки Горяева: 1 — большие пустые квадраты (всего 100); 2 — большие квадраты, разделенные на малые (по 16); 3 — большие квадраты, разделенные полосами.

Открытые камеры впервые описал С. П. Алферов в 1883 г., затем в 1905 г. Бюркер (К. Burker). Известны открытые счетные камеры Ключарева, Гауссера и Леви, Гельбера, Глауберманна. В России широко применяются счетные камеры Горяева и Фукса — Розенталя. Камера Горяева с сеткой Горяева (рис. 2) имеет объем 0,9 мкл, площадь сетки 9 мм2. Сетка состоит из 225 больших квадратов; из них 100 — пустые, 25 — разделены каждый на 16 малых квадратов, 100 — разделены полосами.

Рисунок 3. Схема сетки Фукса — Розенталя.

Счетная камера Фукса — Розенталя с сеткой Фукса — Розенталя (рис. 3) имеет объем 3,2 мкл, площадь сетки 16 мм2, она состоит из 256 больших квадратов (квадраты, разделенные полосами, не считают).

Перед работой предметное стекло камеры и шлифованное покровное стекло моют под струей водопроводной воды и насухо вытирают. Затем плотно притирают покровное стекло к камере до появления радужных интерференционных ньютоновых колец (при этом условии объем камеры постоянен).

Рис. 4. Схема квадрата сетки с подлежащими (черные кружочки) и не подлежащими счету (белые кружочки) клетками.

Содержимое пробирки перед заполнением камеры несколько раз перемешивают, затем оплавленным концом стеклянной палочки отбирают из пробирки, наклоняя ее, каплю крови и наносят на предметное стекло у самого края покровного стекла. Если одной капли крови недостаточно для полного заполнения камеры, добавляют еще каплю. Если кровь взята в смеситель, то первые капли из капилляра смесителя выпускают, а камеру заполняют каплей из ампулы смесителя. Остатки жидкости с предметного стекла удаляют марлевым тампоном. Подсчет начинают через 3 мин. после заполнения камеры (за это время происходит оседание форменных элементов крови) под микроскопом при малом увеличении (объектив X 8, окуляр X 10 или X 15) и затемненном поле зрения (с прикрытой диафрагмой или при несколько опущенном конденсоре). Счету подлежат клетки, лежащие внутри квадрата (рис. 4). Клетки, пересеченные сторонами квадратов, считают следующим образом: если более половины клетки находится внутри квадрата, то ее считают, если вне — ее не считают. Клетки, пересекаемые линиями точно посередине, считают на двух смежных, правой и верхней, линиях квадратов и не считают на двух других. При использовании соответствующих разводящих растворов эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, эозинофилы, базофилы и ретикулоциты могут быть подсчитаны в камере Горяева.

Эритроциты считают в 80 малых квадратах, т. е. в 5 больших квадратах, расположенных по диагонали. Расчет проводится по формуле:

X = a*4000*200/80,

где а — количество эритроцитов, подсчитанное в 80 малых квадратах, 80 — количество сосчитанных малых квадратов, 200 — степень разведения крови, 4000 — множитель для получения содержания эритроцитов в 1 мкл крови (объем малого квадрата 1/4000 мкл). Практически количество эритроцитов, подсчитанное в 5 больших квадратах, умножают на 10 000.

Лейкоциты подсчитывают в 1600 малых квадратах (в 100 больших квадратах). Расчет проводится по формуле:

X = a * 4000 * 20 /1600,

где а — количество лейкоцитов, подсчитанное в 1600 малых квадратах, 1600 — количество сосчитанных малых квадратов, 20 — степень разведения крови, 4000 — множитель для получения содержания лейкоцитов в 1 мкл крови. Практически количество лейкоцитов, подсчитанное в 1600 малых квадратах, умножают на 50.

Тромбоциты подсчитывают в 400 малых квадратах (25 больших квадратах по диагонали сетки). Реактивами для разведения могут быть изотонический р-р хлорида натрия, различные р-ры, консервирующие тромбоциты и гемолизирующие эритроциты.

Считают тромбоциты под обычным микроскопом и с помощью фазовоконтрастного устройства для более четкого их выявления. После разведения пробирку с кровью оставляют на 25—30 мин. для гемолиза эритроцитов. Затем содержимое пробирки повторно перемешивают и заполняют камеру, которую помещают на 5 мин. во влажную камеру (напр., чашки Петри с влажной ватой) для оседания тромбоцитов. Расчет проводят по формуле:

X = a*4000*200/400,

где а — количество тромбоцитов, подсчитанное в 400 малых квадратах, 200 — степень разведения крови, 400 — число сосчитанных малых квадратов, 4000 — множитель для получения содержания тромбоцитов в 1 мкл крови. Практически количество тромбоцитов, подсчитанное в 400 малых квадратах, умножают на 2000.

Количество базофилов и эозинофилов подсчитывают в камере Горяева в 1600 малых квадратах, как и лейкоциты. Практически подсчитанное количество базофилов и эозинофилов умножают на 50.

Ретикулоциты подсчитывают в камере Горяева в 80 малых квадратах, как эритроциты. Практически подсчитанное количество ретикулоцитов умножают на 10 000.

При очень большом количестве клеток допускается подсчет половины сетки (с последующим умножением результата на 2). Расчет проводят по формуле:

X = a*11/3,2*10,

где а — количество клеток, подсчитанное в 256 квадратах, 11/10— степень разведения, 3,2— объем камеры в мкл. Практически при подсчете в камере Фукса — Розенталя число лейкоцитов делят на 3.

В камере Горяева клетки цереброспинальной жидкости считают не менее 3 раз (также всю площадь), каждый раз заполняя камеру заново, затем берут среднее арифметическое. Расчет проводят по формуле:

X = a*11/0,9*10,

где а — среднее арифметическое количество клеток, подсчитанное по всей сетке, 11/10 — степень разведения, 0,9 — объем камеры в мкл. Практически число подсчитанных лейкоцитов умножают на 1,2.

Количественное определение форменных элементов в моче проводит в камерах Фукса — Розенталя, Горяева: подсчет эритроцитов и лейкоцитов при среднем увеличении

микроскопа, подсчет цилиндров — при малом. Степень разведения мочи зависит от метода исследования.

Подсчет в камерах не вполне точен. Ошибка метода составляет от 10 до 20% в зависимости от количества подсчитываемых элементов. Качество наблюдаемой в микроскопе картинки зависит от распределения форменных элементов внутри камеры. Для этого необходимо получение монослоя форменных элементов в области шкалы в камере, что обеспечивается равномерным зазором между стеклами путем плотного прилегания покровного стекла к предметному стеклу камеры.

2.2 Прохождение света через стеклянные пластины, между которыми находится изотропная среда с известным показателем преломления.

Толщина воздушного зазора, образованного двумя стеклянными подложками с равномерным распределением по толщине, может быть определена с помощью измерения спектральной зависимости пропускания света через незаполненную камеру. При изменении длины волны монохроматического света происходит интерференция света в воздушном зазоре камеры. Спектральная зависимость пропускания камеры, полученная с помощью спектрометра, приведена на рис. 5. Используя спектральную зависимость пропускания камеры, величину воздушного зазора dT можно рассчитать по экстремумам, определив их порядковые номера и соответствующую им длину волны по формуле:

где k = 0, 1, 2, 3…– порядковый номер минимума (или максимума), λki –длина волны соответствующего минимуму (или максимуму). Расчет толщины может производиться как по минимумам, так и по максимумам кривой пропускания.

Рисунок 5 – Спектральная зависимость интерференции света в камере

3. ОПИСАНИЕ УСТАНОВКИ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

Для проведения лабораторной работы используется установка на базе оптоволоконного спектрометра Ocean Optics USB4000 (рис. 3а), собранная для режима измерения спектра отраженного от образца света. Установка включает в себя источник света Ocean Optics DT-MINI-2GS (рис. 3б) соединенный со спектрометром с помощью оптоволоконных оптоволоконного пробника (рис. 3в) .

Источник света DT-NINI-2GS излучает электромагнитные волны в УФ, видимом, ИК областях спектра, которые попадают в оптоволоконный кабель с 6-ю световодами, (рис. 4). Испускаемые пробником электромагнитные волны освещают кювету с образцом, после чего некоторые из них отражаются и снова попадают в пробник, где по центральному волокну распространяются к спектрометру по другому проводу, на конце которого находится разъем SMA 905.

Рисунок 4 – Вид собранной установки для исследования образцов в режиме отражения

На рисунке 5 показано прохождения света в спектрометре через ассиметричную скрещенную схему Черни-Тернера, не имеющую подвижных частей, которые могут подвергаться износу или ломаться.

Разъем SMA 905 (1) обеспечивает точное позиционирование конца оптического волокна, а также является держателем входной щели (2) поглощающего фильтра (3). Далее свет попадает на коллимирующее зеркало (4) и отражаясь от него попадает в виде параллельного пучка на дифракционную решетку (5). Дифракционная решетка разлагает свет на спектр, который попадает на фокусирующее зеркало (6), которое фокусирует спектры первого порядка в плоскости детектора. Цилиндрические собирающие линзы (7) установлены на детекторе фокусируют свет на более короткие элементы детектора, что позволяет повысить эффективность собирания света. В качестве детектора применяется линейная ПЗС матрица, состоящая из 3648 элементов. Конфигурация спектрометра настроена на измерение спектра в диапазоне 350850 нм.

Рисунок 5. Схематическое изображение внутренних элементов спектрометра USB4000

Программа SpectraSuite (рис. 6), установленная на персональный компьютер позволяет управлять работой спектрометра.

Рисунок 6. Интерфейс программы SpectraSuite c отображенным спектром.

4. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ВЫПОЛНЕНИЮ РАБОТЫ

4.1. Подготовка установки к работе

1.Ознакомится с инструкцией к спектрометру.

2.Собрать установку в соответствие с рисунком 4. Для этого необходимо подсоединить один волоконный провод с 6-ю волноводами к источнику света, а другой с 1-м волноводом к спектрометру. Пробник вставить в штатив.

4.2. Калибровка спектрометра

Откалибровать спектрометр. Для этого необходимо задать спектрометру максимально темное и светлое состояния. Светлое состояние задается путем регистрации спектра, отраженного от зеркала.

Выполнение данной процедуры позволит перейти в режим работы спектрометра на отражение (режим Reflectance).

4.3. Проведение измерений и анализ полученных данных

1. Получить спектры в режиме измерения отражения (режим Reflectance). 2. Экспортировать данные в файл в формате ASCII.

3. Провести измерения спектров в соответствии для образцов камер с №1-3. 4. Охарактеризовать полученные спектры.

5. Рассчитать толщину воздушного зазора в камерах.

5.ВОПРОСЫ К ЗАЩИТЕ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

1.Для каких целей применяются счетные камеры?

2.Чем отличаются различные виды камер?

3.Каким образом с использованием камеры определяют количество эритроцитов в объеме крови?

4.Какие параметры можно определить с помощью счетных камер?

5.В каком режиме работы собран спектрометр в данной лабораторной работе?

6.Через какие элементы (в какой последовательности) проходит свет в данной установке?

7.Для какой цели осуществляется калибровка спектрометра с заданием максимально темного и светлого состояний?

8.В чем заключается цель проведения данной лабораторной работы?

9.Запишите формулу для определения толщины воздушного зазора.

10.Какие длины волн излучает источник света?

11.В чем отличие полученных спектров для различных образцов камер?

12.Опишите устройство камеры.

6.ЛИТЕРАТУРА

1.Ю. А. Ершов. Основы анализа биотехнических систем. Теоретические основы БТС: учебное пособие. Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2011. – 526 c.

2.В.Г. Гусев Получение информации о параметрах и характеристиках организма и физические методы воздействия на него: учебное пособие – М: Машиностроение,

2004. – 597 с.

3.http://oceanoptics.com/product/usb4000-vis-nir/