Mikrobiologia_praktika
.pdfПрактический экзамен
1. Окраска по Бурри-Гинсу
Применяется для определения макрокапсулы. Техника:
•смешать каплю взвеси бактерий с каплей туши, сделать мазок, высушить и зафиксировать
•на мазок нанести водный раствор фуксина (на 1- 2 минуты)
•промыть водой, высушить и микроскопировать.
Бактерии окрашиваются в розовый цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно-розовом фоне.
2. Окраска по Цилю-Нильсену
Применяется для выявления кислотоустойчивых клеток (микобактерий) и обнаружения спор.
Техника:
•фиксировать мазок на пламени
•окрашивать карболфуксином, нагревая на пламени спиртовки в течение 5 мин (или 20 мин на водяной бане)
•промыть водой
•обесцветить в смеси спирт-кислота до сохранения слабо-розовой окраски
•промыть водой
•дополнительно окрашивать метиленовым синим (или метиленовым синим Лёффлера) в течение 10-30 с
•промыть водой и высушить на воздухе
При строгом соблюдении режима окраски кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые - синий. Кислотоустойчивость можно определять у клеток любого возраста.
3. Окраска по Нейссеру
Применяется для обнаружения воллютина в клетках
(Corynebacterium diphtheriae)
Техника:
•на фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2 - 3 минуты
•добавить раствор Люголя на 10 - 30 секунд
•промыть водой
•мазок докрасить водным раствором везувина или хризоидина в течение 30 - 60 секунд
•промыть водой, высушить, микроскопировать
Зерна волютина имеют щелочную реакцию, поэтому воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темносиний цвет. Цитоплазма, имея кислую реакцию, воспринимает везувин и окрашивается в желтый цвет.
4. Окраска по Граму
Применяется для определения состава клеточной стенки
Техника:
•на фиксированный мазок нанести раствор генцианвиолета на 1 - 2 минуты, краситель слить
•нанести раствор Люголя на 1 - 2 минуты
•нанести спирт на 30 - 60 секунд
•промыть водой
•докрасить раствором фуксина в течение 1-2 минут, промыть водой, высушить и микроскопировать
Гр+ бактерии – фиолетовые, Грбактерии – красные.
5. Определение подвижности
Пять методов:
•Окраска по Лёффлеру
•Окраска по Морозову
•Метод раздавленной и висячей капли
•Темнопольная микроскопия
•Укол в полужидкий агар
Окраска по Лёффлеру (щелочной метиленовый синий)
Для окраски жгутиков используют клетки, выращенные на скошенном агаре. Бактериальной петлей отбирают клетки, находящиеся у конденсационной воды и осторожно переносят в стерильную дистиллированную воду такой же температуры, что и температура инкубирования бактерий на скошенном агаре, а бактерии с петли не стряхивают, а осторожно погружают в воду. Пробирку с бактериями оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Используют химически чистое (вымытое в хромовой смеси) стекло, на которое наносят 2–3 капли суспензии. Суспензию распределяют по поверхности стекла, осторожно его наклоняя. Высушивают препарат на воздухе.
Жгутики очень тонкие, поэтому их можно обнаружить только при специальной обработке. Вначале при помощи протравки достигается разбухание и увеличение их размера, а затем производится окраска препарата, благодаря чему они становятся видимыми при световой микроскопии. Жгутики окрашиваются в ярко-красный цвет.
Виды жгутиков: 1 – монотрихии, 2 – амфитрихии, 3 – лофотрихии, 4 – перитрихии
Окраска по Морозову (серебрение)
1)обработка препарата кислотой, при этом оболочки и жгутики разрыхляются;
2)закрепление разрыхленных структур танином;
3)обработка азотнокислым серебром, оно окутывает каждый жгутик и саму клетку толстым слоем, давая различные оттенки от жёлтого до тёмно-коричневого.
Метод висячей капли
Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края.
Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40Х и исследуют препарат.
Метод раздавленной капли
На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х.
После микроскопии препараты «раздавленной» капли или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.